CAT过氧化氢酶活性测定方法
过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒说明书 紫外分光光度法
过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号:BC0200规格:50T/48S 产品内容：提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体100μL×3瓶，4℃保存。
产品说明：CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的H 2O 2清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。
H 2O 2在240nm 下有特征吸收峰，CAT 能够分解H 2O 2，使反应溶液240nm 下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT 活性。
试验中所需的仪器和试剂：紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水操作步骤：一、粗酶液提取：1、细菌、细胞或组织样品的制备细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500-1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（功率20%或200w，超声3秒，间隔10秒。
重复30次）；8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5-10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
二、CAT 测定操作1、分光光度计预热30min 以上，调节波长至240nm 处，蒸馏水调零。
2、CAT 检测工作液的配置：用时在每瓶试剂二（100μL）中加入20ml 试剂一，充分混匀，作为工作液；用不完的试剂4℃保存一周。
3、测定前将CAT 检测工作液37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴10min。
4、取1mLCAT 检测工作液于1mL 石英比色皿中，再加入35μL 样本，混匀5s；室温下立即测定240nm 下的初始吸光值A1和1min 后的吸光值A2。
过氧化氢酶的活性测定
过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法（滴定法、比色法）【原理】过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH－)R(Fe+3OH－)2+ H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2 5 H2O2+2 KMnO4+4H2SO4-------- 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4即可求出消耗的H2O2的量。
【仪器和用具】研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；容量瓶25ml×1。
【试剂】10% H2SO4；0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8；0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定；0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4•2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。
【方法】1.酶液提取取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2.取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入高温灭活酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。
实验九 过氧化氢酶(CAT)活性的测定
( AS 1 + AS 2 ) 2
作
1.写实验报告 写实验报告 2.问题： 问题： 问题
业：
（1）影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些 ）影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些? （2）过氧化氢酶与哪些生化过程有关 ）过氧化氢酶与哪些生化过程有关?
操作步骤：
3．测定
25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的 H2O2 ，每加完一管立即记时，并迅速倒入 石英测2min，记录数据。
4.按下式计算酶活性。
结果计算： 结果计算： 1min内 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。 减少0.1的酶量为1个酶活单位（ 0.1的酶量为 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)= 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
