转录组ref流程工作手册
建立血小板转录组测序流程
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使用抗凝剂（如 EDTA）防止血液凝固。
转录组Denovo手册(无答案)
对于初级分析的项目，只需要给合作伙伴提供过滤后的数据即可，所以会对过滤后的数 据做dt1h LReenagdt2h
N3Z5123 FUNzPTEARAA 503060871000;536871 5725.71;52. 99.9971;99. 75 75
确定的？我们所说的插入片段长度是指 括了 read1 和 read2 本身的长度？
read1
和
read2
之间没有测到的那一段的长度还是包
1112..什解么释是Soilnedxeax测测序序中，几进个行关in键de的x技测术序：的边主合要成目边的测是序什（么S？BS），可逆阻断技术和桥式 。 PCR
2.信息分析流程：
软件（Conesa, A., S. Gotz, et al. (2005). "Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization 得到 的 and analysis in functional genomics research." Bioinformatics 21(18): 3674-6.) Unigene
Unigene
相似根性的据蛋KE白G，G从注而释得信到息该我U们n能ige进ne一的步蛋得白到功U能ni注ge释ne信的息P。athway 注释。
统计我，如们将下图Un所ig示en：e 和 COG 数据库进行比对，预测 Unigene 可能的功能并对其做功能分类
根据nr注释信息我们能得到GO功能注释。我们根据nr注释信息，使用 （ ） Blast2GO 2.3.5
本节问题： 1.Q20 是什么意思？ 2.BMS 系统上给出的 Q20%值是如何计算出来的？ 3.转录组暂时执行数据质量标准是怎样的？你有什么更好的建议（拿出自己的测试数据）？ 4.在统计数据信息时，read1 和 read2 长度相等吗？ 5.read每个碱基测序错误率的分布如何？read测序长度增加有什么好处？为什么SOAP比对 的时候允许 3’端有更多的错配？ 6.如何根据 BMS 上的碱基频率分布图查找建库或测序失败的问题？
转录组测序建库流程
转录组测序建库流程英文回答：Transcriptome sequencing, also known as RNA-Seq, is a powerful tool used to study the expression and regulation of genes in an organism. It involves the construction of a cDNA library from RNA samples, which is then sequenced using high-throughput sequencing technologies. The process of transcriptome sequencing involves several steps, including RNA extraction, library preparation, sequencing, and data analysis.Firstly, RNA extraction is performed to isolate the RNA molecules from the biological sample of interest. This can be done using various methods, such as phenol-chloroform extraction or column-based purification kits. The quality and integrity of the RNA are crucial for the success of the subsequent steps.Next, the extracted RNA is converted into cDNA througha process called reverse transcription. This involves the use of reverse transcriptase enzymes to synthesize complementary DNA (cDNA) from the RNA template. The cDNA is then fragmented into smaller pieces to facilitate sequencing.After fragmentation, adapters are added to the cDNA fragments. These adapters contain sequences that are recognized by the sequencing platform and enable the attachment of the fragments to the sequencing flow cell. This step is essential for the subsequent sequencing process.Once the library preparation is complete, the cDNA fragments are ready for sequencing. High-throughput sequencing platforms, such as Illumina or Ion Torrent, are commonly used for transcriptome sequencing. These platforms generate millions of short reads that represent the cDNA fragments.The generated sequencing data then undergoes a series of bioinformatics analyses. This includes quality control,read alignment to a reference genome or transcriptome, and quantification of gene expression levels. Various software tools and pipelines are available for these analyses, such as FastQC, STAR, and DESeq2.The results of transcriptome sequencing can provide valuable insights into gene expression patterns, alternative splicing events, and the identification of novel transcripts. This information can be used to study gene function, identify biomarkers, and understand disease mechanisms.中文回答：转录组测序，也称为RNA-Seq，是一种用于研究生物体基因表达和调控的强大工具。
华大转录组测序内部培训资料
