细胞培养

实验二细胞传代培养

一、目的和要求

(1) 掌握贴壁细胞传代的培养方法；

(2) 掌握细胞计数和存活率计算方法；

(3) 培养建立无菌操作意识。

二、实验原理

细胞培养是培养连续细胞系或者离体正常组织或肿瘤细胞的技术。当离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止；若不及时分离、传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或其他比例转移，接种到其他培养瓶的培养。贴壁细胞的传代通常是用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代；而悬浮生长的细胞则用直接法传代或离心法传代。

细胞计数是观察判别所培养细胞的状态的重要手段，也是细胞传代培养及判断实验处理对细胞的影响所必需的方法。细胞计数的结果一般用每毫升（液体培养）或每平方厘米（固体单层培养）的细胞数来表示。通常细胞计数是运用光学显微镜和血球计数板对细胞进行直接计数。图1为血球计数板一个计数区的示意图。血球计数板具有两个可以计数的区室，每个计数区由9个亚区构成，每个亚区的面积为1mm2，同时血球计数板上覆盖一个具有一定厚度的血盖片，保证计数区与盖片之间的距离为0.100mm。当盖片放置正确，每个亚区上的体积为0.1mm3即1×10-4mL。统计计数区中的4个角亚区中的平均细胞数（或中央亚区中的细胞数），记做N；若在准备过程中，对细胞的稀释倍数为D，则样品的细胞密度

4

N

C个/mL。

=D

⨯

10

⨯

图1 血球计数板构造示意图细胞膜是一层选择性通过的半透膜，当细胞膜完整时，某些染料无法进入细胞中。利用这一特性可以进行细胞存活检查。通常使用台盼蓝，活细胞无法被台盼蓝染色，而死细胞则会吸收染料被染色。

三、器材与药品

(1) 实验器材：

CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压灭菌锅、水浴锅、离心机、血球计数

板、离心管、培养瓶、移液枪、微孔滤器等。

(2) 实验材料：

培养的细胞。

(3) 试剂及药品：

RPMI1640培养基、胎牛血清（FBS ）、胰蛋白酶、台盼蓝、NaCl 、KCl 、Na 2HPO 4、KH 2PO 4。

四、实验操作

（一）溶液配制

1. PBS 配制。

称取NaCl 8g 、KCl 0.2g 、Na 2HPO 4 1.44g 、KH 2PO 4 0.24g ，定容于1L 纯水中。冷藏备用。

2. 胰蛋白酶配制。

称取0.25g 胰蛋白酶干粉，溶解于100mL 的PBS 中，0.22μm 微孔滤膜过滤除菌后，4℃冷藏保存。

3. 培养液配制。

将10mL 胎牛血清加入到90mL 的RPMI1640培养基中，即得到含10%胎牛血清的1640培养基。

（二）贴壁细胞的传代培养

(1) 选取生长良好的贴壁细胞一瓶，在超净工作台中倒去瓶中的旧培养液，加入2mLPBS ，轻轻振荡漂洗细胞1次。

(2) 加入2mL0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化。在显微镜下观察细胞，待细胞单层收缩突起出现大量空隙时，加入5mL 含血清的培养液终止消化，轻轻吹打成细胞悬液并转移到离心管中。1000 r/min 离心5min 后。

(3) 小心弃去上清，加入一定体积的含血清培养基，轻轻吹打，制成单细胞悬液。

(4) 接种细胞。细胞一般以1:2或1:3进行传代，即一瓶细胞可以传为2~3瓶。

(5) 接种好的细胞，应在细胞培养瓶上做好标记，注明细胞名称、日期、操作者姓名。置于37℃ CO 2培养箱培养。

(6) 观察。细胞培养24h 后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。

（三）细胞计数

(1) 将血球计数板及血盖片擦拭干净，并在显微镜下观察确认。

(2) 取0.1mL 细胞悬液加入eppendorf 管中，另加入0.1mL 0.4%台盼蓝染液，吹打混匀后备用。

(3) 吸取足量的细胞悬液，小心加入血球计数板的计数室中，将计数板放在载物台上，10×物镜下对4个角亚区中已染色细胞（死细胞）和未染色细胞（活细胞）分别计数，并求平均值。

(4) 将细胞液移出，清洗计数板。

(5) 利用公式4

10⨯⨯=D N C 计算细胞密度。

(6) 计算细胞存活率，%100⨯=N V ，其中V 表示活细胞的比例即细胞存活率，N 表示活细胞数目，T 表示所有细胞数目。

（四）注意事项

1. 传代培养时要严格无菌操作，并防止细胞间交叉污染。

2. 计数时应正确加样，移液管和血球计数板都必须非常洁净。

3. 计数时，若有细胞位于线上，只计左边线和上边线的细胞，不计右边线和下边线

的细胞。

五、思考题

1. 查阅资料，写明所处理细胞系的种属、来源、特性等。

2. 计算传代培养过程中，离心前后的细胞数，以及离心后细胞的存活率。

3. 贴壁细胞和悬浮细胞在传代方法上有何不同？

4. 细胞培养过程中的有哪些要点？