哺乳动物细胞悬浮驯化方法研究进展
细胞悬浮培养
细胞悬浮培养摘要：悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。
但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。
随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。
关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化1．细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术[1]。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。
细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）2．单细胞制备的方法2.1 机械法早期用机械法分离叶组织单细胞。
Ball和joshi（1965）、joshi和noggle（1967），以及joshi和Ball（1968）曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。
随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。
Rossini（1972）指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功[2]。
2.2 酶解法酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。
人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。
一种悬浮驯化293T细胞的方法[发明专利]
![一种悬浮驯化293T细胞的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/411d07b682d049649b6648d7c1c708a1284a0a11.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710602248.9(22)申请日 2017.07.21(71)申请人 上海恒润达生生物科技有限公司地址 201210 上海市浦东新区张江路1238弄恒越国际大厦1号楼9楼(72)发明人 黄飞 金涛 王海鹰 何凤 史子啸 (51)Int.Cl.C12N 5/073(2010.01)C12N 5/02(2006.01)(54)发明名称一种悬浮驯化293T细胞的方法(57)摘要本发明提供了一种制备低血清培养的悬浮293T细胞系的方法，该方法包括：(1)复苏并培养哺乳动物细胞，得到贴壁培养的该293T细胞，用胰酶消化；(2)用添加了一定量血清的无血清培养基培养该贴壁培养的293T细胞，连续培养该293T细胞至适应该添加了一定量血清的无血清培养基；以及(3)重复步骤(2)中的该连续培育程序，逐渐降低该无血清培养基中的血清添加量至血清浓度为0，得到该悬浮培养的293T细胞。
本发明操作简单，方便使用，费用低，安全性好。
293T 细胞悬浮培养的体外扩增培养方法无需特殊设备，操作简单可行。
293T细胞悬浮培养的基础研究及临床应用上将具有广泛的前景。
权利要求书2页 说明书4页 附图1页CN 109280636 A 2019.01.29C N 109280636A1.全悬浮培养型293T细胞系的驯化方法，其特征在于：步骤如下：(1)贴壁培养型293T细胞的培养选用经无菌、支原体、外源病毒检定为阴性，贴壁培养型293T细胞，待细胞生长致密单层后用含10％胎牛血清的DMEM培养液按1：3比例分瓶传代，置37℃5％CO2的培养箱培养，在48-72h内细胞形成致密单层，为边缘清晰的扁平上皮型细胞且细胞生长正常的情况下可用于驯化；(2)低血清贴壁培养型293T细胞系的驯化a)将步骤(1)所述生长正常的贴壁培养型293T细胞分别用含胎牛血清10％的DMEM培养液各培养三代；每次传代的标准是按1：4比例分瓶，在37℃5％CO2培养，在48-72h内细胞形成致密单层；b)将培养液换成Free style培养基后加10％胎牛血清继续培养三代，传代标准同步骤a)；c)培养液中胎牛血清降为5％，按b步骤中的方法，传代比例降为1：3再培养三代；d)培养液中胎牛牛血清降为2％，在培养液中再加体积百分含量20％上一代次培养了该细胞48-72h的培养液继续培养三代；传代标准同步骤c)；细胞在48h-72h内形成致密单层，驯化得到了低血清贴壁培养型293T细胞系；(3)低血清全悬浮培养型293T细胞的驯化a)将步骤(2)驯化的低血清贴壁培养型293T细胞，用Free style无血清培养基按体积比1：1比例混合后，加2％胎牛血清制成培养液，用培养液将细胞密度调整至2-5×105/ml，125r/min、37℃5％CO2摇床培养；b)重复步骤a)，每培养三代降低血清浓度，胎牛血清浓度依次从2％到1％到0.5％；b)每培养48h取样计数，细胞密度未达到1×106/ml时，800-1000r/min离心后换用新鲜培养液重新悬浮培养；细胞密度达到1×106/ml时，800-1000r/min离心按1：2比例分瓶培养；至细胞密度达到2×106/ml时，800-1000r/min离心按1：3比例分瓶培养；在连续三代按1：3比例培养48h细胞密度均达2×106/ml时，驯化得到低血清全悬浮培养型293T细胞系；(4)无血清全悬浮培养型293T细胞的驯化a)在无血清培养基中加0.2％胎牛血清，将步骤(3)中得到的低血清全悬浮培养型293T 细胞直接稀释到密度5×105/ml，置125r/min、37℃5％CO2摇床培养；b)每培养24h取样计数，细胞密度达到3×106/ml时，将细胞悬液直接稀释至5×105/ml 接种培养，血清降为0，完全用无血清培养培养，在连续三代培养48h细胞密度均达3×106/ ml时，驯化得到无血清全悬浮培养型293T细胞系。
哺乳动物细胞体的构造和功能研究方法的发展
哺乳动物細胞體的構造和功能研究方法的發展哺乳动物细胞体构造和功能一直是生物学家们研究的重要课题之一。
随着科学和技术的不断进步，研究方法也在不断地发展和更新。
本文将介绍哺乳动物细胞体的构造及功能，并讨论研究方法的发展情况。
一、哺乳动物细胞体构造哺乳动物细胞体由许多不同的物质组成，包括细胞膜、细胞质、细胞器和细胞核等。
细胞膜是由脂质双层和蛋白质组成的，它包裹着整个细胞，它的主要功能是控制物质在细胞内和细胞外的运输和交换。
细胞质是包含了细胞中的所有物质，它是一个复杂的系统。
细胞质的主要成分是水，同时还包括蛋白质、碳水化合物、核酸、脂类、离子和气体等。
细胞器是内膜系统构成的。
细胞器包括了许多不同类型的器官，包括内质网、高尔基体、线粒体、溶酶体和膜囊泡等。
每个细胞器都有不同的功能，在维持细胞生命过程中具有重要作用。
细胞核是细胞的控制中心，它包含了遗传信息和基因，参与调节蛋白质合成和细胞分裂等重要过程。
细胞核由核外仁、核孔和染色质组成，核外仁的主要功能是合成核糖体，核孔则是负责物质的运输。
二、哺乳动物细胞体功能哺乳动物细胞体的主要功能是维持生命活动。
不同类型的细胞体具有不同的功能，比如心肌细胞具有收缩功能，神经细胞可以传递信号，肝细胞可参与代谢过程等等。
此外，细胞体还参与许多生物化学过程，例如蛋白质合成、物质分解、分子运输、代谢调节等。
三、哺乳动物细胞体研究方法的发展哺乳动物细胞体的研究方法经历了长期的发展。
在早期，研究人员主要采用组织切片和显微镜技术来观察细胞结构。
由于显微镜的限制，只能观察到细胞中的一些部分结构。
随着科技的不断发展，现代分子生物学技术应用于细胞研究中，例如CRISPR-Cas9基因编辑技术和荧光激活剂等。
CRISPR-Cas9技术用于破坏基因，而荧光激活剂用于启动细胞中特定的分子进程。
