循环肿瘤DNA在临床应用中的研究进展_许婷

* 广东省生殖医 学实验室建设项目 （ 编号： 粤科财字〔2012 〕125 号） ，广东省人口计生委科研课题（ 编号： 20133064）
▲在读硕士研究生 △通信作者。E － mail： xiaogh66@ 163． com
理状态下，凋亡和坏死的细胞相对较少且细胞代谢缓慢。而 在肿瘤患者血浆中，cfDNA 释放增多，远超过核酸酶降解能 力以致不可避免地释放到血液循环中。近年来研究表明某 些临床状态可能会影响 cfDNA 的水平，如运动、终末期肾功 能衰竭、中风、心肌梗死、手术和创伤，结果提示 cfDNA 的水 平与细胞损伤或坏死有关。鲜有研究阐述 ctDNA 的稳定性， 因此我们对于血浆 cfDNA 的释放和代谢机制知之甚少。近 期提出，脾 脏、肝 脏、肾 脏 在 清 除 cfDNA 过 程 中 起 重 要 作 用［5］。妊娠妇女血浆游离胎儿 DNA 的清除半衰期仅为 16 min［6］，清除效率高速度快。
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广东医学 2015 年 10 月 第 36 卷第 19 期 Guangdong Medical Journal Oct． 2015，Vol． 36，No． 19
form of nitric oxide synthase［J］． Cardiovasc Ｒes，2013，99（ 4） ： 685 － 693． ［17］ QIU H，LIZANO P，LAUＲE L，et al． H11 kinase / heat shock protein 22 deletion impairs both nuclear and mitochondrial functions of STAT3 and accelerates the transition into heart failure on cardiac overload［J］． Circulation，2011，124（ 4） ： 406 － 415． ［18］ 杨官品，张蕾，董超华． 热休克蛋白 22 结构和功能研究进展 ［J］． 中国海洋大学学报： 自然科学版，2009，39 （ 5） ： 965 －
通过大量临床肿瘤试验的研究，ctDNA 作为液相活检的 功能逐渐被人们所认知。然而将液体活检正式用于临床实 践前需要大量前瞻性临床研究进行验证，且应对其分离检测 及分析过程的每个环节进行标准化。此外，ctDNA 释放的动 力学机制尚未完全阐明，所以在治疗过程中应检测同一癌症 患者不同时间 ctDNNA，而 原 发 性 脑、肾、前 列 腺 和 甲 状 腺 癌 患 者 不 到 50%［13］。该研究进一步分析了 206 例转移性结直肠癌患者 中与临床相关性高的 KＲAS DNA 突变基因，结果显示其敏 感性为 87. 2% ，特异性为 97. 2% 。CHUＲCH 等［14］检测无症 状结直肠癌患者的血浆中循环甲基化 SEPT9 DNA 发现了处 于不同分期的结直肠癌患者。同样类似的研究认为 DNA 甲 基化的测定可以判断晚期乳腺癌患者，并监测转移性乳腺癌 的肿瘤负荷及其治疗反应［15］。ctDNA 技术还可用于孕妇产 前诊断，孕早期的胎儿 cfDNA 不仅可以评估遗传性疾病，而 且能预测孕妇可遗传的癌症风险，如乳腺癌和卵巢癌，分别 可检测是否存在 BＲCA1 和 BＲCA2［16］。
4 ctDNA 的最新临床应用
随着新一代基因测序技术的发展，ctDNA 技术作为一种 快速、高效、非侵入性的检测肿瘤基因突变的“液相活检”将 运用于临床，主要可用于以下 3 个方面。 4． 1 ctDNA 用于癌症的早期诊断 近年来，循环生物标志 物在评估疾病严重程度方面起到重要作用，尤其是在影像学 结果不明确的情况下，如 PSA、CA19 － 9、AFP 和 CA － 125。 然而许多恶性肿瘤不具有可靠的蛋白质生物标记物，甚至在 有生物标志物的疾病中，这些标志物也常常缺乏特异性。此 外，大多数的蛋白质生物标志物在循环中持续存在数周，因 此要得到准确评估需等到数周或数月后［12］。而 ctDNA 的半 衰期短（ 约 2 h） ，可动态评估癌症情况［11］。并且 ctDNA 的肿 瘤特异性强，体细胞突变导致的癌症就是由于 ctDNA 取代了 相应的正常细胞 DNA。在一个 640 例大样本恶性肿瘤的研 究中，约有 75% 晚期胰腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、膀胱癌、 胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝细胞癌、头颈部癌患者可检测到
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酸活化的聚合反应） 和 TAM － Seq（ tagged － amplicon deep sequencing） 的出现大大提高了检测 ctDNA 的敏感性。Safe － SeqS（ Safe － Sequencing System） 技术可在极低的 cfDNA 浓度 下发现基因突变，并且可降低至少 70% 的误差率来提高准 确性。新一代基因测序（ NGS） 有助于血浆 ctDNA 的检测，可 在复发或病情恶化前进行早期预测，并且以 ctDNA － NGS 为 基础的分析方法可通过得知新兴突变片段而决策一个新的 治疗方案［10］。