（内部资料，请勿外传）动植物转录组（Transcriptome ）产品说明书科技服务体系 动植物研究方向版本信息：2011年07月08日目录1产品概述 (1)1.1 什么是转录组测序 (1)1.2 转录组测序的产品功能 (1)1.3 转录组测序产品优势 (1)1.4 转录组测序产品发展史 (1)1.5 项目执行时间 (3)1.6 产品交付结果 (3)2转录组测序研究方法 (4)2.1 产品策略 (4)2.2 样品准备 (5)2.2.1 RNA样品要求 (5)2.2.2 RNA样品送样标准 (6)2.2.3 RNA提取的组织用量建议 (6)2.3 样品运输要求 (7)2.3.1 样品包装 (7)2.3.2 样品标识 (8)2.3.3 样品运输条件 (8)2.4 文库的构建及测序 (9)2.4.1 实验流程 (9)2.4.2 测序及数据处理 (10)2.5 转录组生物信息学分析 (10)2.5.1 没有参考序列的转录组De novo (10)2.5.2 有参考序列的转录组Re-sequencing (18)2.5.3 参考文献 (24)3成功案例 (25)3.1 华大成功案例 (25)3.2 相关文献解读 (26)1产品概述1.1什么是转录组测序？转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA。
转录组测序是指用新一代高通量测序技术对物种或者组织的转录本进行测序并得到相关的转录本信息。
1.2转录组测序的产品功能1.获得物种或者组织的转录本信息；2.得到转录本上基因的相关信息，如：基因结构，功能等；3.发现新的基因；4.基因结构优化；5.发现可变剪切；6.发现基因融合；7.基因表达差异分析。
1.3转录组测序产品优势覆盖度高：检测信号是数字信号，几乎覆盖所有转录本；检测精度高：几十到数十万个拷贝精确计数；分辨率高：可以检测到单碱基差异，基因家族中相似基因及可变剪切造成的不同转录本的表达；完成速度快：整个项目周期只需要50个工作日时间；成本低：基本上每个实验室可以承担相关研究经费。
转录组测序 步骤 流程
转录组测序步骤流程Transcriptome sequencing, also known as RNA-Seq, is a powerful technique used to study the entire set of RNA molecules transcribed by an organism. It provides valuable insights into gene expression levels, alternative splicing, and novel transcript discovery. The process oftranscriptome sequencing involves several steps, which Iwill explain in detail.Firstly, the RNA molecules need to be isolated from the biological sample of interest. This can be done using various methods, such as using a commercial RNA extraction kit or employing a phenol-chloroform extraction protocol. The quality and integrity of the RNA are crucial at this stage to ensure accurate downstream analysis.Once the RNA is extracted, it needs to be convertedinto complementary DNA (cDNA) through reverse transcription. This step involves the use of reverse transcriptase enzyme and random primers or oligo(dT) primers. The cDNA synthesisallows for the amplification of RNA molecules and reduces the presence of ribosomal RNA, which is highly abundant and can hinder sequencing efficiency.Next, the cDNA library preparation is carried out. This involves fragmentation of the cDNA and the addition of sequencing adapters, which contain barcode sequences for sample identification. The fragmented cDNA is then subjected to size selection to obtain the desired insert size range for sequencing. This step ensures that only fragments within the desired range are sequenced, improving the quality of the data obtained.After library preparation, the sequencing step takes place. This can be done using various sequencing platforms, such as Illumina, Ion Torrent, or PacBio. The choice of platform depends on factors like sequencing depth, read length, and cost considerations. During sequencing, the cDNA fragments are amplified on a solid support and undergo cycles of nucleotide incorporation, resulting in the generation of millions of short reads.Once the sequencing is complete, the generated reads need to be processed and aligned to a reference genome or transcriptome. This step involves bioinformatics analysis, where the reads are mapped to the reference using alignment algorithms. This allows for the identification of known transcripts and the discovery of novel transcripts.Following alignment, differential gene expression analysis can be performed to compare gene expression levels