此外，高分辨率显微镜也成为细胞研究中的重要工具。
高分辨率显微镜使用高能电子和光线，能够获得更详细的图像，以帮助生物学家了解细胞结构和功能的更多信息。
禽类Ghrelin研究进展
细胞 系 Ｃ ＨＯ－ ＧＨＳ ６ Ｒ ２作 为检测 系 统 ， Ｓ ｐ ａ ｅ － 用 ａ ｈ ｄ ｘ Ｇ５ 凝 胶 过滤 、 子交换 高效 液相 层析 等 方法 ， 大 ０ 离 将 鼠 胃和人 胃组 织 提取 物 经过 系列 层 析 提 纯 ， 中纯 从 化 出 了由 ２ ８个 氨 基 酸 组 成 的 活性 肽 ， 证 明 它 是 并
不 同 ， 、 、 的 Ｇｈ ｅｉ 鸡 鸭 鹅 ｒｌ ｎ由 ２ 个 氨基 酸组成 ， ６ 与人 Ｇｈ ｅ ｎ基 因 的 同源 性 为 ５ ， 火 鸡 和 非 洲 鸵 鸟 ｒｌ ｉ ４ 而 的 Ｇｈ ｅｉ ｒｌ ｎ则 由 ２ ８个 氨基 酸组 成 ｎ 。禽 类 Ｇ ｒ－ ］ ｈ ｅ
３ ２ Ｇｈ ｅｉ ． ｒｌ ｎ阳性 细胞 的 分布 Ｄ ｔ ａｅＹ等 ［］ 用 原 位 杂 交 和 免疫 组 化 对 鼠和 １采 。 人 胃中 的 Ｇｈ ｅｉ ｒｌ ｎ阳 性 细 胞 进 行 研 究 ， 果 表 明 ， 结
是一种 能 够作 用 于 中枢 神 经 系统 的脑 肠 肽 ， 且 是 并
ＧＨＳ受 体 天 然 的 内源 性 配体 ， 够 促 进 ＧＨ 释 放 ， 能
故 称之 为 Ｇｈ ｅｉ。Ｇ ｒｌ ｒｌ ｎ ｈ ｅｉ 为继 ＧＨＲＨ 和 生 长 ｎ成
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关键 词 ： 类 ； ｒｌ ； 禽 Ｇｈ ｅ ｎ 生理 功能 ｉ
中 图 分 类 号 ：８ ２ ２ ￥５．１ 文献标识码 ： Ａ 文章 编 号 ：０ ７５ ３ （０ １０一０ ４Ｏ １ｏ —Ｏ ８ ２ ｌ ）９ｏ９ 一５
１９ ９ ９年 ， 日本学 者 Ｋ ｊ 等［ 在 大 鼠 胃组 ｏｉ Ｍ ｍａ １
安立国第二版动物细胞工程思考题参考答案
哺乳动物的克隆方法：胚胎干细胞核移植、胚胎细胞核移植、胎儿成纤维细胞核移植、体细胞核移植。
第一章绪论课后习题答案1. 动物细胞工程主要有哪些内容？这些技术有何用途？答：1. 组织和细胞培养技术2. 细胞融合与单克隆抗体技术3. 细胞核移植技术4. 胚胎工程技术5. 干细胞技术6. 转基因技术7. 染色体工程细胞工程的应用有：A. 单克隆抗体的应用：疾病诊断与治疗、微量大分子物资的检测、贵重生物活性物的分离与提纯、特殊疾病治疗、与药物交联治疗疾病；B. 转基因技术的应用：建立疾病的动物模型、品种改良和抗病育种、“乳腺生物发应器”、基因代替治疗、异种器官移植、基因功能研究；C. 细胞与组织替代治疗；D. 治疗人类不孕症；E. 优良品种繁育；F. 生产转基因家畜；G. 保护濒危动物。
2.追踪动物细胞工程研究与应用的最新进展，并预测其发展趋势。
第二章细胞培养1、体外培养细胞有哪些类型？其生长特点有什么区别？答：体外培养的细胞根据其生长方式，主要分为贴壁生长型细胞和悬浮生长型细胞。
离体细胞必须贴附于底物上才能生长的细胞称为贴壁生长型细胞。
有机体的绝大部分细胞必须贴附在某一固相表面才能生存和生长。
动物细胞培养中，大多数细胞必须贴附在固相表面才能生长，当细胞布满表面后即停止生长。
从生长表面脱落进入液体得细胞通常不再生长而逐渐退化，这种细胞称为单层附壁细胞。
贴壁生长的细胞在活体体内时，形态各异，而体外培养状态下则在形态上比较单一而失去其在体内时原有的特征。
按照培养细胞的形态，主要可分为以下几类：成纤维细胞型、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞；少数细胞类型在体外培养时不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，如血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞等，这些细胞在悬浮中生长良好，可以是单个细胞或为细小的细胞团，观察使细胞呈圆形。
由于悬浮生长于培养液中，因此其生存空间大，具有能够提供繁殖大量细胞、传代方便、易于收获细胞等优点，易于大规模生产，便于过程的控制。
293ft细胞悬浮驯化和蛋白表达
293ft细胞悬浮驯化和蛋白表达一、引言在生物制药领域，细胞工程技术被广泛应用于蛋白表达和生物制药制备中。
而293ft细胞悬浮驯化技术的出现，极大地促进了蛋白表达系统的研究和应用。
本文将从悬浮驯化和蛋白表达两个方面，深入探讨293ft细胞在生物制药领域的重要性和应用前景。
二、293ft细胞悬浮驯化1. 293ft细胞293ft细胞是一种人类胚胎肾细胞，是常用的哺乳动物细胞系，在病毒研究和重组蛋白表达中有广泛的应用。
与传统的293细胞相比，293ft 细胞来源于Flp-In™ 293细胞，其核内含有的FLP重组酶能够特异性地识别FRT位点，并介导外源插入DNA的积极定位，从而提高了外源基因的稳定性和准确性。
2. 悬浮驯化技术悬浮驯化技术是指将细胞种植于搅拌培养皿或生物反应器中，通过搅拌或通气等方式使细胞悬浮在培养基中，从而实现细胞的大规模培养。
而293ft细胞的悬浮驯化技术，使其在蛋白表达和生物制药制备中具有了更广阔的应用前景。
三、蛋白表达1. 重组蛋白表达293ft细胞不仅能够高效地表达内源蛋白，还可以作为重组蛋白表达系统，用于表达外源蛋白。
由于其在短时间内能够高效表达大量蛋白的特性，使得293ft细胞在生物制药制备中备受青睐。
2. 应用前景随着生物制药研究的不断深入，对于蛋白表达系统的要求也越来越高。
而293ft细胞具有易于培养和高产量等特点，使得其在生物制药领域有着广泛的应用前景。
未来，随着细胞工程技术的不断发展，相信293ft细胞在蛋白表达系统中将会有更加广泛的应用。
四、结论通过本文的探讨，我们可以看到293ft细胞在生物制药领域的重要性和应用前景。
悬浮驯化技术和蛋白表达系统的不断完善和发展，也为293ft细胞在生物制药领域的应用打开了更加广阔的前景。
个人而言，我对293ft细胞在蛋白表达系统中的作用和意义有了更加深刻的理解，也对其在生物制药制备中的潜力充满期待。
五、个人观点作为一种重要的蛋白表达系统，293ft细胞在生物制药领域的应用前景不容小觑。
哺乳动物体细胞克隆最新研究进展
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的影响作 了简要的概述 。
关键 词 ： 乳 动物 ； 细胞 ； 哺 体 动物 克 隆
中 图 分 类 号 ：１ ． ８ ３ ３ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：６ １７ ３ （ ０ ２ ０ —０ ７０ １ ７ ２ ６ ２ ０ ）４０ ３—４
Ｃｕ ｒ ｎｔＰｒ ｇ ｅ ｓ ｉ ｈ ｓ ａ ｃ ｆ Ｓ ｍ ａ ｉ ｌ ｏ ｉ ｎ Ｍ ａ ｍ ａ ｓ ｒ ｅ ｏ ｒ ｓ ｎ ｔ ｅ Ｒｅ ｅ ｒ ｈ ｏ ｏ ｔｃ Ｃｅ ｌＣｌ ｎ ｎｇ ｏ ｍ ｌ
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兽用疫苗生产中动物细胞悬浮培养的优化与应用研究
兽用疫苗生产中动物细胞悬浮培养的优化与应用研究摘要：在兽用疫苗的研发生产过程中，动物细胞漂浮培养逐渐得到了研发人员的重视和关注。
当前，在各种兽用疫苗的研发和生产过程中，将动物细胞漂浮培养技术相结合，具有非常显著的科研成果，同时，也能够在一定程度上推动兽用疫苗行业的发展。
基于此，本文阐述了兽用疫苗生产中动物细胞悬浮培养的优化与应用办法，来给技术人员提供一些参考。
关键词：兽用疫苗；动物细胞悬浮培养；优化；应用动物细胞悬浮培养是以生物反应器为载体制备生物制剂的关键技术，目前，已成为国内外生物制剂制备的主要方法。
其最大的优点在于可实现最大限度的产量提升和稳定的生物制剂品质[1]。
