shRNA抑制CLIC1基因表达对小鼠肝癌细胞株Hca-F生物学行为的影响

shRNA抑制CLIC1基因表达对小鼠肝癌细胞株Hca-F生物学行为的影响

大连医科大学

博士学位论文

shRNA抑制CLIC1基因表达对小鼠肝癌细胞株Hca-F生物学行为

的景程

姓名：李荣宽

申请学位级别：博士

专业：病理与病理生理学

指导教师：唐建武

201006

shRNA抑制CLIC 1基因表达对小鼠肝癌

细胞株Hca．F生物学行为的影响

博士研究生：李荣宽指导教师：

唐建武教授专业

名称：病理学与病理生理学

摘要

背景：转移潜能是恶性肿瘤最重要的生物学特征之一，也是肿瘤患者死亡率高、预后差的主要原因。对于上皮来源的恶性肿瘤，淋巴道转

移是其早期转移的主要方式，但确切机制目前仍不清楚。原发性肝癌

(primary carcinoma of the liver)是最常见恶性肿瘤之一，包括肝细胞癌

(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝内胆管上皮癌(intrahepatic

cholangiocarcinoma，IHCC)、肝细胞及胆管上皮细胞混合癌三种细胞类

型，其中90％以上为肝细胞癌。全世界每年新发约62．6万例HCC患者，

其中的半数以上病例发生在我国。同时，它也是恶性程度最高、致死率

最高的肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤死因第三位、我国恶性肿瘤死因第

二位。即便是经过根治性切除手术治疗，5年的复发转移率仍高达60％，

因此，揭示肝癌转移的分子机制及其关键调控环节，进而采取相应的干

预措施，将有助于减少、甚至避免病人术后发生复发转移，从而达到降

低死亡率的目的。

Hca．F和Hca．P是将小鼠肝癌细胞株H22在61 5小鼠体内反复接种和筛选后得到的一对来源于同一亲本细胞、但是淋巴道转移潜能显著

不同的小鼠肝癌腹水型细胞株。其中Hca．F具有高淋巴道转移潜能，接

种到6l 5小鼠体内后其淋巴结转移率超过70％，Hca．P是低转移潜能

的细胞株，其淋巴结转移率低于30％。通过对比研究二者的差异，可以

为我们揭示小鼠肝癌的淋巴道转移机制提供有益的参考。本课题组在前

期工作中已经应用不同的方法，对Hca．F和Hca．P这一对具有高低不通

淋巴道转移潜能的细胞株进行了一系列系统的研究。首先，利用抑制性

消减杂交技术(suppression substractive hybridization，SSH)及基因

芯片

(Genechip)高通量筛选(high throughput screen，HTS)技术得出了Hca．F

细胞和Hca．P细胞之间一系列差异表达基因，继而采用定量蛋白质组学技术建立了高低淋巴道

转移潜能小鼠肝癌细胞的荧光差异蛋白表达图

谱。在诸多差异基因和蛋白质中，细胞内氯离子通道1(chloride intracellular channel 1，CLICl)在Hca．F细胞中的表达都显著高于Hca．P 细胞，其中在mRNA水平(基因芯片)上，CLIC l在Hca．F细胞中的表达是其在Hca．P细胞中表达量的3．48倍，在蛋白水平(双向免疫荧光差异电泳)上，Hca．F中的CLICl表达量是Hca．P的1．6倍，提示CLICI可能与小鼠肝癌的淋巴道转移潜能相关。由于人类组织细胞中具有CLIC 1同源蛋白，因此，研究小鼠肝癌细胞株CLICl与淋巴道转移的关系，对人类肝癌淋巴道转移的防治必然具有重要意义。

CLICl是氯离子通道家族中的一员，又称NCC27，是一种氯离子通道蛋白。通常其在细胞中以两种形式存在：溶解于胞浆中的可溶型和结

合于胞膜上的膜结合型。研究表明CLICl的作用不仅局限于细胞内外离子的运输，而且和许多疾病，尤其是肿瘤性疾病有密切的关系。有学者

发现CLIC l在乳腺癌、肺癌、肝细胞癌、胆囊癌、胃癌以及大肠癌等多种肿瘤细胞中表达明显增强，同时发现其与胃癌和胆囊癌的淋巴结侵袭

能力显著相关，提示CLIC l可能是参与肿瘤发生及淋巴道转移的重要基因之一。本研究以CLICl为研究对象，探索其在Hca．F细胞株淋巴道转移过程中的作用。经检索，目前国内外尚无CLIC l与肝癌淋巴道转移关系的研究报道。

目的：1．在蛋白质水平上比较CLICl在淋巴道转移潜能不同的小鼠肝癌细胞系Hca．F和Fca．P中的表达，为进一步研究肝癌淋巴道转移的机制奠定基础。2．构建pGPU6／GFP／Neo—shRNA表达载体，稳定转染Hca．F细胞，得到CLICl的表达被明显下调的Hca．F细胞株。3．对比研究小鼠肝癌细胞株Hca—F在CLICl表达水平下调前后其细胞增殖能力、细胞周期与凋亡情况、细胞迁移和侵袭能力等方面的变化，探讨CLICl基因的表达对小鼠肝癌细胞生物学行为的影响。

方法：1．采用蛋白免疫印迹(Western Blotting)方法检测Hca-F和Hca．P细胞株中CLICl的表达差异。2．依据Gene Bank中小鼠CLICl基因序列设计合成3条shRNA的DNA模板的两条单链，分别命名为shRNA．1、shRNA．2、shRNA．3，同时设计shRNA．无关序列作为阴性对

照(negative control，NC)。进而与pGPU6／GFP／Neo质粒构建表达载体，分别命名为pGPU6／GFP／Neo．shRNA-l、pGPU6／GFP／Neo—shRNA-2、pGPU6／GFP／Neo．shRNA．3、pGPU6／GFP／Neo．shRNA—NC。对三条pGPU6／GFP／Neo．shRNA表达载体经测序鉴定，结果与我们设计的三条shRNA序列以及Gene Bank中的序列相比对，确定序列无误，将三组

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