between different samples or conditions. This analysis involves statistical methods to identify genes that are significantly upregulated or downregulated. It provides valuable insights into the biological processes and pathways that are affected under different conditions.In conclusion, transcriptome sequencing is a multi-step process that involves RNA extraction, cDNA synthesis, library preparation, sequencing, alignment, and analysis.It provides a comprehensive view of gene expression and transcriptome dynamics. By understanding the steps involved in transcriptome sequencing, researchers can gain valuable insights into gene regulation and biological processes.转录组测序，也被称为RNA-Seq，是一种用于研究生物体转录的所有RNA分子的强大技术。
有参考基因组的转录组生物信息分析模板
v1.0 可编辑可修改一、生物信息分析流程获得原始测序序列(Sequenced Reads)后，在有相关物种参考序列或参考基因组的情况下，通过如下流程进行生物信息分析：二、项目结果说明1 原始序列数据高通量测序(如illumina HiSeq TM2000/MiSeq等测序平台)测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)，我们称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储，其中包含测序序列(reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息。
FASTQ格式文件中每个read由四行描述，如下：@EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACGGCTCTTTGCCCTTCTCGTCGAAAATTGTCTCCTCATTCGAAACTTCTCTGT+@@CFFFDEHHHHFIJJJ@FHGIIIEHIIJBHHHIJJEGIIJJIGHIGHCCF其中第一行以“@”开头，随后为illumina 测序标识符(Sequence Identifiers)和描述文字(选择性部分)；第二行是碱基序列；第三行以“+”开头，随后为illumina 测序标识符(选择性部分)；第四行是对应序列的测序质量(Cock et al.)。
illumina 测序标识符详细信息如下：第四行中每个字符对应的ASCII值减去33，即为对应第二行碱基的测序质量值。
如果测序错误率用e表示，illumina HiSeq TM2000/MiSeq的碱基质量值用Qphred表示，则有下列关系：公式一：Qphred = -10log10(e)illumina Casava 版本测序错误率与测序质量值简明对应关系如下：2 测序数据质量评估测序错误率分布检查每个碱基测序错误率是通过测序Phred数值(Phred score, Q)通过公式1phred转化得到，而Phred 数值是在碱基识别(Base Calling)过程中通过一种预测碱基判别发生错误概率模型计算得到的，对应关系如下表所显示：illumina Casava 版本碱基识别与Phred分值之间的简明对应关系测序错误率与碱基质量有关，受测序仪本身、测序试剂、样品等多个因素共同影响。
转录组ref流程工作手册
转录组ref流程工作手册转录组ref流程工作手册一、Reference 流程生物学原理1.1 实验流程图一：转录组实验流程当我们得到样品时，必须对其测序，才能得到分析所需的数据。
测序基本过程：提取样品总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA（若为原核生物，则用试剂盒去除rRNA后进入下一步）。
加入fragmentation buffer 将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H 和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB 缓冲液洗脱之后做末端修复并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，使用建好的测序文库进行测序。
得到RNA的序列后，又可以找到它的参考序列（物种本身的基因、基因组）时，可以用reference流程对数据进行详细的分析。
Reference后面所有的流程都是基于参考序列进行的，所以选择正确的参考序列十分重要。
1.2信息分析流程得到测序序列后，即可利用比对软件，将所测序列比对到参考基因或基因组上，并进行后续分析，信息分析流程图如下：图二：转录组信息流程1.2.1原始fq序列简介测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据，我们称之为raw data或raw reads，结果以fastq文件格式存储，fastq文件为用户得到的最原始文件，里面存储reads的序列以及reads的测序质量。
在fastq格式文件中每个read由四行描述：@read IDTGGCGGAGGGATTTGAACCC+bbbbbbbbabbbbbbbbbbb每个序列共有4行，第1行和第3行是序列名称(有的fq文件为了节省存储空间会省略第三行“＋”后面的序列名称)，由测序仪产生；第2行是序列；第4行是序列的测序质量，每个字符对应第2行每个碱基，第四行每个字符对应的ASCII值减去64，即为该碱基的测序质量值，比如h 对应的ASCII值为104，那么其对应的碱基质量值是40。
illumina转录组测序简明实验流程（PE-oligodTNEB）
illumina转录组测序简明实验流程（PE-oligodTNEB）illumina 转录组测序简明实验流程一、实验基本流程图mRNA Library Construction二、mRNA建库流程1.材料准备1.2.1.3.2.样品准备和QC选择质量合格的Total RNA作为mRNA测序的建库起始样品，其质量要求通过Agilent 2100 BioAnalyzer检测结果RIN≥7，28S和18S的RNA 的比值大于或等于1.5：1，起始量的要求范围是0.1∽1ug。
用QUBIT RNA ASSAY KIT对起始的Total RNA进行准确定量。
3.建库实验步骤3.1.mRNA纯化和片段化3.1.1.mRNA纯化纯化原理是用带有Oligod(T)的Beads对Total RNA中mRNA进行纯化。