然而，由于这一技术在我国还没有普及，其生产仍然是以转瓶细胞培养为主，导致生产成本较高、生产强度比较大，不适应当前生物技术不断发展需求。
因此，如何将动物细胞悬浮培养应用于生物制药工程，是从行业者研究的重点[2]。
1.兽用疫苗生产中动物细胞悬浮培养的优化1.1优化动物细胞系选择研发生产兽用疫苗过程中，技术人员应该从安全性与效应两个角度出发，在提高疫苗生产的经济效益的同时，加大对细胞系的筛选和悬浮驯化的研究力度，使其更可靠、安全。
在筛选过程中，如果是同一种细胞遇到先扩增处理的病毒，会呈现交互作用。
为提高疫苗生产的稳定性和安全性，在投入生产前，要开展适应性实验以明确筛选结果[3]。
1.2保证悬浮驯化的科学性不同阶段的细胞生长态势决定了扩张培养工艺的使用与否。
技术人员通过不同阶段的同一种细胞进行培育，然后经过定期观察细胞的表现差异，能够确保悬浮驯化的科学性。
同时，在驯化过程中，不能忽视稳定因素。
疫苗生产工作时，往往需要通过减少培养基中血清浓度来增强稳定性。
细胞培育过程中，技术人员要避免产生损伤行为。
一旦出现了不可控风险，就会影响培养结果，无法进行修复。
为避免出现类似的情况，要确保细胞活性要≥90％。
1.3科学选择细胞培养基在对不同类型的培养基筛选时，要注意其适应性，要根据具体的条件和需要进行筛选。
293ft细胞悬浮驯化和蛋白表达
293ft细胞悬浮驯化和蛋白表达序言作为细胞生物学和生物工程领域的一项重要技术，细胞培养和蛋白表达技术在现代医药和生物科学研究中扮演着至关重要的角色。
而在这一领域，293ft细胞悬浮驯化和蛋白表达技术则是备受关注的焦点之一。
本文将深入探讨293ft细胞悬浮驯化和蛋白表达的相关原理、应用以及未来发展方向，帮助读者全面理解和认识这一重要的生物技术。
一、293ft细胞悬浮驯化1. 293ft细胞的来源和特点293ft细胞是一种常用的哺乳动物细胞系，来源于人类胚胎肾细胞。
与传统的293细胞相比，293ft细胞经过改良和转染后，在悬浮状态下具有更高的表达效率和更好的生长特性。
这使得293ft细胞在蛋白表达和细胞培养领域得到广泛应用。
2. 悬浮驯化技术的原理与方法悬浮驯化是指将细胞从传统的单层培养方式转变为悬浮状态培养的过程。
对于293ft细胞，悬浮驯化技术的关键在于寻找合适的培养基和培养条件，如活性氧含量、温度和pH值等。
适当的培养器皿和搅拌方式也对悬浮培养效果有重要影响。
3. 应用前景和意义悬浮培养的293ft细胞在蛋白表达、病毒制备等方面具有广阔的应用前景。
其悬浮生长形式使得大规模生产成为可能，从而满足了生物药物和蛋白质的临床需求。
而且，悬浮培养还可以降低生产成本、提高生产效率，为生物制药和生物工程行业带来了巨大的发展机遇。
二、蛋白表达技术1. 蛋白表达的基本原理蛋白表达是指在细胞内或体外，通过特定的基因表达系统将目标蛋白大量合成的过程。
在细胞内表达中，常用的系统有原核细胞表达系统和真核细胞表达系统，而体外表达则利用细胞外的重组蛋白合成系统进行蛋白表达。
2. 293ft细胞在蛋白表达中的优势由于其良好的生长特性和高表达效率，293ft细胞在蛋白表达中具有明显的优势。
研究发现，通过适当的基因组成和培养条件调控，293ft细胞在表达重组蛋白和生产病毒颗粒方面表现出较高的稳定性和效率。
3. 蛋白表达技术在生物医药领域中的应用通过蛋白表达技术，可以大规模生产临床所需的生物药物，如重组蛋白、抗体药物等。
哺乳动物精原干细胞研究进展
ｇｒ ｅｌ， Ｇ ｓ ，Ｇ ｓ ｅｍ ｃｌ Ｐ Ｃ ）Ｐ Ｃ 由外 胚层 细胞 转化 而来 口。 ｓ ］ 着
生 殖母 细胞 的增 殖 过 程 中 ，细 胞 质 的分 裂往 往 是 不完 全 的 ，大多 数 生殖 母 细胞 之 间是 由细 胞 间桥 发 生联 系 。而 细胞 间桥 的形成 则 是Ｓ Ｃ Ｓ 分化 的第 一个 标 志［。 常所 指 的生殖 母 细胞是 由不 同种 群 的细胞 ６通 ３ 共 同组 成 的 ，他 们 中的一 部分 仍 然具 有 干 细胞 的特
态 和功 能 类 似 于未 分 化 的胚 胎 干 细 胞 （ Ｓ ｃｉ ） ］ Ｅ ｅｌ ［。 ｓ ４
生过 程 终 止 ； 移植 之后 ， 体 的Ｓ Ｃ 新 构 建受 体 鼠 供 Ｓ重
的生 殖上皮 。有趣 的是 只有 大 鼠 的Ｓ Ｃ 以重新 构建 Ｓ可 小 鼠的 生殖 上 皮并 在 小 鼠体 内进 行 大 鼠的精 子 发生 过 程 『Ｊ 。 １ 而来 自于其 他种 属 的干细胞 移植 到小 鼠体 内后 只能 进行 有 缺 陷 的精 子 发生 过 程 只 能 以精 Ｈ或
维普杂 ０ ８年 第 ６卷 第 ２期
・
综
述・
哺乳动物精原干细胞研究进展
屠 迪 薛立群
作者单位 ： 湖南农业大学动物医学院 １
白秀军
２ ０ ０ ３０ １
４ ０ ２ ２ 安 徽 电子 工 程 学 院 基 础 部 １ １８
原 细胞 的形 式 重新 恢复 种 群 ［， 。除 实验 动物 外 ， １１ ５６ ］ 在
哺乳动物细胞高效表达系统研究进展
第34卷总第89期2013年3月西北民族大学学报(自然科学版)J ournal of N or t hw es t U ni ve r si t y f or N at i o nal i t i es(N at ur al Sci enc e)V oI．34．N o．1M ar ch，2013哺乳动物细胞高效表达系统研究进展柏家林1，2(1．甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030；2．西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030)[摘要]哺乳动物细胞高效表达系统是生物制药工业中十分关键的环节，而表达载体和宿主细胞又是哺乳动物细胞表达系统的两个重要组成部分．文章较详细综述了通过目的基因整合位点的优化、增加目的基因拷贝数、提高目的基因的转录和翻译水平等构建哺乳动物细胞高效表达载体的研究进展．同时。
为使宿主细胞更好地适应工业化大规模培养要求，对通过抗凋亡、细胞周期调控、糖基化、细胞增殖控制技术和多基因代谢等细胞代谢工程对其进行改造的研究进展也作了介绍．[关键词]哺乳动物细胞；高效表达载体；细胞代谢工程；生物工程制药[中图分类号】Q811．4[文献标识码]A[文章编号]1009—2102{2013)01—0043—09利用哺乳动物表达系统生产药用蛋白是21世纪生物制药工业的主要发展方向．用于制备基因工程药用蛋白的表达系统有原核和真核表达系统．原核表达系统主要是大肠杆菌表达系统，它具有表达水平高、操作简单、周期短、易于大规模高密度发酵生产、成本低等优点，成为表达产物不需要修饰的小分子蛋白类药物的首选表达系统．而对于糖蛋白和全抗体类生物药物来说，表达产物多肽链的折叠、二硫键的形成、糖基化的有无以及糖基化的类型常常影响表达产物的合成分泌、生物活性、药代动力学行为、体内稳定性以及免疫原性等特性．由于原核细胞缺少内质网和高尔基体等进行糖基化的细胞器，所表达的产物是非糖基化的，且常以包涵体的形式存在．而酵母、昆虫及植物等真核细胞虽能进行糖基化，但糖基化的方式与人类等哺乳动物细胞又不一样，表达产物寡糖链末端多为甘露糖(m ar i nose，M an)、N一羟乙酰神经氨酸(N—gl ycol yneur am i ni c aci d，G l cN A c)和半乳糖(gal act os e，G al)，它们均容易被肝细胞、巨噬细胞表面的受体识别而清除…．特别是G l cN A c寡糖链，除在人的胚胎期体内存在外，成人一般都不表达，因此对人可能有免疫原性．目的基因在哺乳动物细胞中的表达产物不但能正确组装成多亚基蛋白，而且与天然蛋白的结构、糖基化的类型和方式几乎一致．常用于药用蛋白生产的哺乳动物细胞有3T3、C H O、B H K、H e l a和H epG2，约70％药用蛋白用C H O细胞生产【2J，而且C H O细胞能在10000L以上生物反应器中高密度、无血清悬浮培养【3,4J．