实验简单染色与革兰氏染色
细菌的简单染色和革兰氏染色
Байду номын сангаас
实验一 细菌的简单染色和革兰氏染色
一、实验内容： 实验内容： 1、细菌的简单染色 2、革兰氏染色 、 、 实验原理（实验报告中总结）： 二、实验原理（实验报告中总结）： 三、实验菌种 金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus） ） 大肠杆菌 （Escherichia coli） ） 苏云金芽胞杆菌 （Bacillus thuringiensis） ） 四、实验操作 （一）简单染色 1、涂片：取干净载玻片一块，滴一滴蒸馏水，取金黄色葡萄球菌或苏云金杆菌制成菌悬液，再 、涂片：取干净载玻片一块，滴一滴蒸馏水，取金黄色葡萄球菌或苏云金杆菌制成菌悬液， 环至另一干净载玻片上涂抹均匀。 取1环至另一干净载玻片上涂抹均匀。 环至另一干净载玻片上涂抹均匀 2、干燥：自然干燥 、干燥： 涂布 3、固定：火焰固定（火焰上通过三次） 、固定：火焰固定（火焰上通过三次） 4、染色：复红染色 －2分钟 、染色：复红染色1－ 分钟 5、水洗，吸水纸吸去多余水分 、水洗， 6、干燥 、 7、镜检：依序 、镜检：依序10x ，40x ，100x（油镜）观察。 （油镜）观察。 革兰氏染色（大肠杆菌必选） （二）革兰氏染色（大肠杆菌必选） 菌1 菌2 1、涂片：在同一玻片上做三个涂片区 、涂片： 2、3 ：同简单染色 、3 同简单染色2、 、 4、初染：滴加结晶紫染色 分钟，水洗 分钟， 、初染：滴加结晶紫染色1分钟 5、媒染：碘液 分钟，水洗 分钟， 、媒染：碘液1分钟 涂布 6、脱色：95％乙醇脱色 －30秒，水洗 、脱色： ％乙醇脱色20－ 秒 7、复染：番红染色 分钟，水洗，吸水纸吸去多余水分 分钟， 、复染：番红染色3分钟 水洗， 8、镜检：同简单染色 、镜检： 作业：绘出100x油镜下 、E.coli 和 B.t 的菌体形态图， 油镜下S.a、 的菌体形态图， 五、作业：绘出 油镜下 菌1 菌1＋菌2 菌2 ＋ 革兰氏染色请标明革兰氏反应结果。 革兰氏染色请标明革兰氏反应结果。
细菌形态结构观察——简单染色革兰氏染色
（1） 为什么必须用培养24 h以内的菌体进行革兰氏 染色？
（2） 要得到正确的革兰氏染色结果，必须注意哪些 操作？哪一步是关键步骤？为什么？
（3） 当你对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操 作正确，结果可靠？
） “和而不同”，多元发展。近年来 ，中医 药在防 治非典 、禽流 感和艾 滋病方 面发挥 的独特 作用也 证实了 二者的 有机结 合，具 有肯定 的临床 疗效。 编辑本段东西方医学交融（df高血压958心脏 病983u6糖尿 病87fr）
1、简单染色法原理 这是最基本的染色方法，由于细性燃料如美蓝、碱性 复红、结晶紫、孔雀绿、蕃红等进行染色。这类染料解 离后，染料离子带正电荷，故使细菌着色。
2、革兰氏染色法原理 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色
法，通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+） 和革兰氏阴性菌（G-）两大类。 革兰氏染色过程所用四种不同溶液的作用：
（5） 复染 蕃红染液复染1 min，水洗。 （6） 吸干并镜检 若研究工作中要确证未知菌的革兰氏反应 时，则需同时用已知菌进行染色作为对照。
五、实验结果
（1） 绘图：画出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的细胞形 态图。 （2） 记录革兰氏染色结果；分辨出革兰氏阳性菌或革 兰氏阴性菌。如果染色结果不理想，请分析原因。
（1） 碱性染料 草酸铵结晶紫液。 （2） 媒染剂 碘液，其作用是增强染料与菌体的亲和力， 加强染料与细胞的结合。
（3） 脱色剂 乙醇将染料溶解，使被染色的细胞脱色。 利用不同细菌对染料脱色的难易程度不同，而加以区分。
（4） 复染液 蕃红溶液，目的是使经脱色的细菌重新染 上另一种颜色，以便与未脱色菌进行比较。
（2） 染色 用草酸铵结晶紫染液染色1 min，用水冲洗。 （3） 媒染 滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖1 min， 用水冲去碘液。
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告细菌是微生物中最常见的一类生物，它们广泛存在于自然界的各个角落，包括土壤、水体、空气等。
为了更好地了解细菌的形态和结构，科学家们开展了许多实验，其中包括细菌的简单染色和革兰氏染色。
一、细菌的简单染色实验细菌的简单染色是一种常用的染色方法，通过给细菌染色，可以使其在显微镜下更加清晰可见。
这种染色方法主要使用了一种叫做甲基蓝的染料。
在实验中，首先需要制备好细菌的涂片。
将一根无菌的钢丝棒蘸取一小滴细菌悬液，然后将其均匀地涂抹在玻璃片上。
待涂片干燥后，将其固定在火焰上加热的玻璃柱上，以使细菌附着在玻璃片上。
接下来，将制备好的涂片放入染色盒中，加入适量的甲基蓝染料，浸泡片刻。
然后，用蒸馏水轻轻冲洗涂片，直至水洗液不再有颜色流出。
最后，用纸巾轻轻吸干涂片上的水分，将其放入显微镜下观察。
在显微镜下观察，我们可以清楚地看到细菌的形态和结构。
不同种类的细菌可能会呈现出不同的形状，例如球状、杆状、螺旋状等。
通过简单染色，我们可以更好地观察和研究细菌的特征。
二、革兰氏染色实验革兰氏染色是一种常用的细菌染色方法，它可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
这种染色方法主要使用了紫晶染料和碘酒。
在实验中，首先需要制备好细菌的涂片，方法与简单染色相同。
然后，将涂片放入染色盒中，加入适量的紫晶染料，浸泡片刻。
接着，用蒸馏水轻轻冲洗涂片，直至水洗液不再有颜色流出。
接下来，将碘酒滴在涂片上，使其浸润全片，然后用蒸馏水轻轻冲洗涂片。
随后，滴入乙醇或酒精醛溶液，使其浸润全片，然后用蒸馏水轻轻冲洗涂片。
最后，滴入蓝色染料，浸泡片刻后用蒸馏水冲洗涂片。
在显微镜下观察，我们可以看到细菌的染色效果。
革兰氏阳性菌会呈现紫色或蓝色，而革兰氏阴性菌则呈现红色或粉色。
这是因为革兰氏阳性菌的细胞壁含有较多的胆固醇，可以吸附紫晶染料和碘酒，而革兰氏阴性菌的细胞壁则较薄，无法吸附这些染料。
实验三简单染色法和革兰氏染色法
实验三简单染色法和革兰氏染色法实验三简单染色法和革兰氏染色法（一）细菌的简单染色法1实验目的1.1熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能1.2学习微生物涂片、染色的基本技术1.3掌握细菌的简单染色法1.4初步认识细菌的形态特征，学习油镜的使用方法和无菌操作技术2 实验原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。