3.1.2.mRNA片段化3.2.1st Strand cDNA 合成3.3.2nd Strand cDNA 合成根据下表制备反应体系，然后在PCR仪上运行Program3，然后将第2链cDNA合成产物用144uL AMPure XP Beads进行纯化，最后用60μL的Nuclease free water进行重悬，取出55.5μL以备下一步使用;3.4.Perform End Repair/dA-tail3.5.Adaptor Ligation根据下表制备反应体系，然后在PCR仪上运行Program5、Program6，然后100uL AMPure XP Beads进行纯化后用52.5μL的Resuspension Buffer进行重悬，再用50uL AMPure XP Beads3.6.PCR扩增根据下表制备反应体系，然后在PCR仪上运行Program7，然后再45μL用AMPure XP Beads 进行纯化，最后用23μL的Resuspension Buffer进行重悬，取出20μL以备下一步使用；3.7. PCR 产物质控用QUBIT DNA HS ASSAY KIT 对PCR 产物进行准确定量。
反转录实验步骤总结
反转录实验步骤总结⼀．前期对⼀些重要试剂⽤量的评估（以mRNA 100ng为计算标准）1.如果原材料0.2g（约5株2周苗期的苗），分成两管，每管0.1g，则分别加TRIzol 2ml（共4ml），也就是说，每个⽣物样品作两次⽣物重复的话。
每瓶TRIzol有100ml，所以可以做25个材料。
2.⼀个材料作⼆次⽣物重复，需要4根Zymo RNA纯化柱。
⼀个标准Zymo Kit有100个反应柱⼦，也就是可以做25个材料。
3.RNA fragmentation完整Kit可以做100个样品。
4.mini/midi Kit可以做12个柱⼦反应。
⼆．前期准备⼯作1.DEPC处理的Rnase free⽔；2.RNA专⽤的75%⼄醇、异丙醇、三氯甲烷和NaOAc；3.220℃烘烤>6⼩时的研磨棒、器⽫和药匙；4.⾜够的液氮；三．其它⼩知识理论上，每100mg材料可以获得100-200ug total RNA，纯化后获得的mRNA的量约为total RNA量的1/100。
四．具体实验步骤（⼀）TRIzol提取总RNA1．先将研磨棒等⽤液氮预冷，然后加液氮粉碎叶⽚（组织），越细越好。
2．准备好TRIzol管，每50-100mg材料加⼊1mlTRIzol（材料体积应⼩于TRIzol体积的10%），振荡或⽤移液器打⾄⽆⼤颗粒（震荡2分钟可）。
3．悬液室温放置>5min(可30min放置)。
再加⼊1/5V（起始体积）氯仿，剧烈振荡1-2分钟，室温放置5min。
然后13000rpm 2-8℃离⼼30 min。
4．吸取⽆⾊上清（约有1/2的起始体积量），加⼊1/2 V（起始体积）异丙醇。
室温放置10 min。
然后13000rpm 2-8℃离⼼30 min。
5．弃上清液。
沉淀物以75%⼄醇洗涤（>1ml⼄醇/1mlTRIzol）。
然后13000rpm 2-8℃离⼼10min。
6．空转⼀次，吸去上清。
7．适当⼲燥5 min。
原始的转录组测序结果处理流程
原始的转录组测序结果处理流程
原始的转录组测序结果处理流程包括以下步骤：
1. 质量控制：使用软件如FastQC对原始测序数据进行质量评估，包括检查测序质量、序列长度分布、GC含量等。
2. 去除低质量序列：根据质量评估结果，使用软件如Trimmomatic 或Cutadapt去除低质量的测序序列、接头序列和低质量碱基。
3. 序列比对：使用软件如Bowtie、STAR或HISAT2将已处理的测序序列比对到参考基因组或转录组序列上。
4. 拼接转录本：使用软件如StringTie或Cufflinks对比对结果进行转录本拼接，得到基因和转录本的注释信息。
5. 差异表达分析：使用软件如DESeq2、edgeR或limma对不同样本之间的基因表达水平进行差异分析，找出差异表达的基因。
6. 功能注释与富集分析：对差异表达基因进行GO、KEGG等功能注释和富集分析，了解差异表达基因的生物学功能和通路。
7. 可变剪接分析（可选）：使用软件如rMATS或MAJIQ对转录组数据中的可变剪接事件进行分析，探索不同样本之间的剪接差异。
8. 数据可视化：使用软件如R、Python或基因组浏览器将分析结果进行可视化展示，如热图、曲线图、柱状图等。
9. 结果解读：根据分析结果，对差异表达基因和功能富集结果进行解读，探索转录组的生物学意义和可能的调控机制。
总结起来，原始的转录组测序结果处理流程包括质量控制、序列去除、比对、拼接、差异分析、功能注释与富集分析、可变剪接分析、数据可视化和结果解读等步骤。
转录组学分析流程及常用软件介绍
--bowtie-path #bowtie2路径
RSEM用法
• 3.[rsem-calculate-expression]
rsem-calculate-expression [options] upstream_read_file(s) reference_name sample_name rsem-calculate-expression [options] --paired-end upstream_read_file(s) downstream_read_file(s) reference_name sample_name
RSEM简介
• 特点 • 可以处理ambiguous reads • 不依赖参考基因组文件
RSEM用法
• RSEM的计算主要分三步
帮助文档：/rsem/README.html#usage
1. [extract-transcript-to-gene-map-from-trinity] 2. [rsem-prepare-reference]
-p 线程数；defualt 1 -G 结构注释文件
• Tophat2 其他可选参数
比对——Tophat2
比对——Tophat2
• Tophat2 示例
修改参数：将mismatch设置为3
tophat2 -p 1 -G /BJPROJ/RNA/rna_test/TR_bioinfomatics1/prepare/sunfuming/lession5/yo ucan/use.gtf -o test use.fa /BJPROJ/RNA/rna_test/TR_bioinfomatics1/prepare/sunfuming/lession5/yo ucan/pair_1.fq /BJPROJ/RNA/rna_test/TR_bioinfomatics1/prepare/sunfuming/lession5/yo ucan/pair_2.fq --library-type fr-unstranded -N 3 --read-edit-dist 3
转录组测序 步骤 流程