经过近30年的努力，已有报遭单个细胞每天表达蛋白量达20Pg的工程细胞株【5】，分批补料式生物反应器悬浮培养细胞密度达2000万细胞／m L 以上，蛋白产量高达10g／L[3,6,7】．但与大肠杆菌相比，哺乳动物细胞的表达水平仍较低、获得高表达工程细胞株所需的时间长、细胞大规模培养的成本高等导致哺乳动物细胞生产蛋白质类药物的成本较高．因此，建立哺乳动物细胞高效表达体系包括高表达载体构建、高表达工程细胞株的获得、生物反应器无[收稿日期】2012—12—20【基金项目]中央高校基本科研业务费专项资金项目(zyz2011074)，校企合作项目(h2011—19)．[作者简介]柏家林(1966一)，男，甘肃天水人，理学博士，博士后，教授，主要从事功能基因组学、动物分子育种及生物技术相关面的研究．一43—血清高密度培养工艺以及目标蛋白的分离纯化工艺，是生物制药工业研究和生产的关键技术．本文就哺乳动物细胞高效表达载体的构建及宿主细胞改造的研究进展作一介绍．1哺乳动物细胞高效表达载体的构建目的基因在哺乳动物细胞中的表达受目的基因所整合染色体区域的状态、目的基因的拷贝数及目的基因的转录、翻译和翻译后加工修饰效率的影响．构建一个高效表达的哺乳动物细胞表达载体，应从表达载体在染色体上整合位点的优化、转录与翻译效率的提高以及目的基因拷贝数的增加等方面综合考虑．1．1整合位点的优化目的基因在C H O细胞染色体上整合位点的状态对于目的基因的表达与否、表达高低以及目的基因在宿主细胞中的稳定性起着决定性作用．只有那些整合位点处于染色体转录活跃区的细胞形成的克隆才可高水平表达目的基因．因此，保证将表达载体整合在C H O细胞染色体上转录活跃位点的细胞克隆挑选出来是提高C H O细胞表达水平的关键步骤之一．1．1．1利用选择基因的弱化表达提高转基因表达水平选择基因(如neo、dhf r)的弱化表达，可使大量整合在低表达位点的细胞由于选择标记基因表达量不足而在选择培养基条件下中毒死亡，只有那些少量整合在转录活跃区的细胞由于表达足够的选择基因产物而存活下来形成克隆．通过在转录水平、翻译水平和构建活性降低的选择基因突变体可实现选择基因的弱化，如将选择基因置于缺失增强子的SV40启动子控制下或内含子中、改变K ozak序列、在选择基因起始密码子A TG前加不同读框的A T G等．B r i an将(1996)选择基因dhf r置于目的基因前一个人工内含子中构建了双顺反子表达载体C M V—D I—t PA，通过筛选表达dhf r基因的克隆，将目的基因的表达量提高了11倍【8]．W em er等(1998)在neO的内部插入一个人工内含子，使用这种载体筛选到的阳性克隆经基因扩增后C D20单克隆抗体的表达量高达2r ag／m L[91．1．1．2利用核基质附着区提高转基因表达水平在载体上添加染色体上的某些特定序列如核骨架附着区(scaf f ol d a t t ac hm e nt r egi on，SA R s)或核基质附着区(m at r i x at t achm ent r egi on，M A Rs)，可使表达载体整合到宿主细胞染色体后能模拟染色体的高转录活跃区，从而使形成的阳性克隆较均一地高效表达目的基因．K odur i(2001)用反义遗传学方法克隆了表达载体在高表达C H O细胞株染色体上整合位点两侧的侧翼序列H I R PE(hot sp ot f or i nc r eased r ecom bi nant pr ot ei n expr essi on)，发现这些序列富含转录活跃区的类A l u序列、基质附着区等元件．他们用H I R PE构建了pTV l载体，使C TLA4～I g在C H O细胞中的基础表达水平提高了10倍【10|．E m er y (1998)用由p一球蛋白基因的位点控制区(10ci cont r ol r egi on，LC R)的超敏感位点(hyper s ens i t i ve s it es)第2、3和4的核心元件构成了一段序列，它能使鼠红白血病细胞(m ur i ne er yt hr ol e ukem i a，M E L)的克隆形成率提高94倍，且能明显提高a一球蛋白的表达量【11]．K i m等(2004)用人J3一球蛋白基因M A R s 构建的载体转染细胞后的表达水平比对照组提高了7倍，并且在每次用叶酸类似物氨甲喋呤(am et hopt er i n，M T X)加压后不用挑选单克隆，大大缩短了获得高表达细胞株的周期[12|．1．1．3利用位点特异性重组提高目的基因表达水平一种方法是通过位点特异性重组将目的基因整合到细胞基因组中的转录活跃区，即先将含有定点重组位点的选择标记基因整合到染色体高表达区，然后将表达目的基因的表达载体和表达重组酶载体共转染上述带有重组位点的细胞系，在重组酶介导下，表达载体通过位点特异性重组定点整合在染色体高表达区，如C r e—k】(P和Fl p—Fr t位点特异性重组系统．K i t o等用带有dhf r扩增基因及融合了Lo】【P 位点的绿色荧光蛋白融合基因的质粒转染C H O—dhf r一细胞株，经过筛选并用M TX加压扩增后得到了可进行基因扩增的定点整合C H O细胞系【131．I nvi t r ogen公司则用Fl p—Fr t位点特异性重组系统建成了多种商品化的定点整合系统，包括293细胞、B H K细胞和正常C H O细胞．但这些细胞的整合位点没有经过系统的优化筛选，而且不能很好地与常用的加压系统(如M TX加压扩增系统等)配合，定点整合一44—的外源基因的表达水平通常都较低．刘志刚等(2004)借助于位点特异性重组和高效筛选，实现了FRT 位点在C H O—dhf r一细胞基因组中转录活跃区的整合，单链抗体一尿激酶融合基因表达量达5t,g／(106细胞24h)¨4|．另一种方法是利用体细胞同源重组即基因打靶技术，实现目的基因定点整合在宿主细胞染色体转录活跃区，但由于体细胞基因打靶比较困难，目前只有少量成功报道【l0I．目前关于真核细胞在染色体水平上调控基因表达的机制还不完全明了，染色体高转录活跃区的鉴定及分离费时费力而且不能保证所获得的就是转录的最活跃区．相比较而言，通过选择基因的弱化，利用位置效应来提高转录效率从而达到目的基因的高表达是一种更为有效的方法．1．2增加目的基因拷贝数单拷贝或低拷贝目的基因，无论表达载体调控元件如何优化、整合的染色体位点多么合适，其外源基因表达量都是有限的．因此，通过增加目的基因拷贝数来获得高表达重组药物的C H O工程细胞株是基因工程药物研究中不可或缺的重要环节．目的基因的扩增常采用目的基因和选择标记基因共扩增的方法，如二氢叶酸还原酶(dhfr)和／或谷氨酰胺合成酶(G S)是常用的扩增基因[15，16]．C H O—dhf r扩增系统常采用dhf r基因缺陷的细胞株(C H0一dhf r一)，可使目的基因的拷贝数扩增至1000余倍．W em er 等(1998)在nEo基因的内部人工内含子中放置目的基因和dhf r基因偶连的表达单元，通过用M TX对阳性克隆dhf r扩增，C D20单克隆抗体的表达量高达2g／L[9|．与dhf r扩增基因相比，G s扩增基因是一种显性基因扩增选择标志，应用G S基因扩增系统常只需l～2轮蛋氨酸黄酰胺(m et hi oni ne sul phoxi m i ne，M SX)加压筛选即可获得高表达细胞株，扩增效率较高，并且在含有G S基因的细胞株中也可得到有效的基因扩增．在C H O细胞中，G S经1轮扩增，基质金属蛋白酶组织抑制因子(t i s sue i nhi bi t o r of m et al l opr ot ei nas es，TI M P)的表达量能从每106细胞9弘g／d提高至110扯g／dt22|．B ebbi ngt on 等用1株以G S作为扩增基因的鼠骨髓瘤细胞(N So)表达人一鼠嵌合抗体，经l轮扩增后，其表达水平为每106细胞10～15gg／d[17I．1．3转录水平在目的基因拷贝数一定、整合位点固定的情况下，转录作为基因表达的第一步，提高转录效率对一个高效表达载体的构建来说显得尤为重要．