A240 = AS0∆A240 × VT
0.1 × V 1 × t × FW
式中： 式中： 加入煮死酶液的对照管吸光值； AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值； 加入煮死酶液的对照管吸光值 样品管吸光值； AS1, AS2—样品管吸光值； 样品管吸光值 Vt—粗酶提取液总体积 ml）； 粗酶提取液总体积（ Vt 粗酶提取液总体积（ml）； 测定用粗酶液体积（ V1—测定用粗酶液体积（ml）； 测定用粗酶液体积 ml）； FW—样品鲜重 样品鲜重（ FW 样品鲜重（g）； 0.1—A 每下降0.1 个酶活单位（ 0.1为 0.1 A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； 加过氧化氢到最后一次读数时间（ t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。 加过氧化氢到最后一次读数时间 min）。
操作步骤：
1 ． 称 取 植 物 材 料 0.3g ， 加 入 ， mo1 (pH7 0.1mo1/L 磷 酸 缓 冲 液 (pH7.0) ml(分三次加入 分三次加入， 6ml( 分三次加入 ， 最后两次用于 洗研钵) 在研钵中研磨成匀浆， 洗研钵)，在研钵中研磨成匀浆， 6000r 离心15 分钟， 15分钟 以 6000r ／ min 离心 15 分钟 ， 倾 出上清液。 出上清液。
过氧化氢酶(CAT)活性测定
过氧化氢酶(CAT)活性测定高锰酸钾滴定法(李合生．植物生理生化实验原理和技术[M]．北京：高等教育出版社．2000．165-167)一、原理过氧化氢酶(catalase，CA T)普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，它属于血红蛋白酶，含有铁，能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
22R(Fe OH3+－) R(Fe2+2 2)2+2 H O2＋O2因此，可以根据H2O2的消耗量或者O2的生成量测定该酶活力的大小。
在该体系中加入一定量(反应过量)的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。
5H2O2+2KMnO4+4H2SO45O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4二、材料、仪器设备及试剂(一)材料植物器官(花瓣、叶片等)(二)仪器设备冰箱、离心机、微量加样器(1ml、20μl、100μl)、移液管、精密电子天平、试管、研钵、剪刀、镊子、三角瓶、恒温水浴、容量瓶、酸式滴定管(三)试剂(1)10% H2SO4(2)0.2mol/L PH7.8磷酸缓冲液(3)0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4(AR)3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL，再用0.1mol/L草酸溶液标定(4) 0.1mol/L H2O2：取30% H2O2(大约等于17.6 mol/L)5.68mL，稀释至1000mL，用0.1mol/L高锰酸钾标准液(在酸性条件下)进行标定(5) 0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O12.607g，用蒸馏水溶解后，定溶1000mL。
三、试验步骤(一)酶液提取取植物材料2.5g，加入PH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25mL容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定溶，4000r/min离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
SOD、CAT、POD等的活性测试方法
SOD、CAT、POD等的活性测试方法SOD、CAT、POD测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4?12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4?2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。
（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。
（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。
（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。
酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入2ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。
2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。
CAT酶活性测定
植物组织中过氧化氢酶的活性测定—紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。