转录组测序步骤流程英文回答：Transcriptome sequencing, also known as RNA sequencing (RNA-seq), is a powerful technique used to study the transcriptome of an organism. The process involves several steps that are essential for obtaining accurate andreliable results.Firstly, the RNA molecules are extracted from the cells or tissues of interest. This step is crucial as it ensures that the RNA represents the gene expression profile of the sample. Various methods can be used for RNA extraction, such as phenol-chloroform extraction or commercial kits.Once the RNA is extracted, it needs to be purified to remove any contaminants, such as genomic DNA or proteins. This purification step is important to ensure that the sequencing reads obtained are specific to the RNA molecules and not from other sources.Next, the purified RNA is converted into complementary DNA (cDNA) through a process called reverse transcription. This step involves the use of reverse transcriptase enzyme to synthesize cDNA from the RNA template. The cDNA represents a copy of the RNA molecules and can be used for sequencing.After obtaining the cDNA, it is then fragmented into smaller pieces to facilitate sequencing. This fragmentation can be achieved through physical methods, such as sonication or enzymatic methods, such as restriction enzyme digestion. The fragmented cDNA is then ready for sequencing library preparation.Library preparation involves adding specific adapters to the fragmented cDNA molecules. These adapters contain sequences that are recognized by the sequencing platform and allow for the attachment of the cDNA fragments to the sequencing flow cell. This step is crucial for the subsequent sequencing process.Once the library is prepared, it is loaded onto the sequencing platform, such as Illumina or PacBio. The sequencing process generates millions of short reads or long reads, depending on the platform used. These reads represent fragments of the cDNA molecules and are used to reconstruct the original RNA sequences.After sequencing, the reads are aligned to a reference genome or transcriptome to determine their origin and quantify gene expression levels. This step involves bioinformatics analysis, where specialized software tools are used to process the sequencing data and generate meaningful results.Finally, the results of the transcriptome sequencing experiment can be interpreted to gain insights into gene expression patterns, alternative splicing events, and other transcriptomic features. This information can be used to study gene function, identify biomarkers, or understand disease mechanisms.中文回答：转录组测序，也被称为RNA测序（RNA-seq），是一种用于研究生物体转录组的强大技术。
转录组数据分析流程及原理
转录组数据分析流程及原理Transcriptome data analysis is a critical process in modern biological research. It involves the study of all the RNA molecules present in a particular cell or tissue at a given time. This type of analysis allows researchers to gain insights into the gene expression patterns and regulatory mechanisms that govern various biological processes. 转录组数据分析是现代生物研究中至关重要的过程。
它涉及研究在特定时间内存在于特定细胞或组织中的所有RNA分子。
这种分析方式使研究人员能够了解各种生物过程的基因表达模式和调节机制。
One of the key steps in transcriptome data analysis is the generation of high-throughput sequencing data. This involves using next-generation sequencing technologies to sequence the RNA molecules present in a sample. The resulting data can be massive and complex, requiring sophisticated bioinformatics tools and algorithms to process and analyze. 转录组数据分析的关键步骤之一是产生高通量测序数据。
转录组测序的流程
转录组测序的流程转录组测序是一种用于研究RNA转录本的高通量测序技术，它可以帮助科研人员了解生物体内部的基因表达情况，从而揭示基因调控、代谢途径等重要生物学过程。
本文将介绍转录组测序的流程，包括样本准备、RNA提取、建库、测序和数据分析等步骤。
1. 样本准备。
转录组测序的第一步是样本准备，样本的选择和处理对后续的实验结果至关重要。
首先需要确定研究的对象，是细胞、组织还是整个生物体，然后采集样本并进行保存。