利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
此法操作简单，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
一般使用碱性染料进行简单染色。
碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。
因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
常用作简单染色的燃料有美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等。
酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。
染色前必须固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌并使菌体黏附于玻片上；二是增加对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
固定时尽量维持细胞原有的形态。
3实验材料3.1菌种金黄色葡萄球菌约18h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物。
3.2染色剂草酸铵结晶紫染液，番红染液。
3.3仪器或其他用具显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签等。
4 流程涂片干燥固定染色水洗干燥镜检5 步骤5.1涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴生理盐水或无菌蒸馏水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2。
微生物实验二细菌的简单染色和革兰氏染色_图文_图文
染色结果
金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果
染色结果
大肠杆菌革兰氏染色结果
染色结果
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌样的革兰氏染色结果
四、实验结果
显微镜放大倍数＝物镜放大倍数×目镜放大倍数
绘图记录观察结果
思考题
1、在制作涂片中，为什么要进行固定这 一步？
2、革兰氏染色中哪一步关键，为什么？
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳 性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁 的结构和组成不同决定的。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂 结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用 乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红 )复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂 蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞 中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染 剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌 。
2、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。 3、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。 4、染色：待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上，覆盖涂
面染色1-2分钟。 5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的
水变无色为止（注：勿冲去菌体）。 6、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。 7、镜检：油镜观察并绘图。
二、实验原理---简单染色
染色前必须固定细菌。其目的有二：一是 杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增 加其对染料的亲和力。常用的有加热和化 学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原 有的形。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+） 和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染 色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
实验细菌的革兰氏染色
• 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
• 它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
• 革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌 的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色 反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示； 染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性 细菌，用G-表示。 • 细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细 胞壁的成分和结构不同而造成的。
（二）细菌细胞的革兰氏染色
1．涂片：将培养24小时的枯草芽孢杆
球菌、大肠杆菌和未知菌分别作涂片
（注意涂片切不可过于浓），干燥、
固定。固定时通过火焰1～2次即可，
不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2．染色