根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与用具】紫外分光光度计；冷冻离心机；研钵；容量瓶；刻度吸管；恒温水浴；分析天平【试剂】1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液2. 0.2mol/L H2O2溶液：30% H2O2 溶于磷酸缓冲液中，定量至250ml。
3.0.05 mol/LTris-Hcl缓冲液（）【材料】正常生长或经逆境处理的新鲜植物组织【方法步骤】1.酶液提取：称取剪碎混匀的植物样品（如叶片等）1.00g置与预冷的研钵中，加入适量预冷的磷酸缓冲液和少量石英砂冰浴研磨成匀浆后，转入10ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到10ml。
取提取液5ml于离心管中，在4℃、15000g下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
4℃下保存备用。
活性测定（1）取10ml具塞试管，加2ml酶提取液于沸水浴中加热煮死，冷却备用。
（2）取10ml具塞试管，3支为测定管（3个重复），1支为对照，按下表加入试剂：表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表将上述4支试管于25℃水浴中预热3min后,逐管加入L的H2O2溶液，每加完一管立即在紫外分光光度计上测定A240（蒸馏水调零），每隔30s读数一次，共测3min,记录4支试管的测定值。
（需用石英比色杯）3.结果计算：以1min内A240降低（三支测定管的平均值）的酶量为1个酶活单位（u），先求出3支测定管各自1min内A240降低值，按下式计算CAT活性。
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=FW t V .V A T⨯⨯⨯⨯124010∆式中 ∆A 240 = A S0－—A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值；A S1, A S2,As 3—样品测定管吸光值； Vt —酶提取液总体积（ml ）； V 1—测定时用酶液体积（ml ）； FW —样品鲜重（g ）；—A 240每下降为1个酶活单位（u ）； t —加过氧化氢到最后一次读数时间（min ）。
过氧化氢酶(CAT)酶活测定方法
过氧化氢酶酶活测定方法
一配溶液:
1. 1.5% NaBO3·4H2：
称取1.5g NaBO3·4H2O溶于100ml纯水
2. 0.067M 磷酸盐缓冲：
称取磷酸氢二钠 2.398g溶于100ml纯水，另称取磷酸二氢钠 1.05g 溶于100ml 纯水中，按配方配置成PH为6.8的PBS
3. 1M硫：
10.87ml浓硫酸加入200ml纯水中
4. 0.05M高锰：
0.79g高锰酸钾溶于100ml纯水中。
5. HCl溶液：调PH
二仪器：37°水浴箱，，滴定管，PH试纸，移液器，15ML的离心管，烧杯三步骤：
1.预先用HCL将pH调至6.8的1.5%NaBO3·4H2O 8mL加入含有1.5mL
0.067M ph6.8的磷酸盐缓冲液的烧杯中。
2.在37℃下保持20min后，实验组加入0.5ml酶，对照组加入等量的缓冲
液，混合摇匀。
3．5分钟后，加入到10ml1M硫酸中
4. 在烧瓶中用0.05M高锰酸钾滴定。
5. 结果表示为硼酸单位/每克酶
四计算公式：
酶活力=(V blank—V sample)×0.05×稀释倍数/(样品浓度×0.5) ×(1000/5min)×1000(U/g)
1。
果蔬CAT过氧化氢酶测定方法
果蔬CAT过氧化氢酶测定方法过氧化氢酶是一种存在于许多生物体中的酶，能够将过氧化氢转化为水和氧气。
它在果蔬中的测定方法主要是通过检测其催化过氧化氢分解反应的速率来确定其活性水平。
下面将详细介绍果蔬CAT过氧化氢酶测定方法。
CAT活性的测定方法有许多种，比较常用的方法主要包括荧光法、吸收光谱法和高效液相色谱法。
这里将重点介绍吸收光谱法和高效液相色谱法。
吸收光谱法是通过测定CAT在特定波长的吸光度变化来计算其活性。
具体步骤如下：1.制备样品：将需要测定CAT活性的果蔬样品如苹果、西红柿等取样，剥去外皮并搅碎成泥状。
加入适量的缓冲液，使得样品浓度适当。
2.破碎细胞：将样品放入破碎细胞器中，用超声波或搅拌器将样品破碎，使细胞内的酶释放出来。
3.离心：将破碎后的样品进行离心，除去细胞碎片和其他杂质。
4.准备试剂：制备过氧化氢溶液和过氧化氢酶溶液，分别用于添加到样品中。
5.反应：将等量的样品、过氧化氢溶液和过氧化氢酶溶液混合，开始反应。
在特定波长下，间隔一段时间后，测量吸光度的变化。
6.计算活性：通过吸光度的变化计算出CAT的活性值，单位为单位时间内分解过氧化氢的酶活性。
高效液相色谱法也被广泛应用于CAT活性的测定。
具体步骤如下：1.制备样品：同样，将需要测定CAT活性的果蔬样品剥去外皮并搅碎成泥状。
加入适量的缓冲液，使得样品浓度适当。
2.破碎细胞：将样品放入破碎细胞器中，用超声波或搅拌器将样品破碎，使细胞内的酶释放出来。
3.离心：将破碎后的样品进行离心，除去细胞碎片和其他杂质。
4.蛋白质沉淀：将样品中的蛋白质沉淀出来，去除其他有干扰的物质。
5.准备色谱柱：将样品中的蛋白质溶液加入高效液相色谱仪的色谱柱中。
6.诱导反应：添加过氧化氢溶液和过氧化氢酶溶液到色谱柱中，开始诱导CAT的催化反应。
7.分离与检测：在高效液相色谱仪中，通过色谱柱对样品中的CAT和其他物质进行分离，并实时监测其峰值的变化。