在采集样本的过程中，需要注意避免RNA的降解和污染，可以使用RNAlater等试剂来稳定RNA。
此外，还需要记录样本的相关信息，如采集时间、处理方法等。
2. RNA提取。
RNA提取是转录组测序的关键步骤，它可以从样本中纯化出RNA，并去除DNA、蛋白质和其他杂质。
常用的RNA提取方法包括酚/氯仿法、硅胶柱法和磁珠法等。
在进行RNA提取时，需要注意保持样本的完整性和纯度，避免外源性RNA的污染。
此外，还需要对提取得到的RNA进行定量和质量检测，确保其可以用于后续的实验。
3. 建库。
建库是将提取得到的RNA转录本转化为可以进行测序的DNA文库的过程。
建库的关键步骤包括RNA的反转录、cDNA合成、末端修复、连接接头、文库扩增和纯化等。
在建库的过程中，需要注意避免外源DNA的污染，确保文库的纯度和完整性。
此外，还需要对建库得到的DNA文库进行定量和质量检测，以确保其可以用于高通量测序。
4. 测序。
建库完成后，就可以进行高通量测序了。
目前常用的转录组测序技术包括RNA-seq和全长转录组测序。
RNA-seq可以对RNA转录本进行定量和差异表达分析，全长转录组测序可以获取RNA的全长序列信息。
在进行测序时，需要选择合适的测序平台和测序深度，确保可以获得足够的数据量用于后续的数据分析。
5. 数据分析。
测序数据的分析是转录组测序的最后一步，它包括数据的质控、比对、表达定量和差异分析等。
在进行数据分析时，需要选择合适的分析软件和算法，对数据进行准确的处理和解释。
转录组实战讲解第四讲之转录本构建和长非编码RNA鉴定
• 附录：运行命令
区分编码非编码的工具
• 已有的区分编码RNA和非编码RNA的工具
• CPC
• 算法基于预测基因的开放阅读框 • 特点：模型不能跨物种，不适用高通量测序得到的RNA
• PhyloCSF
• 算法基于物种间的保守性 • 特点：依赖于基因组，计算耗时
结构、表达量、 比例的变化
功能注释
3
Fusions Junctions
测序数据
测序评估及 低质量过滤
和参考基因 组比对
转录本重构
编码基因表 达注释
编码基因差 异(特异)表达
GO功能显著 Pathway显著
性富集
性富集
功能富集网 络图
Genome Browser 可视化
长非编码鉴 定
这一堂课 关注内容
• 评价指标
• 多外显子比率 • 转录本长度 • 转录本的可变剪接数目 • 对已知基因的覆盖程度
转录本构建评估
基因数目 5-8万
转录本数 目
>10万
多外显子比 多外显子转
率
录本数目
30~50%
5万
对已知编码基因的覆盖程度: >60%
• 步骤三：转录本的构建
• 构建流程详解 • 转录本构建效果评估
长非编码RNA测序分析实战讲解之 转录本构建和长非编码RNA鉴定
概要
• 步骤三：转录本的构建
• 构建流程详解 • 转录本构建效果评估
• 步骤四：长非编码RNA的鉴定
• 鉴定流程详解 • 关键:如何判断编码或是非编码基因
• 附录：运行命令
转录组分析的通用套路
鉴定
有多少RNA
转录组测序具体详细流程
转录组测序具体详细流程转录组测序是一种高通量测序技术，用于研究特定生物体内的所有转录本。
这种技术可以帮助我们了解基因表达的调控机制，以及在不同生理和病理状态下基因表达的变化。
下面将详细介绍转录组测序的具体流程。
1. RNA提取需要从样本中提取RNA。
这可以通过使用商业化RNA提取试剂盒或自制试剂盒来完成。
提取的RNA应该是高质量的，没有降解或污染。
2. RNA质量评估为了确保RNA的质量，需要对提取的RNA进行质量评估。
这可以通过使用生物分析仪或琼脂糖凝胶电泳来完成。
RNA的完整性和纯度是评估RNA质量的两个重要指标。
3. RNA文库制备RNA文库制备是转录组测序的关键步骤。
在这个步骤中，需要将RNA转录成cDNA，并将其连接到测序适配器上。
这可以通过使用商业化RNA文库制备试剂盒或自制试剂盒来完成。
4. 文库质量评估为了确保文库的质量，需要对文库进行质量评估。
这可以通过使用生物分析仪或PCR扩增来完成。
文库的大小和纯度是评估文库质量的两个重要指标。
5. 测序文库制备完成后，需要进行测序。
转录组测序可以使用Illumina HiSeq、NovaSeq或PacBio等高通量测序平台来完成。
在测序过程中，需要对测序数据进行质量控制和过滤，以确保测序数据的质量。
6. 数据分析需要对测序数据进行数据分析。
这可以通过使用不同的生物信息学工具和软件来完成。
数据分析的目的是识别差异表达基因、功能注释和通路分析等。
转录组测序是一种强大的技术，可以帮助我们了解基因表达的调控机制和在不同生理和病理状态下基因表达的变化。
通过上述步骤的详细介绍，我们可以更好地理解转录组测序的具体流程。
反转录PCR操作手册1
RT-PCR实验步骤一．实验器具：1.移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl2.吸头：1ml、200μl、20μl3.匀浆管：5ml4.EP管：1.5ml、500μl、200μl5.试剂瓶：棕色试剂瓶(广口，放75%乙醇)6.量筒：100ml7.容量瓶：1000ml8.试管架：5ml、1.5ml、20μl9.铝制饭盒：1-2个10.大瓷缸：1个11.锡泊纸：一卷12.卷纸：2卷13.三角烧瓶：带盖，稍大二．实验器具处理1.塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中(注意：小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入DEPC水)，过夜后取出(注意：DEPC水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的DEPC物品甩干，枪头装入枪头盒后甩干，EP管和匀浆管装入饭盒后甩干，然后在37度孵箱烘干)。
高压后烤干备用。
如果DEPC处理过的物品时间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。
2.玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，先泡1‰DEPC过夜，再蒙锡纸烤干备用。
3.匀浆器：(包括剪刀、镊子)先洗净后，超声消毒即可(不需要泡DEPC)。
三．试剂配制1．DEPC水：吸出1ml DEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1‰DEPC水，并充分振荡混匀备用。
2．75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(DEPC水需先高压，高压时注意：1.装DEPC水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在40-45分钟，所以水要适当多加一点；3.高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出)。
3．异丙醇：放入棕色瓶中。
4．氯仿：放入棕色瓶中。
5．琼脂糖四．缓冲液配制1．电泳缓冲液(5×TBE贮存液)：Tris 54g、硼酸 27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、加蒸溜水至1000ml。