（1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟， 水洗。 （2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分 钟，水洗。 （3）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白 背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不 出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即用 水冲净酒精。 （4）复染用番红液染1～2分钟，水洗。
4、染色：放标本于水平位置，分别滴加染色 液于涂片薄膜上，染色时间长短随不同染 色液而定。结晶紫染色液染2—3分钟，石 炭酸复红染色液约染1—2分钟。
5、水洗： 染色时间到后，用自来水冲洗， 直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流 不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避 免直接冲在涂片处。冲洗后，将标本晾干 或用吹风机吹干，待完全干燥后才可置油 镜下观察。
三、实验器材
• 1、菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆 菌,未知菌； • 2、试剂：草酸铵结晶紫，番红水 溶液，碘液，95%乙醇， • 3、仪器：显微镜，载玻片等。
四、实验步骤
（一）细菌细胞的简单染色 1、涂片 ：取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理 盐水于载玻片中央，用无菌操作挑取大肠杆菌和 枯草芽孢杆菌于载玻片的水滴中，调匀并涂成薄 膜。注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。 2、干燥 ： 室温中自然干燥。 3、固定： 涂片面向上，于火焰上通过2—3次，使 细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱 落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。
微生物学实验-简单染色与革兰氏染色
（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3 次固定（以不烫手为宜）。
1 简单染色：
实验方法
2 革兰氏染色： （7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色30 s
左右至流出液无色，立即水洗。
（9）复染：滴加蕃红复染2 min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水
纸吸干。
（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油 镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
实验器材
菌种： 苏云金芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌 液体培养12-16h的枯草芽胞杆菌和培养24h的大肠 杆菌
染色液和试剂：结晶紫、碘液、95%酒精、蕃红、 美蓝、醇醚、香柏油
器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、 擦镜纸（脱脂棉）、显微镜
实验方法
1 简单染色： （1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片上滴2滴蒸馏
实验完毕后的处理
将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净： （1）先用脱脂棉将油镜头上的油擦去。 （2）用脱脂棉沾少许醇醚将镜头擦2—3次。 （3）再用干净的脱脂棉将镜头擦2—3次。 （4）注意擦镜头时向一个方向擦拭。
注意事项
1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度， 革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色 时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性 菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多 少等因素的影响，难以严格规定。
2 革兰氏染色： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。 （2）晾干：与简单染色法相同。 （3）固定，与简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，
实验细菌的简单染色与革兰氏染色
掌握简单染色和革兰氏染色的操作方法
简单染色
将细菌涂片或培养物直接与染料混合 ，然后进行观察。操作简单，适用于 初步观察细菌形态。
革兰氏染色
一种特殊的染色方法，通过结晶紫初 染、碘液媒染、酒精脱色和沙黄复染 等步骤，将细菌分为革兰氏阳性菌和 革兰氏阴性菌两类。
出版年份：XXXX年
THANK YOU
简单染色方法简便，操作相对容易，但只能显示细菌的形态 和结构，不能提供细菌的种类信息。
革兰氏染色原理
01
02
03
04
05
革兰氏染色是一种常用 的细菌鉴别染色法，通 过使用结晶紫、碘液和 酒精等染料对细菌进行 染色，能够将细菌分为 革兰氏阳性菌和革兰氏 阴性菌两大类。
革兰氏染色的原理主要 是基于细菌细胞壁的成 分和结构不同，导致对 染料的吸附和着色能力 。
复染
将涂片浸入稀释后的伊 红或沙黄染色液中，染
色一定时间后取出。
冲洗
用清水冲洗涂片，去除 染色液。
观察
在显微镜下观察染色结 果，判断细菌是革兰氏
阳性还是阴性。
05
实验结果与分析
简单染色结果与分析
染色结果
通过简单染色法，细菌被 染上了不同的颜色，如红 色或紫色。
03
04
涂片制备
将细菌均匀涂在载玻片上，晾 干。
染色
将涂片浸入染色液中，染色一 定时间后取出。
冲洗
用清水冲洗涂片，去除染色液 。
观察
在显微镜下观察染色结果，判 断细菌类型。
革兰氏染色步骤
01
02
03
涂片制备
实验细菌的简单染色和革兰氏染色
革兰氏染色阴性
革兰氏染色阳性
三、器材
1、菌种 大肠杆菌、四联球菌 12～18h营养琼脂斜面培养物；
2、染色剂 革兰氏染色液 3、仪器或其他用具 光学显微镜、酒精
灯、 载玻片、香柏油、二甲苯、 擦镜纸、牙签。
四、操作步骤
1、细菌的简单染色
用牙签挑取少许牙垢涂片、固定、干燥
染色1～2min
水洗、干燥、镜检。
六、预习
▪ 细菌鞭毛染色及其运动的观察
结语
谢谢大家！
ห้องสมุดไป่ตู้
实验细菌的简单染色和革兰氏染色
二、基本原理