（ 收稿日期： 2015 － 01 － 21 编辑： 庄晓文）
循环肿瘤 DNA 在临床应用中的研究进展*
许婷▲ ，肖国宏△
广州医科大学附属第三医院生殖医学中心、广东省生殖医学重点实验室、广东省产科重大疾病重点实验室、广州妇产科研究所 （ 广州 510150）
DOI:10.13820/ki.gdyx.20151013.009 近几年来，一 种 新 的 潜 在 肿 瘤 生 物 标 志 物 即 循 环 肿 瘤
1 ctDNA 的生物学特性 早在 1948 年 MANDEL［1］在正常人群的血液中检测到游
离 DNA 片段即血浆游离 DNA（ cell － free DNA，cfDNA） 。直 到几十年后，LEON 等［2］发现肿瘤患者体内 cfDNA 高于健康 个体，且晚期肿瘤患者 cfDNA 水平更高。这些研究提示 cfDNA 与肿瘤关系密切，并与肿瘤转移相关性高。随着研究的 不断深入，学者发现 cfDNA 中存在与肿瘤基因改变相同的 DNA 片段，并命名为 ctDNA。目前，ctDNA 的来源尚不十分 明确，但许多研 究 认 为 其 主 要 来 源 于 凋 亡 或 坏 死 的 肿 瘤 细 胞［3 － 4］。在肿瘤组织中，细胞代谢旺盛，肿瘤细胞可主动释 放 ctDNA 进入血液循环，并且转移病灶和循环肿瘤细胞也可 释放 ctDNA。大多数 cfDNA 片段在 180 ～ 200 bp 之间，cfDNA 被凋亡或坏死细胞释放到血液的浓度取决于肿瘤的位置、 大小和周围血管［3］。对于一个肿瘤负荷为 100 g（ 3 × 108 个 癌细胞） 的患者来说，每天将近 3. 3% 肿瘤 DNA 进入血液循 环［4］。因此，ctDNA 突变片段的比例与肿瘤负荷高度相关。 但 cfDNA 在循环中释放的动力学机制尚不清楚。在正常生
3 ctDNA 作为一种非侵入性的动态检测肿瘤指标的 临床应用
近年来，实施靶向治疗前大多需对肿瘤组织进行活检。 了解肿瘤组织的分子机制有助于随后的临床用药。当前肿 瘤病理组织活检仍是临床诊断的金标准，然而也是一种侵入 性检查。安德森癌症中心报道胸椎和盆骨的组织活检分别 会带来 17. 1% 和 1. 6% 的并发症［3］。此外，肿瘤 组 织 的 获 取、保存和肿瘤异质性使病理组织活检在一定程度上受到限 制。最新研究认为甲醛溶液石蜡包埋技术会影响 DNA 的分 子分析，且每个活检的样本中肿瘤细胞数与肿瘤细胞结构和 取样的大小及位置有很大关系［3］。因此，肿瘤病理组织活检 或组织切片可能遗漏瘤内其他部分的情况及转移瘤之间的 异质性。而 ctDNA 原则上可提供组织活检相同的遗传信息。 从患者血中分析 ctDNA，来源方便，损伤小，可动态监测癌症 治疗过程中每个阶段的基因组学和分子标志信息。据目前 研究 得 知，ctDNA 在 癌 症 Ⅳ 期 患 者 中 的 敏 感 性 几 乎 为 100%［11］，而在癌症微转移病灶的早期阶段 ctDNA 片段的检 测敏感性低［4］。因此鉴于这种新技术的优点和局限性，我们 需针对不同临床情况对 ctDNA 检测技术的灵敏度进行评估 并合理利用。
2 ctDNA 的检测
目前，检测和分析 ctDNA 的方法很多，但缺乏统一标准， 这在陈岳青等［7］研究 ctDNA 与非小细胞肺癌的关系中得到 进一步证实。因此我们需先解决一些问题。第一，分析前的 分离程序需 要 标 准 化。 首 先，收 集 样 品 到 分 离 血 的 时 间 间 隔，离心条件，确定用血清还是血浆分析； 然后，如何分离出 足够高质量的 DNA。第二，ctDNA 的定量标准化。量化的方 法包括分光光度计、荧光染料、定量 PCＲ 等。第三，cfDNA 的检测过程中存在 3 个难点，ctDNA 与正常 cfDNA 有何区 别、ctDNA 低水平状态如何检出和样品中突变片段数怎样准 确定量。研究显示虽然血清中 ctDNA 的量比血浆中高 2 ～ 24 倍，但血浆更适于用来分析 ctDNA，其原因可能是凝血过 程中细胞产生的某些物质影响分析［8］。cfDNA 发生基因突 变后称为 ctDNA，1994 年首次提出了 cfDNA 上的体细胞点 突变区域［9］。这些体细胞突变通常来源于单个碱基替换，只 在癌细胞或癌前的基因组细胞中存在，这保证了 ctDNA 作为 生物标记物的特异性。因此，肿瘤 DNA 片段丰富的癌症患 者的循环中，可以用标识体细胞突变 DNA 测序方法来明确 ctDNA。肿瘤细胞中核酸突变包括点突变、扩增、成排、DNA 甲基化、线粒体 DNA 突变以及非整倍体，其中以点突变发生 率最高，如 EGFＲ 和 KＲAS 突变。很多情况下，cfDNA 在循 环中浓度低且碎片率高，这给分析带来了巨大的挑战。随着 数字基因 组 技 术 的 发 展，数 字 聚 合 酶 链 反 应 技 术 （ Digital PCＲ） ，BEAMing（ beads，emulsion，amplification，and magnetics） ，PAP （ pyrophosphorolysis － activated polymerization，焦 磷