慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用

慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用
摘要：慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。

经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。

基因治疗成功的关键是选择合适的载体系统，慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒载体，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗载体研究的热点。

近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展，笔者对慢病毒载体的构建以及其在人类疾病基因治疗方面的应用做简单的介绍。

关键词：慢病毒载体；载体构建；基因治疗
基因治疗是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。

其关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。

理想的基因载体应具备：靶向特异性；高度稳定、易制备、可浓缩和纯化；无毒性；有利于基因高效转移和长期表达；容量大，易人工合成，缺乏自动复制载体自身的能力［１］。

由于病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚、易于改造和操作、感染效率高、有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的，而慢病毒载体由于其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力且转染效率高、靶向性好和持久性表达等特点，病毒载体系统就显得格外引人注目。

1 慢病毒及其载体的简介
慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。

慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本结构基因外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu 和2个调节基因tat和rev［２］。

慢病毒载体（Lentiviral vector，LV）作为外源基因载体，其产生均包括一个遗传割裂基因表达的设计。

病毒元件要符合以下条件：①慢病毒组装辅助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒转基因载体RNA 包括转基因表达盒；③异质糖蛋白。

目前使用不同种属来源的慢病毒载体，包括来源于人类（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、猫（FIV）等其它物种［３］。

2 病毒载体的构建
由于慢病毒的一些自身因素，我们需对其进行以下的一些改建，使其可以更好地为疾病治疗和科研工作服务。

2.1 最小辅助包装元件
为了减少病毒序列的数量从而减少同源重组的风险，去除了组装慢病毒载体结构中不同辅助元件或用其它的特异序列来代替。

其中包括原位癌激活基因序列的调整。

另外，去掉附加或调节基因与gag-pol基因一样，已在一些慢病毒载体
设计中得以应用［４］。

2.2 去掉附加基因
有几个HIV-1基因（vif，vpr，vpu，nef）对体外病毒复制不重要，但对体内病毒的致病性非常重要，甚至nef，vif，vpr整合在病毒颗粒内从而促进了载体的免疫原性。

因此缺乏这些非重要基因时能够有效生产慢病毒载体是非常重要的［５］。

然而，有研究表明在驻留型巨噬细胞和活性Ｂ淋巴母细胞的转导中需要nef，vif，vpr的参与［６］。

因此，在去掉附加基因的过程中，要依具体情况决定基因的去留。

2.3 去除调节基因
有研究表明反式作用元件tat对全效慢病毒载体基因组RNA中的5’-LTR 的tat依赖性U3序列已经被强效启动子序列取代。

在安全性方面，通过在分
散结构中进一步分裂原病毒基因组来表达rev。

在设计双顺反子gag-pol，IRES，rev组装表达结构时也表达了rev基因结构。

载体与rev效应元件（RRE）相互作用并影响了非剪接gag-pol mRNAs和转基因载体基因组RNA从核内输出。

RRE 序列已被异种病毒序列所取代，此种病毒序列能促进非剪接转录产物从核中输出或促进非剪接转录产物的稳定性。

用这些异种输出序列取代RRE/rev引起了HIV-1或SIV载体效价的下降［７］。

另外，实验表明宿主细胞因子参与了RRE 包含的RNAs从核中输出的过程。

2.4 壳体化位点的最低要求
在大多数慢病毒载体壳体化位点要求在转移载体RNA中存在gag基因区的最小5’-片段，此片段含有对顺式组装活性有必要的主干环结构。

在大多数慢病毒载体体系中，包含在N-末端片段落gag ORF，大约有300~400个碱基对，已经被移码突变截断，因此易感呈现gag肽的转录/翻译不会干预转基因的转录/翻译［８］。

3 慢病毒载体在疾病治疗方面的应用
慢病毒载体在基因治疗方面已取得了良好的效果，国外已经进行了一系列的从基础到临床的系统研究工作，包括构建有效载体所需的最少的HIV-1基因、SIN 载体的构建、应用HIV-1载体包装细胞系、非人类慢病毒载体的应用等；尤其是在安全性方面，在用H1V-1为载体的体内及体外实验中，迄今尚未发现诱发宿主免疫反应的产生，表明其安全性是有保证的。