革兰氏染色法是由丹麦医生于1884年发 明，是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初 染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然 后用乙醇脱色，最后用复染剂复染。各种 细菌经革兰氏染色法染色后，能区分成两 大类，一类最终染成紫色，称革兰氏阳性 细菌（G＋），另一类被染成红色，称革兰 氏阴性细菌（G－）。
2、细菌的革兰氏染色
在无菌操作下用接种环挑取少许细菌斜面
培养物涂片、固定、干燥、初染1分钟 媒染1分钟 脱色20～30s 复染1分钟、 水洗、干燥、镜检。
五、实验报告
1、绘图示你自己牙垢的细菌形态图； 2、说明染色观察各菌的形状、颜色和革兰
氏染色反应； 3、思考题 见实验教材（老）～31
第（1）、（4）和（6）题。
实验二细菌的简单染色与革兰氏染色
通过显微镜观察，判断细菌是否着色，从而初步判断细菌的种类。
了解革兰氏染色的原理和操作方法
了解革兰氏染色的原理
了解染色结果
通过使用两种不同的染料，使细菌呈 现不同的颜色，从而区分革兰氏阳性 菌和革兰氏阴性菌。
通过显微镜观察，判断细菌是否被染 色以及呈现的颜色，从而确定细菌的 革兰氏类型。
革兰氏染色的目的是区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，因为这两种类 型的细菌在染色结果上存在明显的差异。
03 实验材料
菌种察。
金黄色葡萄球菌
另一种常见的细菌样本，具有不 同的染色特性。
染色液
结晶紫染色液
用于细菌的简单染色。
革兰氏染色液
用于区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
简单染色的原理是利用染料对细菌的亲和力不同，将细菌染成不同的颜色，从而区 分不同类型的细菌。
简单染色方法简便、快速，但染色效果不如革兰氏染色。
革兰氏染色原理
革兰氏染色是一种常用的细菌染色方法，通过使用结晶紫、碘液和酒精 等染料对细菌进行染色。
革兰氏染色的原理是利用结晶紫和碘液对细菌的亲和力不同，将细菌染 成紫色或红色，再通过脱色剂酒精将细菌脱色，最后用番红和碘液复染。
其他试剂和器材
显微镜
用于观察染色后的 细菌。
酒精灯和接种环
用于加热染色液和 接种细菌样本。
无菌水
用于清洗玻片和细 菌样本。
载玻片和盖玻片
用于放置和观察细 菌样本。
吸管和滴管
用于吸取染色液和 其他试剂。
04 实验步骤
细菌的简单染色
01
02
03
涂片制作
将细菌均匀涂在载玻片上， 晾干后进行染色。
染色
出细菌的细胞壁结构特点。
细菌的简单染色与革兰氏染色实验报告（共4篇）
细菌的简单染色与革兰氏染色实验报告(共4篇)细菌的简单染色和革兰氏染色实验细菌的简单染色和革兰氏染色实验实验目的1. 学习微生物涂片，染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。
、2. 巩固显微镜的使用方法。
基本原理1. 简单染色法:用单一染料对细菌进行染色的方法。
此法操作简单，适用于一般形态的观察。
在中性，碱性或酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以用碱性染料进行染色。
碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易于带负电荷的细菌结合而是细菌着色。
带正电的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。
通常的碱性染料除了美蓝外，还有结晶紫，碱性复红，番红等。
细菌体积较小，较透明，如未经染色常不易识别，而经染色后与背景形成鲜明的对比，是易于在显微镜下观察。
2. 革兰氏染色法:将所有的细菌分成革兰氏阳性菌G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌上最常用的鉴别染色法。
该染色法所以将细菌分为G+和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同决定的。
G-菌的细胞壁中含有较多易被乙酸溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄，交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使染色的结晶紫和碘的复合物易于渗透，结果细菌被脱色，在经复红染色后就成了红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时颜色。
革兰氏染色需要四种不同的溶液，碱性染料初染液，煤染剂，脱色剂和复染液。
碱性染料初染液的作用像在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或付着力，即已某种方式帮助染料固定在细胞上，是不易脱落，碘是常用的媒染剂。
脱色剂是被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染剂，复染的目的是使被脱落的细胞染上不同于初染液的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的染色液是复红。
实验六微生物的简单染色及革兰氏染色
实验六微生物的简单染色及革兰氏染色利用显微镜对微生物细胞形态、结构、大小和排列进行观察前，首先要将微生物样品置于载玻片上、染色，为观察到真实、完整的生物形态结构，根据不同微生物的特点采取不同的制片及染色方法。
微生物细胞个体微小且较透明，在光学显微镜下难以将其与背景区分开而看清。
所以，在利用光学显微镜对微生物进行观察前，需要利用染料对微生物进行染色，使着色细胞或结构与背景形成鲜明对比，以便更清晰地观察微生物细胞形态及结构特征。
微生物的另一个特点是种类繁多，不同微生物细胞结构各异，对各类细胞染料的结合能力不同，研究者必须根据所要观察的微生物特点及观察目标，选用适宜的染色技术。
（一）细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的制片和简单染色一、目的要求1.学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术。
2.初步了解细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态特征和相互区别。
3.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。
二、基本原理对个体较小的细菌进行制片时采取涂片法，通过涂抹细胞个体在载玻片上均匀分布，避免菌体堆积而无法观察个体形态，通过加热固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态。
利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。