启动子及其相应增强子、转录终止信号及多聚腺苷酸加尾信号对转录水平的高低及m R N A的稳定性有很大影响，其中强启动子、强增强子是提高转录水平的关键因素．因此人们希望通过寻找转录起始效率高、适用范围广的启动子、增强子来提高目的基因转录水平的表达效率．目前常用病毒源性和细胞源性的强启动子，如m C M V、hC M V、hE Fl a、人C—f os、鸡胞浆8一肌动蛋白等启动子．Bi等发现在含有人C—l os启动子和绿色荧光蛋白(G FP)的报告基因系统中，C —f os启动子控制下G F P的平均表达量比C M V启动子下的更高[18]．研究表明C M V启动子在细胞处于S期、细胞生长迅速时，转录活性最高．但在大规模生产的中、后期，多数细胞生长不旺盛时，可显著影响外源基因的表达水平．与之相比，hE Fl a启动子的转录起始效率更强，并且其转录活性不受细胞周期影响，更适合大规模生产重组蛋白．除寻找强启动子、强增强子之外，用含有不同启动子、增强子的组成元件构建转录效率更高的杂合启动子或杂合增强子也不失为提高转录效率的一个好方法．M a sayuki 等(1997)发现C M V增强子能提高hEF—l a启动子控制下目的基因表达量4～9倍[19]．K i m等发现将hE Fl a启动子的第1个内含子置于m C M V启动子与荧光素酶之间能极大地提高目的基因在C H O细胞中的表达，使荧光素酶的表达量提高了8．2倍【20I．xu等(2001)对CM V和B一肌动蛋白的启动子和增强子、内含子及SV40、B G H和m R B G的pol y(A)等不同转录调控元件的多种组合在H eL a、H epG2和E C V304细胞中进行了系统比较后发现，m R B G的pol y(A)比SV40和B G H的pol y(A)的适用范围更广，能更有效地提高目的基因的表达【21J．在转录过程中，转录因子通过D N A结合结构域特异识别并结合目标基因的特异调控序列，通过转录激活结构域调节或将转录作用因子募集至启动子从而启始基因的转录和表达．因此，提高宿主细胞转录因子的表达水平也能增强目的基因的表达．C ocket t(1990)将反式作用于C M V启动子的腺病毒E I A蛋白基因整合到C H O细胞中，通过提高C H O细胞E I A的表达水平，使C M V启动子控制下的一45—TI M P基因表达水平提高了10倍[22|．另有研究表明，EG F和H RG一91(H e r egul i n be t a1)能提高E FI a m R N A的转录量和蛋白质的表达[23|．R eza等(2002)将用作结合D N A的锌指结构和V Pt6蛋白的转录激活结构域融合构建了人工转录激活因子．通过表达人工转录激活因子，将C M V启动子的转录效率提高了2倍多[24|．随着真核细胞在转录水平调控机制的进一步研究，杂合或人工启动子以及人工转录激活因子的构建将是更为有效的提高转录效率的方法．1．4翻译水平除了转录水平的调控外，翻译水平的调控(如m R N A寿命、m R N A的翻译起始效率)和翻译产物加工修饰的效率等也对目的基因的表达产生重要影响．pol y(A)的存在不但能影响m R N A稳定性，而且也能部分起“翻译增强子”的作用，提高m R N A翻译水平．内部核糖体进入位点(i nt er nal r i bosom e ent r y si t e，I R E S)能使同一m R N A中除第1个基因之外的其他基因得到有效表达．翻译增强子可提高翻译效率；通过使用宿主细胞偏爱的密码子来对目的基因的密码子进行优化也可以大幅度提高翻译效率．Jacks on首先从细小R N A病毒中发现了I R ES．I R ES下游的开放阅读框采取不依赖帽子结构的方式，直接起始翻译．同时，I RES有效介导的内部起始翻译要求起始密码子处有一个有利的翻译环境，当第一个A U G周围序列不利于翻译起始时，I R ES可增强下游A U G的翻译起始[25]．如在V EG F的5’端非翻译区包含1个有功能的I R ES，当eI F4复合物成为限制因素时，I R ES介导的内部起始翻译与其他m R N A竞争时存在优势，它能在依赖帽子结构翻译受损时提供一种有翻译能力的m R N A[26]．此后，Paul ous等(2003)依据IRE S的初级序列和二级结构的保守性以及在离体情况下它们对内部起始翻译要求的条件，将小核糖核酸病毒的IRES分为3类：肠遭病毒(ent erovi r us)和鼻病毒(rhi novi rus)的I R ES，它们在兔网状细胞裂解液(r abbi t r et i cul ar ce l l l ysa t e，R R L)中缺乏特殊的细胞蛋白时不能有效起始翻译；脑心肌炎病毒(EM C V)和口蹄疫病毒(FM D V)的I R ES在不补充R R L时也能有效起始翻译．盐浓度的波动和2A或LB蛋白酶介导的el F4G切割对这类IR ES介导的起始翻译的影响不显著．甲肝病毒的I RE S，它在RR L中高度有效，但在R RL中添加细胞的粗提物时不能刺激它，在eI F4G受2A 或L B蛋白酶切割时受抑制[271．由于第2类IR ES具有对细胞微环境的广泛适应性和内部起始翻译效率高的特点，它已经广泛应用于双顺反子或多顺反子的哺乳动物细胞表达载体的构建．K auf m an等(1991)通过在双顺反子内加入EM C V的内部核糖体进入位点实现了提高目的基因在双顺反子表达载体中的表达效率‘28f．翻译增强子是具有与IR ES不同二级结构的另一类提高翻译起始效率的顺式调控元件．St ei n等(1998)发现在组织缺氧情况下，V E G F m R N A寿命大为提高，V EG F翻译增强的程度可高达40倍，由此发现了具有翻译增强子和IR ES双重功能的V EG F163片断[26]．C hr i st i an在纤维细胞原生长因子2 (F G F一2)的3’端非翻译区发现了2个能使C A T的翻译效率提高9倍的独立元件TE l和TE2,它们之间具有累积效应，能与FG F一2m RN A的5’端非翻译区协同作用，增强翻译效率达12倍[29]．V i vi nus (2001)在H sp70m R N A的5’端非翻译区发现了一个能作为m R N A通用翻译增强子的元件．H sp70 m R N A的翻译增强子没有I R ES结构，它在C A T编码区上游能提高C A T的表达效率10倍，并且能在依赖于帽子结构的翻译过程中起到增强翻译效率的作用【30】．用宿主细胞偏爱的密码子来对目的基因密码进行优化是另一种提高翻译效率的方法．K i m等用人高表达基因偏爱的密码子系统地设计了人EPO基因，再以酵母偏爱的密码子编码人E PO基因作对照来比较优化，结果人优化E PO基因密码子比非优化人E PO基因密码子的表达效率高2～3倍[31]．2宿主细胞的改造随着对细胞代谢途径和调控机理的深入了解，越来越多的研究集中在对细胞本身进行改造的代谢工程来达到优化细胞生长状态，提高产品产量和质量，延长生产周期的目的．目前哺乳动物细胞的代谢工程包括抗凋亡工程、细胞周期调控工程、糖基化工程、细胞增殖控制技术和多基因代谢工程等．2．1抗凋亡工程——46——细胞在大规模培养初期，目的蛋白的表达与细胞的增殖速率呈正相关．但当反应器中细胞的密度达到饱和后，细胞继续增殖会导致养分和氧的大量消耗以及乳酸、氨等有毒代谢产物的大量积累，细胞逐渐凋亡(apopt osi s)，重组蛋白表达量逐渐降低．细胞凋亡是一种由遗传基因决定的程序性细胞主动死亡，生物反应器中大多数细胞的死亡都是因细胞凋亡引起的．为防止细胞培养过程中的细胞凋亡，一般可采用如下三种重要措施：①通过培养基和氧的优化供应防止营养和氧的缺乏．②用化学添加剂如抗氧化剂等阻断细胞凋亡过程．③采用抗细胞凋亡基因改造工程细胞．由于细胞凋亡是由一系列蛋白质控制的过程[32I，因此在目的细胞中引入某些特定基因有可能抑制细胞凋亡的发生．抗细胞凋亡的原癌基因bc l一2(B淋巴瘤／自血病蛋白一2)是被研究得最多的细胞凋亡基因，它在细胞凋亡级联反应中处于重要环节．