3.1 肿瘤治疗
大约30%的乳腺癌中有表皮生长因子受体家族蛋白HER2的过表达，HER2表达水平与病人的预后以及恶性程度密切相关。

在以往鉴定的对HER2有良好
RNAi效应的靶序列的基础上，构建了一系列U6和H双启动子小干扰RNA （siRNA）表达载体［９］，并转染HER2高表达乳腺癌SKBR3细胞定量测定了其HER2下调效应。

程连胜［１０］等做siRNA表达盒经LR重组反应被克隆入慢病毒载体中并成功包装成病毒的实验。

由于siRNA是作用于mRNA上并导致其降解的，采用荧光定量PCR对感染siRNA慢病毒后乳腺癌SKBR3细胞HER2的mRNA水平进行了相对定量、蛋白印迹杂交和流式细胞仪等一系列实验证明：慢病毒介导的RNAi确实能有效地下调肿瘤抗原HER2的表达，结果显示，由于HER2下调导致了细胞生长抑制。

由此可见，用慢病毒介导的RNAi对乳腺癌的治疗将有良好的应用前景。

自身分泌活动因子（AMF）是由肿瘤细胞分泌的，并且促进肿瘤细胞的生长。

AMP和其受体（AMPR）的表达与许多低成活率和进行性的胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌、食道癌、皮肤恶性黑色素瘤和肺腺癌有着密切的关系［１１-１７］。

最近有研究表明，AMP的突变对乳腺癌的进展和转移有着明显的促进作用。

AMP表现出了与磷酸葡萄糖异构酶的一致的序列，它受小窝蛋白-1（Cav-1）的负向调节［１８］。

Kojic［１９］等用慢病毒载体转导Cav-1基因到乳腺癌细胞中，实验结果表明，AMP的表达与Cav-1的表达有着明显的负相关性，Cav-1对AMP有强负调节作用，对癌细胞的生长有抑制作用。

由此可推断，慢病毒载体介导的Cav-1对与AMP表达相关的恶性肿瘤应该有一定的治疗效果。

3.2 血液系统疾病的治疗
慢病毒载体不仅能感染造血干细胞（HSCs），使携带的目的基因整合至HSCs 基因组内，且能利用病毒携带的调控元件，使目的基因随HSCs细胞特异性表达。

Michel Sadelain［２０］等用小鼠模拟了人α-地中海贫血的模型，并用慢病毒载体介导治疗基因进行治疗。

实验载体来源于TNS9 vector，这个载体已表现出良好的转移治疗用的人类β-globin基因进入小鼠造血干细胞的能力［２１-２４］。

对α-地中海贫血，除了将β-globin基因用α-globin基因替代外，原载体的原件都保留，将载体通过小鼠卵黄囊的血管直接注射进胚胎，但是转移进去的基因在表达过程中出现了衰减现象［２０］，原因还有待于研究。

但在对β-地中海贫血的治疗中，慢病毒介导的β-globin基因进入小鼠的造血干细胞却取得了不错的效果［２５］。

虽然慢病毒载体在地中海贫血治疗中不尽完美，但可以肯定的是，随着研究的深入，慢病毒载体在地中海贫血中的应用一定会有光明前景。

3.3 半月板的修复
张经纬等［２６］用ViraPower慢病毒载体系统转载中碱性成纤维细胞生长因子，研究其在新西兰大白兔的半月板纤维软骨细胞损伤修复作用，结果发现转染48h后半月板细胞培养液中碱性成纤维细胞生长因子就有明显的表达；细胞DNA合成前期、DNA合成期、分裂前期及分裂期的时间较对照组和空白组缩短，并且胶原合成结果显示实验组细胞胶原高于对照组和空白组。

表明利用慢病毒转基因技术能有效地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染入半月板纤维软骨细胞，继而促进半月板细胞的增殖和基质合成，有可能为治疗半月板损伤提供新的方法。

总之，尽管慢病毒载体目前还不尽完善，仍然存在很多的问题，但是由于慢病毒载体可转染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应、安全性好等优点，对转基因的治疗和研究有很大的诱惑力。

相信随着技术的进步，该类载体将会得到进一步提高，并具有广阔的应用前景。

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