使用时，将5×TBE稀释10倍成0.5×TBE就可以在电泳时使用(工作浓度) 2．上样缓冲液(6×缓冲液，4℃保存)：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油五．琼脂糖凝胶配制1．1.0%：1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾(如果首次煮胶，一定要煮透，以不出现泡沫为标志)，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min(可以放入4度冰箱加快琼脂糖凝固)后现进行电泳。
反转录及荧光定量步骤
度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定
量的标准曲线。本制品不影响反转录和 PCR 反应，用其稀释后的样品可直接使用。EASY Dilution
也可以单独购买（Code No.9160）。
注意：EASY Dilution 请与本公司 Real Time PCR 试剂组合使用，对于其他公司的同类制品的适用
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● 制品说明
为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有 cDNA 作为模板检出的先决条件，但 Total RNA 中常常 混有基因组 DNA，并可以直接作为 PCR 反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。为了避免这 种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组 DNA 得不到扩增。但是，此方 法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存 在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本 方法。在这种情况下，我们常常需要对 Total RNA 样品进行 DNase I 处理，以除去残存的基因组 DNA。 而 DNase I 处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成 RNA 的降解和损失。 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 是可以除去基因组 DNA 进行 Real Time RT-PCR 反应的专 用反转录试剂。Kit 中使用了具有较强 DNA 分解活性的 gDNA Eraser，通过 42℃，2 min 即可除去基因 组 DNA。同时由于反转录试剂中含有抑制 DNA 分解酶活性的组分，经过 gDNA Eraser 处理后的样品可 以直接进行 15 min 的反转录反应合成 cDNA，因此，20 min 内即可迅速完成从基因组 DNA 去除到 cDNA 合成的全过程。 使用本制品合成的cDNA适用于SYBR® Green分析法和TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的，选择与 SYBR® Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）、Premix Ex Taq（Probe qPCR）等定量试剂组合使用。 注意：Takara Bio 使用 SYBR® Green I 作为研究试剂已得到 Molecular Probes Inc.的许可。SYBR®为
转录组技术的操作流程
4.数据分析过程中要注意选择合适的分析方法和参数，以确保结果的准确性和可靠性。
5.结果验证过程中要注意选择合适的验证方法和样本，以确保结果的准确性和可靠性。
6.结果验证：
qRT-PCR验证：使用定量实时PCR验证转录组数据的准确性。
蛋白质水平验证：使用Western blotting或其他方法验证基因表达的蛋白质水平。
注意事项：
1.样品制备过程中要注意避免RNA的应的效率和特异性。
2. cDNA合成：
反转录：使用反转录酶将RNA反转录成cDNA。
cDNA扩增：使用P以获得适合测序的长度。
接头连接：将接头连接到cDNA片段的两端，以便于后续的测序。扩增：使用PCR或其他方法扩增。
4.测序：
测序平台选择：选择适合的测序平台，如Illumina、Thermo Fisher Scientific等。
转录组技术是一种用于研究基因表达的技术，它可以帮助我们了解细胞或组织中哪些基因正在被转录成RNA，以及这些基因的表达水平如何。以下是转录组技术的一般操作流程：
1.样品制备：
细胞或组织收集：从感兴趣的生物体中收集细胞或ห้องสมุดไป่ตู้织样本。
RNA提取：使用适当的方法从细胞或组织中提取总RNA。
RNA质量检测：使用琼脂糖凝胶电泳或其他方法检测RNA的质量和完整性。
转录组技术的操作流程
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转录组ref流程工作手册一、Reference 流程生物学原理1.1 实验流程图一：转录组实验流程当我们得到样品时，必须对其测序，才能得到分析所需的数据。
测序基本过程：提取样品总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA（若为原核生物，则用试剂盒去除rRNA后进入下一步）。
加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H 和DNA polymerase I 合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，使用建好的测序文库进行测序。
得到RNA的序列后，又可以找到它的参考序列（物种本身的基因、基因组）时，可以用reference流程对数据进行详细的分析。
Reference后面所有的流程都是基于参考序列进行的，所以选择正确的参考序列十分重要。
1.2信息分析流程得到测序序列后，即可利用比对软件，将所测序列比对到参考基因或基因组上，并进行后续分析，信息分析流程图如下：图二：转录组信息流程1.2.1原始fq序列简介测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据，我们称之为raw data或raw reads，结果以fastq文件格式存储，fastq文件为用户得到的最原始文件，里面存储reads的序列以及reads的测序质量。
在fastq格式文件中每个read 由四行描述：@read IDTGGCGGAGGGATTTGAACCC+bbbbbbbbabbbbbbbbbbb每个序列共有4行，第1行和第3行是序列名称(有的fq文件为了节省存储空间会省略第三行“＋”后面的序列名称)，由测序仪产生；第2行是序列；第4行是序列的测序质量，每个字符对应第2行每个碱基，第四行每个字符对应的ASCII值减去64，即为该碱基的测序质量值，比如h 对应的ASCII值为104，那么其对应的碱基质量值是40。
碱基质量值范围为0到40。
表 1为Solexa测序错误率与测序质量值简明对应关系，具体计算公式如下：Q phred =-10 log10(e)表 1 Solexa测序错误率与测序质量值简明对应关系5% 13 M1% 20 T0.1% 30 ^0.01% 40 h1.2.2原始fq序列处理某些原始序列带有adaptor 序列，或含有少量低质量序列。
我们首先经过一系列数据处理以去除杂质数据，得到Clean reads。