通过遗传工程使哺乳动物细胞表达抗凋亡基因bc l一2，在大多数情况下虽不能防止细胞死亡，但能延长细胞寿命，增加产物产量【33|．Si m ps on等(1997)将bcl 一2稳定转染TB／C3细胞后，细胞活力增强，抗体滴度上升【341．I t oh等(1995)也同样发现转染了bc卜2的2E3细胞，其抗体生产能力比未转染细胞提高了4倍【351．bc l一2家族中的另外一些成员可能也有与bcl一2一样甚至更强的抑制细胞凋亡的作用．如bc l—X L在许多哺乳动物细胞中得到表达后，可对有些诱导因素如营养物缺乏、辐射和糖皮质激素等引起的细胞凋亡有抑制作用[36,37】．另外有实验表明，当共表达bag一1和bcl-2基因时，可产生有相同或协同抗细胞凋亡作用[38|．L e e等(1996)在提高bcl-2表达水平的同时降低凋亡的最终执行者C as pase一3的表达水平，能明显提高细胞的抗凋亡能力[39I．近年来，人们将抗凋亡基因bc卜2应用于动物细胞培养做了大量工作[40|．另外，对bcl—X L或bcl—2的突变体研究表明，抗凋亡基因的出现可对抗营养及血清限制、有毒物质和代谢废物积累、氧消耗、流体力学应激等引起的凋亡，提高细胞活性，延长培养周期，增加最终细胞密度和产物浓度．Fi guer oa等(2004)在C H O细胞内同时表达抗凋亡基因aven和bcl一2家族成员bcl—X L，同时表达比单独表达ave n或bcl—X L具有更强的抗凋亡能力，在无血清培养基中的各重组细胞的活力分别为85％，50％和30％[41]．另外，采用反义技术将前凋亡基因c—j H n转染细胞也可获得具有抗凋亡以及增殖受控的细胞系，亦是抗凋亡的一种策略【42|．2．2细胞周期调控工程理想的生产过程必需同时维持细胞活性状态以及产物蛋白的表达，即首先使细胞快速增殖到高密度，在细胞凋亡发生之前，控制细胞增殖速率并诱导其进入一个增殖静止期，即产物形成期，此时细胞将获得的代谢能量从用于细胞增殖转为用于产物分泌，细胞维持在活性相对较低的存活状态．通过控制细胞增殖速率，产物分泌量得以大大提高．随着对细胞周期调节机制研究的深入，研究人员已将细胞周期调控基因应用于规模化培养的细胞增殖控制．Fuss enegger等(1998)在C H O细胞中分别表达了p21、p27和肿瘤抑制基因p53三种细胞周期G1／S抑制蛋白，通过抑制cycl i n—E—C D K2复合物的磷酸化活性，阻止细胞进入s期．其中，p21基因转染后细胞获得了生长抑制．其生长静止可持续几周之久，报告蛋白分泌碱性磷酸酶(secr et ed al kal i ne phospha t ase，SE A P)的单位产量增加10--15倍；p27转染后的细胞生长静止但并不发生凋亡，产物表达量增加15倍．由三种蛋白组成的三顺反子元件转染C H O后，SE A P产量比对照提高30倍[433．2．3糖基化工程蛋白质有两种糖基化方式：N一糖基化和O～糖基化．一般来说，0一糖链对蛋白质的特性影响不大，而N一糖链的不同对产品可产生较大影响．N一糖链通常都有一个五糖核心，即M a n al一6(M an Q1)一3(M an81)--，4G1cN A c81-，4G1cN A c．根据外层链的不同，可分为：高甘露糖型、杂合型与复合型[55]．三种因素决定糖链类型不同：①合成肽链的不同．②细胞内糖基化酶的不同．③细胞培养环境的影响．用C H O细胞表达的糖蛋白，其类型与人的尽管近似，但也不尽完全相同．C H O细胞缺少Q一2，6～唾液酸转移酶的功能，因此缺少唾液酸化的糖基．为此，一面人们正尽量寻找能用以生产糖蛋白类药一47—物的人类细胞，如用N a m al w a细胞表达t—pA[44l、pr o—U K[45]和EP O[46|，它们的糖基化和人的自然产品一致．另一方面，人们正打算采用“糖基化工程”(gl ycos yl at i on engi neer i ng)，即应用基因工程手段，人为地改变肽链结构、增加某些酶基因以及改进和控制某些培养条件等，以达到正确糖基化的目的．如在t—PA基因中进行点突变，改变了一个氨基酸，使之增加一个糖基化位点，使t—PA在血浆中的清除率比原来减少了10多倍【471．又如M i neh等(1995)将t—PA与Q一2，6一唾液酸转移酶基因共转染C H O 细胞，结果表达的t—PA的糖基化情况与人类的更接近【48】．Lam ot t e等(1999)将丫一干扰素基因与a一2，6一唾液酸转移酶基因共转染C H O细胞，结果了一干扰素中a一2，6一唾液酸化程度比对照提高了68％(不加丁酸钠)和82％(加丁酸钠)．此外，控制和改变细胞的培养环境对N一糖基化也可产生一定影响【491．H os oi等(1996)研究表明，通过添加地塞米松、改变培养基糖的成分、使培养温度突然下降等，都可使pr o—U K的糖基化形式从含岩藻糖的2分枝复杂型寡糖链，转变为含岩藻糖的3或4分枝复杂型寡糖链，从而使生产的重组蛋白质糖基化形式与人类的一致[s0]．2．4多基因调控代谢工程由于细胞内部调控网络在空间和时间上的复杂性，一个性状并不完全由某一个基因控制．最新的代谢工程策略提出在细胞内进行可分别调控表达的多个基因，以期形成一个模拟细胞调控网络的人造调控系统，最简单的是双调控表达技术．Cor nel i a等(2001)通过链阳菌素和四环素双诱导表达体系构建了重组C H O细胞株，能分别表达p27基因和它的反义链．当诱导p27基因表达时实现了细胞生长的停滞，处于G l期细胞增加了40％，而表达p27基因的反义链，则使细胞内自身p27蛋白表达下降，使细胞增殖的速度提高了一倍，促进了细胞的生长[51,52】．2．5细胞增殖控制工程工业化大规模细胞培养中，常采用无血清／无蛋白培养基(Ser um f ree m edi um，SFM／Pr ot ei n f r ee m e di um，PFM)来降低细胞培养和产品纯化的成本．但SFM／PFM缺乏生长刺激因子、粘附因子、扩展因子以及其他细胞生长存活所必需的成分，在培养过程中常表现出细胞活力降低、贴壁性差等现象，细胞增殖能力下降，进而导致分泌目的蛋白的能力下降．在培养基中添加胰岛素和成纤维细胞生长因子可使细胞恢复增殖能力，同时，细胞内的细胞周期调控因子C ycl i n—E的表达也增加．C ycl i n—E能使细胞周期的G1期延长，s期缩短，提示人们可通过表达C ye l i n—E的方法来增加细胞的增殖能力．人们还通过将生长刺激因子、粘附因子基因导入C H O细胞中，让C H O细胞本身提供其自身生长所需要的成分，使其能在S FM／P FM中良好生长．G andor等(1999)将介导C H O细胞在SF M中贴壁和扩展的玻表粘连蛋白(vi t r onec t i n)基因置于M M T V启动子控制下导入Cl I O细胞，使其获得了在PFM中j!占壁生长和扩展的能力[53]．另外，同时表达胰岛素样生长因子(I G F一1)和转铁蛋白(t r ansf er r i n)的所谓“超级C H O细胞”在PFM上也能生长良好【54J．随着对细胞周期、细胞凋亡、信号传导，以及细胞周期的调控机制等各方面机理认识的不断深入，可以通过载体的系统优化，将编码细胞生长刺激因子、黏附因子、扩展因子、抗凋亡因子、转录与翻译的反式作用因子以及其他细胞生长存活所必需成分的基因和顺式表达调控元件转入宿主细胞，以提高其表达．与此同时把不利于目的基因表达的基因从宿主细胞中敲除或下调其在宿主细胞中的表达，从而把细胞改造为能在SFM／PFM中培养、培养前期细胞增殖快、当细胞密度达到理想值时细胞长时间不增殖、抗凋亡能力强、高表达目的基因的宿主细胞，最终大幅度降低哺乳动物细胞生产蛋白质类药物的成本．参考文献：[1]涂宣林，宋后燕．寡糖链的研究进展【J]．药物生物技术，1998，5：55—59．[2]Ja yapal K P，W l as ehi n K F，H u W S，Y a p H G S．R ec om bi nant prot ei n t he rape ut i c s f r om C H O c el l s一20yea r s and cou nt i ng [J J．C he m Eng Pi ng，2007，103：40—47．[3]Li F，N at araj an V，Shen A，R o ber t K，A m anuU ah A．C e i l cul t ur e proc es se s f or m onocl onal ant i bo dy pr oduct i on[J]．Lande-———48．．——。