用于染色的染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。
发色基团赋予染料颜色特征，而助色基团使染料能够形成盐。
不含有助色基团而仅具有发色基团的苯化合物（色原）即使具有颜色也不能用作染料，因为它不能电离，不能与酸或碱性成盐，难以与微生物细胞结合使其着色。
常用的微生物细胞颜料都是盐，分碱性染料和酸性染料，前者包括美蓝（亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、沙黄（番红）及孔雀绿等，后者包括碱性复红、伊红及刚果红等。
通常采用碱性染料进行染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中常带负电荷，而染料电力红染色部分带正电荷，很容与细胞结合使其着色；当细胞处于弱酸条件下（如细菌分解糖类产酸）所带正电荷增加时，可采用酸性染料染色。
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一 实验目的
1、学习微生物涂片、染色的操作技术； 2、掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法； 3、初步掌握无菌操作技术； 4、掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。
二 实验原理——简单染色
• 常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、 碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷， 而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电 荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合 使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜 明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单 染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
向擦拭。将显微镜小心轻拿，按号放入显微镜柜中。
② 观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入 回收容器内。
五 注意事项
• 1、载玻片要洁净无油迹。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，涂 片要均匀，菌膜宜薄。
• 2、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。 • 3、染色过程中勿使染色液干涸。 • 4、选用幼龄的细菌。 • 5、用接种环将菌体与染液混合时不要剧烈涂抹，以免破坏细胞； • 6、滴加染液要适中，否则用盖玻片覆盖时，染液过多会溢出，过少
会产生大量气泡； • 7、盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。
六 思考
1、简单染色和革兰氏染色要获得成功，有哪些问 题需要注意，为什么？
2、绘制简单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡 萄球菌。
3、简单染色和革兰氏染色的原理？
质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的
网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不
易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝
紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类
脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，
细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，
用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
三 实验材料
培养24小时的大肠杆菌（E.coli），金黄色葡萄 球菌;
每个小组从土壤中分离得到的菌种； 载玻片﹑接种环﹑酒精灯及火柴﹑结晶紫染色液
﹑碘液﹑95％乙醇﹑番红染色液﹑吸水纸染色→水洗→干燥→镜检
注意无菌 操作
（1）制片：取菌种培养物常规涂片、自然干燥、加热固 定； （2）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复 红染色1-2min。 （3）水洗：用水洗去涂片上的染色液。 （4）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸 干。 （5）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野 后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入 油滴中仔细调焦观察细菌的形态。
• 革兰氏染色
制片→初染（结晶紫1min）→水洗→媒染（碘液1min）→水 洗→脱色（乙醇20-30s）→水洗→复染（番红2min）→水洗 →干燥→观察
实验结果
实验完毕后的处理
① 将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：
a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。 b.用擦镜纸沾少许乙醚-乙醇混合液将镜头擦2-3次。 c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方
• 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所 带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果 红等酸性染料染色。
二 实验原理——革兰氏染色
• 革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
•
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，
是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。革兰氏阳性
细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