按如下步骤进行处理：1.去除含adaptor的reads2.去除N的比例大于10%的reads3.去除低质量reads（质量值Q <= 5的碱基数占整个read的50％以上）4.获得 Clean reads原始序列数据经过去除杂质后得到的数据称为Clean reads，后续分析都基于Clean reads1.2.3比对使用短reads比对软件SOAP2/SOAPaligner{Li, 2009 #155}将clean reads分别比对到参考基因组和参考基因序列（允许两个碱基错配）。
通过这一步骤，我们可以将测序得到的reads对应到基因及基因组上，后续分析都是基于上述比对结果。
1.2.4基本生物信息分析结果基本信息分析结果包含以下内容：1 测序数据产量及与Reference 比对结果概述统计数据量的大小，得到测序数据产量；对soap结果进行处理得到测序数据与Reference序列比对的概况。
2 评价测序随机性在转录组实验过程中，首先要通过物理或化学方法将转录本打断成短片段，然后上机测序。
如果打断随机性差，reads偏向于来自基因特定区域，将会直接影响转录组的各项分析结果。
利用reads在基因上的分布来评价打断随机性。
由于不同参考基因有不同长度，我们把reads在基因上的位置标准化到相对位置（reads在基因上的位置与基因长度的比值），然后统计基因的不同位置比对上的reads数。
如果打断随机性好，reads在基因各部位应分布得比较均匀。
3 基因覆盖度、测序深度的分布基因测序覆盖度指每个基因被reads覆盖的百分比，其值等于基因中unique mapping reads覆盖的碱基数跟基因编码区所有碱基数的比值。
测序深度指基因被reads 覆盖的次数，其值等于reads覆盖到基因的碱基数与基因编码区所有碱基数的比值。
4 Reads 在参考基因组上的分布该分析主要是以图形方式概括给出Reads在基因组各个位置的分布情况，以及该位置基因的分布情况。
1.2.5高级生物信息分析结果高级生物信息分析包含以下结果：1 对基因结构进行优化通过比较测序结果和现有基因注释结果，对基因的5'端或3'端进行延长。
如图三所示，首先，将reads比对到基因组，提取基因组中被unique mapping reads覆盖的次数大于或等于某阈值（默认为2）且位置连续的区域作为转录活性区(Transcription Active Region, TAR，图中蓝色方块区域)；然后通过paired-end reads（图中紫色线条）将不同的TAR连接形成潜在的gene model；最后，通过比较潜在gene model与现有基因注释的差别，对基因的5'端和3'端进行延长（图中表现的仅是基因3’端发生延长的情况）。
图三：基因结构优化2 鉴定基因的可变剪切可变剪切使一个基因产生多个mRNA转录本，不同mRNA可能翻译成不同蛋白。
因此，通过可变剪切一个基因可能产生多个蛋白，极大地增加了蛋白多样性{Black, 2003 #6}{Stamm, 2005 #21;Lareau, 2004 #22}。
虽然已知可变剪切在真核生物中普遍存在，但我们可能仍低估了可变剪切的比例，最近，基于高通量测序的可变剪切研究在人{Pan, 2008 #3} {Wang,2008 #4} {Sultan, 2008 #5}、小鼠{Tang, 2009 #18;Mortazavi, 2008 #19}、拟南芥{Filichkin, #156}中发现了很多新的可变剪切事件。
在生物体内，主要存在7种可变剪切类型：A）Exon skipping; B）Intron retention;C) Alternative 5’splice site; D) Alternative 3’splice site; E) Alternative first exon; F) Alternative last exon; G) Mutually exclusive exon. 下图是我们利用高通量测序数据鉴别出来的7种可变剪切。
图中每个位置的ExP.Level等于log2(Reads数)。
图四：可变剪切示意图A) Exon Skipping. 基因AK070385发生可变剪切形成两种不同的转录本，第1种转录本比第2种转录组本多一个外显子(exon), 我们将这种外显子称为inclusive exon, inclusive exon两侧的两个外显子称为 constitutive exon。
B) Intron retention. 基因AK072590发生可变剪切形成两种不同的转录本，第2种转录本由retained Intron 与两侧的外显子一起形成新的外显子。
C) Alternative 5’ splice site. 基因AK067602发生可变剪切形成两种不同的转录本，它们的3’端剪切位点一致但5’端剪切位点不同。
D) Alternative 3’ splice site. 基因AK067602发生可变剪切形成两种不同的转录本，它们的5’端剪切位点一致但3’端剪切位点不同。
E) Alternative First Exon. 基因AK068497发生可变剪切形成两种不同的转录本，它们的不同之处在于第一个外显子不同。
F) Alternative Last Exon. 基因AK064908发生可变剪切形成两种不同的转录本，它们的不同之处在于最后一个外显子不同。
G) Mutually Exclusive Exon. 基因AK101575发生可变剪切形成两种不同的转录本，两转录本之间相同的外显子称为constitutive exon，不同的外显子称为inclusive exon，两个inclusive exon不能同时存在与同一转录本中，只能分别存在于不同转录本中。
下面，概述检测可变剪切的算法。
首先，我们使用软件“tophat”{Trapnell, 2009 #1}鉴定转录本的剪切位点(junction site)（使用软件默认参数），剪切位点给出了转录本不同外显子的边界及组合关系，如图五，我们检测到三个剪切位点，分别表明Exon1和Exon2连接在一起，Exon2和Exon3连接在一起，Exon1和Exon3连接在一起。
图五剪切位点示意图然后，通过分析同一基因的所有剪切位点，找出各种可变剪切事件。
分析算法如下：A) Exon Skipping.图六 Exon Skipping算法示意图转录本1和转录本2分别同时检测到如图六所示三个剪切位点，可认为转录本1的Exon1、Exon2和Exon3存在Exon Skipping剪切方式；转录本2的Exon1、Exon3和Exon4也存在Exon Skipping剪切方式。
B) Intron Retention图七 Intron Retention算法示意图如图七所示，1）检测到Junction 1的存在，表明在某个成熟mRNA中Exon1和Exon2之间的Intron被剪切下来；2）Exon1和Exon2之间的Intron有90％以上的区域均有unique mapping reads覆盖，说明在某个成熟mRNA中该intron被保留下来了（考虑到转录的exon通常也不是100％被reads覆盖到，所以在这里以90％为阈值）。
若同时满足以上两个条件，则认为该基因Exon1和Exon2之间存在Intron Retention的可变剪切方式。
C) Alternative 5’ Splice Site图八 Alternative 5’ Splice Site算法示意图如图八，一个转录本的Junction 1位点被检测到，并且Junction 2 和Junction 3 中有一个被检测到（它们共同点是3’剪切位点和Junction 1相同，但5’剪切位点和Junction 1不同），那么就认为Exon1和Exon2 存在Alternative 5’ Splice Site的剪切方式。