用悬浮的Vero细胞生产病毒疫苗的方法[发明专利]
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[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 1970080A [43]公开日2007年5月30日[21]申请号200610119028.2[22]申请日2006.12.04[21]申请号200610119028.2[71]申请人上海乔南生泰科学仪器有限公司地址201102上海市东兰路248号5号楼2楼[72]发明人刘冬连 [74]专利代理机构上海专利商标事务所有限公司代理人范征[51]Int.CI.A61K 39/12 (2006.01)A61P 31/12 (2006.01)C12N 5/08 (2006.01)C12N 7/00 (2006.01)权利要求书 1 页 说明书 10 页[54]发明名称用悬浮的Vero细胞生产病毒疫苗的方法[57]摘要本发明提供了一种用悬浮的Vero细胞生产病毒疫苗的方法，该方法包括下列步骤：a)使Vero细胞悬浮生长在所述无血清培养基中；b)当Vero细胞生长至一定密度时，接种病毒，使所述病毒感染细胞；c)使病毒增殖；和d)纯化收获病毒。
该方法具有培养的细胞密度高，不使用血清和其他动物来源的蛋白，病毒产量高，生产的疫苗质量好，规模容易放大等优点。
200610119028.2权 利 要 求 书第1/1页1.一种用悬浮的V e r o细胞生产病毒疫苗的方法，该方法包括下列步骤：a)使Vero细胞悬浮生长在所述无血清培养基中；b)当V e r o细胞生长至一定密度时，接种病毒，使所述病毒感染细胞；c)使病毒增殖；d)纯化收获病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无血清培养基选自美国S A F C Biosciences公司的EX-CELLTMVero细胞无血清培养基或美国Invitrogen公司的Vero细胞无血清培养基。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在进行所述步骤a)之前，用所述无血清培养基对Vero细胞进行驯化。
一种HEK-293T细胞的悬浮驯化和无血清驯化方法[发明专利]
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(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.07.17C N 103205396 A (21)申请号 201310101524.5(22)申请日 2013.03.27C12N 5/0783(2010.01)C12N 1/36(2006.01)(71)申请人中山康方生物医药有限公司地址528400 广东省中山市火炬开发区健康产业基地(72)发明人王谦 孙艺飞 张鹏 王忠民夏瑜 李百勇(74)专利代理机构中山市科创专利代理有限公司 44211代理人谢自安(54)发明名称一种HEK-293T 细胞的悬浮驯化和无血清驯化方法(57)摘要本发明涉及一种HEK-293T 细胞的悬浮驯化和无血清驯化的方法，属于生物技术领域。
本发明分两步进行，先HEK-293T 细胞由贴壁培养驯化为在带血清的培养基中悬浮培养，再对适应含血清培养基中悬浮培养的HEK-293T 细胞降血清驯化至无血清驯化。
本发明培养出的HEK-293T 细胞生长状态稳定，分散性好，完全适应在无血清且化学成分确定的培养基中进行悬浮培养，能够规模化生产。
(51)Int.Cl.权利要求书2页 说明书4页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书4页(10)申请公布号CN 103205396 A*CN103205396A*1.一种HEK-293T细胞的悬浮驯化方法，其特征在于包括以下步骤：a、接种HEK-293T细胞于含10ml DMEM完全培养基的10cm培养皿中，放于37℃，5%CO2的培养箱中培养2天达到100%汇合状态；b、弃除培养基并加入0.25%胰酶EDTA使HEK-293T细胞消化脱离培养皿表面，然后加入3ml DMEM完全培养基终止胰酶消化;c、将上述消化后的细胞用移液管吸取，并转移到15ml的尖底离心管中，1000rpm离心1min，沉降收集HEK-293T细胞，并用10mlDMEM完全培养基重悬收集的细胞，再将全部细胞的培养箱中；接种于10cm康宁培养皿中，放于37℃，5%CO2d、步骤c中放入培养箱中的细胞每培养2天重复步骤b和c，重复7-9次，直至培养皿中同时出现贴壁细胞和悬浮生长的细胞团；吸取及转移过程中注意勿打散细胞团；e、将最后一次培养的全部细胞消化后转移至摇瓶中培养，每两天按照0.3×106/ml传代一次，每次传代均用0.25%胰酶EDTA消化细胞团至分散状态，直至培养两天后能达到1.2×106/ml细胞，活力95%以上，即得可连续传代95-105代，并可达到最高密度1.1×107/ ml的，适应10%FBS DMEM培养基悬浮培养的HEK-293T细胞，命名该悬浮培养细胞为HEK-293Ts细胞，以3×106/ml密度冻存即可。
动物细胞悬浮培养技术研究进展
动物细胞悬浮培养技术研究进展周欣，程海卫，王永生，王川庆，杨霞【摘要】摘要：细胞悬浮培养是利用生物反应器大规模培养动物细胞生产生物制品的核心技术，是当前国际上生物制品生产的主流模式。
作者就微载体的发展、各种生物反应器的基本原理及应用状况、悬浮培养技术存在问题、中国悬浮培养技术产业化存在的挑战和展望等作一综述。
【期刊名称】中国畜牧兽医【年(卷),期】2012(039)011【总页数】6【关键词】悬浮培养；微载体；生物反应器动物细胞培养在生物技术和生物医药研究中已得到了广泛的应用。
通常，动物细胞培养为病毒疫苗的生产提供培养基质，同时也是多种生物药品生产不可缺少的工具，包括单克隆抗体和基因治疗产品等。
另外，为了研究体内的生物化学途径、病毒产物、病理学机制及细胞内或细胞间反应等，动物细胞培养在大量的生物检测体系中也得到了应用（徐莉等，2008）。
动物细胞与植物细胞和微生物细胞不同，动物细胞没有细胞壁，因此在培养时对剪切力很敏感，要求也更为严格。
传统的动物细胞采用方瓶和转瓶来培养，这方面的技术已经成熟，但是，该方法存在细胞密度低、病毒产率低、生产成本高、劳动强度大等缺点，不能满足现代生物制苗的要求；诞生于20世纪60年代的悬浮培养技术可以进行大规模细胞培养，能够获得大量的病毒产物和高质量的疫苗产品，在国外疫苗生产中普遍应用。
该技术是从转瓶的贴壁培养发展来的，是在生物反应器中人工条件下高密度大规模培养动物细胞用于生物制品生产的技术。
根据细胞是否贴壁分为无载体的悬浮细胞培养和贴壁细胞微载体悬浮培养，前者已在内蒙古生药厂口蹄疫生产中广泛使用。
悬浮培养技术最大优势是通过更为精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量（张韧等，2011）。
作者就悬浮培养的相关问题进行介绍和探讨。
1 微载体的发展Capstick等（1962，1965）对BHK21细胞驯化成功实现悬浮培养，并用于兽用疫苗生产，从而奠定了动物细胞大规模培养技术的发展基础。
哺乳动物细胞灌注培养工艺研究进展
哺乳动物细胞灌注培养工艺研究进展随着动物细胞培养技术的不断改进，灌注培养体系以其特有的优势取得了广泛的发展。
本文依据不同灌注培养系统的特点划分分为微载体悬浮灌注培养、悬浮细胞截流灌注培养、流化床及固定床灌注培养等几类，并对各类型的灌注体系进行了概述。
【关键词】灌注培养；微载体；细胞截留随着单克隆抗体药物产业的发展，带动了大规模动物细胞培养技术的不断提高。
利用动物细胞生产单克隆抗体已成为当前生物制药企业的发展方向。
在上世纪六十年代，灌注培养技术的出现为动物细胞大规模培养开辟了广阔的前景。
在随后的研究中，灌注培养技术得到了迅速发展，已成为动物细胞大规模培养的重要方法。
灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分，并带走代谢副产物，而细胞保留在反应器系统中，由于细胞生长环境优良，可以达到很高的细胞密度，并延长表达时间、增大收获体积，同其它方法相比，灌注培养的产率可以提高很多。
1 悬浮灌注培养1.1 微载体悬浮灌注培养微载体培养最先是由A1 L1 Van Wezel提出，其方法是在细胞培养时，将细胞悬液与经过特殊处理的微载体混合培养，待细胞贴附于微载体上后移至培养液中培养，借助搅拌系统使细胞随载体均匀悬浮于培养液中。
近年来随着对微载体材料的深入探索，相继开发出液体微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA 微载体、藻酸盐凝胶微载体等，并有很多微载体已进行商业化生产，如明胶微载体Gelibead 、Cultispher 、Cytodex3和Microsphere以及大孔的Cellsnow和Cytopore 等。
1.2 悬浮细胞截流灌注培养随着无血清悬浮培养技术的日趋成熟，现有细胞密度及表达量已不能满足需求，人们重新将目光转移到灌注培养上，但是如何不用微载体而将细胞截流在反应器中并结合无血清悬浮培养工艺进行产物的表达成为热门。
该工艺的重点在细胞截流上，如何高效的截流细胞而不对细胞产生损害及降低堵塞成为焦点。
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哺乳动物细胞悬浮驯化方法研究进展
作者：陆陈晨谭树华
来源：《科学与财富》2018年第13期
摘要：哺乳动物细胞表达系统是药用蛋白的主要表达方式，传统的贴壁细胞培养有诸多不利，本文介绍常用的贴壁细胞悬浮驯化的方法，通过将贴壁细胞驯化成悬浮细胞，提高哺乳动物细胞表达水平，降低生产成本。
关键词：哺乳动物细胞；驯化；无血清培养
重组蛋白表达是研究蛋白质功能与结构、药物筛选以及后续应用的关键环节，常规的蛋白表达系统有原核表达和真核表达两大类。
现代医药工业的快速发展需要重组蛋白拥有接近天然蛋白分子的复杂结构、理化性质和生物功能，特别是糖蛋白及抗体类药物。
这就要求表达的重组蛋白需要正确的翻译后修饰、组装和折叠，这是原核表达系统所欠缺的[1-2]。
真核表达系统包括酵母表达系统、昆虫杆状病毒表达系统和哺乳动物细胞表达系统，其中以哺乳动物细胞表达系统较为常用。
1 贴壁细胞表达外源蛋白的缺点
传统细胞培养或表达外源重组蛋白采用贴壁细胞进行表达，这种表达方式虽然操作简便，但细胞密度和表达量较低，并且培养时需要加入血清，亦具很多缺点[3]：
1.1 血清组分复杂，含有多种杂蛋白不利于目的蛋白纯化；
1.2 血清批间差异较大，不同批次的血清浓度不稳定，影响工艺的连贯性；
1.3 血清中可能携带有未充分灭活的动物病毒或支原体，有细胞污染和传染人类的风险。
2 细胞无血清悬浮培养的优势
细胞无血清悬浮培养由于具有培养基的化学成分限定、批间产品质量稳定、简化下游生产、生理环境易于控制等优点，在重组蛋白表达、单克隆抗体制备和疫苗生产等中应用广泛。
3 贴壁细胞驯化成悬浮细胞的方法
3.1 分子生物学手段改造
贴壁细胞驯化成悬浮细胞通常有两种方法，一种是通过分子生物学手段，改造贴壁细胞。
Noelle-Anne Sunstrom， Sugiyono 等人通过将编码胰岛素样生长因子 I（IGF-I）和转铁蛋白的
基因稳定整合到CHO-K1细胞系的基因组中，使用 lac 操纵子/阻遏子系统调控 IGF-I 基因的表达。
这种被称为Super CHOr的细胞系接种到微载体或以悬浮方式培养时，通过异丙基-D 硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导，可以在无外源蛋白添加的培养基中以 20-24 小时倍增速度自分泌生长，改造后的悬浮细胞适用于生产重组蛋白。
3.2 降低培养基血清含量
另一种常用的贴壁细胞驯化方法是逐步降低培养基血清含量，细胞适应后最后换成无血清培养基培养[4]。
杨栋，牛红军等人采用逐步降低血清法将表达 rHuEPO 的贴壁 CHO-EPO 工程细胞株驯化成悬浮细胞，摇瓶培养，最终接种至生物反应器放大培养，具体通过每 2 天弃去贴壁培养的 CHO-EPO 方瓶中一半旧培养基，加入等量的无血清基础培养基 B001，培养基中血清浓度依次以5%，2.5%，1.25%，0.625% 降低。
当血清浓度降至 1% 以下，完全以基础培养基 B001 继续培养，即得悬浮 CHO-EPO 细胞[5]。
4 展望
无血清悬浮培养的哺乳动物细胞相比贴壁细胞既可提高细胞的培养密度，黄锭，赵亮，谭文松等人在犬肾细胞MDCK驯化时研究发现MDCK细胞悬浮生长时细胞延滞期缩短，细胞生长速度增快，活细胞密度和细胞活力提高，葡萄糖比消耗速率、乳酸和氨的比生成速率都大幅降低，而乳酸对葡萄糖的转化率有所升高[6]。
同时也消除了血清中动物源性成分对重组蛋白表达的影响，由于杂蛋白较少，也便于后续纯化，更有利于大规模工业化生产。
另外，不同的重组蛋白工程细胞悬浮培养时可能适用于不同类型的无血清培养基，通过对培养基优化筛选可使悬浮细胞在最优的条件下生长和表达重组蛋白。
参考文献
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[2] Wurm FM .Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells，Nat Biotechnol[J]， 22：2004（1393 -1398）.
[3] S.C.O. Pak， S.M.N. Hunt， M.W. Bridges， M.J. Sleigh & EE Gray，Super-CHO-A cell line capable of autocrine growth under fully defined protein-free conditions， Cytotechnology[J]，1996， 22：（139-146）.
[4] Noelle-Anne Sunstrom， Sugiyono， Sybille Hunt， Charles Bailey， Masood Baig，Merilyn Sleigh & Peter Gray Regulated autocrine growth of CHO cells， Cytotechnology[J]，2000， 34：（39–46）.
[5] YANG Dong， NIU Hong-jun， LU Gang， SHI Jia-lin， SUN Hao-ming， LI Hui* An Optimized Method for Suspension Culture of CHO Cells to Produce Recombinant Human Erythropoietin （EPO）， Progress in Modern Biomedicine[J]，（2012）， 26-5053-04.
[6] Ding Huang， Liang Zhao， and Wensong Tan Adherent and single-cell suspension culture of Madin-Darby canine kidney cells in serum-free medium， Chinese Journal of Biotechnology[J]，2011， 27（4）： 645？652.。