8.计算活性：通过峰面积的计算，可以计算出CAT的活性，单位为单位时间内分解过氧化氢的酶活性。
CAT过氧化氢酶活性测定方法
CAT过氧化氢酶活性测定方法过氧化氢酶（catalase，CAT）是一种常见的酶，广泛存在于细胞质和线粒体中，能够催化过氧化氢分解为氧气和水。
CAT活性的测定是评价细胞氧化应激和抗氧化能力的重要方法之一、本文将介绍两种常用的CAT活性测定方法：碘化钾法和比色法。
1.碘化钾法：碘化钾法是利用过氧化氢在碱性条件下与碘离子反应生成氧气，然后通过滴定测定碘化钾的消耗量，间接测定CAT活性。
实验步骤如下：1）制备适量的超纯水溶解适量的碘化钾，并与浓度为0.1M的Na2CO3缓冲溶液混合，调整pH至10-112）将待测样品加入上述溶液中，使得总体积约为2mL。
3）在和样品相同条件下作空白对照实验。
4）加入10%的H2O2溶液激活酶，使得最后的浓度约为0.1%。
5）停止反应，一般方法是加入0.1M的硫酸停止酶促反应，使得酶催化生成的氧气转化为水。
6）滴定反应液中的I2溶液，直至反应液呈深蓝色为止。
7）计算CAT活性，根据滴定的I2溶液量计算反应液中过氧化氢含量，再用过氧化氢摩尔浓度除以单位时间，得到CAT的活性。
2.比色法：比色法是通过测量酶催化H2O2分解时产生的物质的吸光度或荧光强度变化来间接测定CAT活性。
实验步骤如下：1）将待测样品加入适量的酶活化缓冲液中。
2）加入适量的过氧化氢（一般浓度为10mM）。
3）在和样品相同条件下作空白对照实验。
4）置于适当的反应温度下孵育一段时间。
5）停止反应，一般方法是加入NaOH溶液，将反应液pH调至碱性，停止酶促反应。
6）测定反应液中的吸光度或荧光强度。
7）根据标准曲线计算CAT活性，通过反应液的吸光度/荧光强度与CAT活性的关系曲线，计算待测样品中CAT的活性。
总结：CAT活性的测定方法主要有碘化钾法和比色法，两种方法均是通过间接测定过氧化氢酶催化反应产物氧气的生成量来计算CAT活性。
碘化钾法利用滴定I2溶液的消耗量计算CAT活性，而比色法则通过测定酶催化反应产物的吸光度或荧光强度来计算CAT活性。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。
其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。
测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。
本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。
1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。
常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。
羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。
2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。
酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。
常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。
离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。
上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。
蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。
CAT过氧化氢酶活性测定方法
1．2．2 CAT提取方法方法①：按文献[3]i己述的方法。
取花瓣1．00 g，加入少量石英砂、质量分数10％的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，及i00 mg的CaCO3、2．O0 mL水，冰浴研磨；用50 mol／L pH 7．0 的磷酸缓冲液定容至10 mL；过滤；取滤液1．O0 mL，稀释lO、i00、200、500、1 000、2 000倍。
此为CAT粗酶提取液。
方法②：按文献[4]记述的方法。
取花瓣0．500 g，加入10ⅡlL质量分数10％的PVP，及少量石英砂、2 mmol／L的EDTA、2．5 mmol／L的DTT、体积分数0．5％的一巯基乙醇，冰浴研磨；6 000 r／min、4cC离心20 min；取上清液，稀释10、100、200、500、1 000、2 000倍。
此为CAT粗酶提取液。
1．2．3 CAT 活性测定方法方法①：文献[1]记述的碘量滴定法。
碘量法利用H20z能将KI中的I一氧化，生成Iz，以淀粉作为滴定终点指示剂，用硫代硫酸钠滴定，计算出生成Iz的量，再换算成所消耗Hz0z 的量。
方法②：文献[3]记述的紫外分光光度碘量法。
该方法利用I 在波长350 nm处有一个吸收高峰，吸光度与I 的含量成正比来计算生成Iz的量。
用UV一120光度计测定样品对波长为350 nm光线的吸光度(OD值，用“0D350”表示)。
方法③：直接紫外分光光度法。
该方法利用H2oz在波长294 nm处有一个吸收高峰[4]，吸光度与lH20 含量成正比来计算。
取CAT粗酶提取液1．00 mL，加入30~mol／L的H202 2．00ⅡlL，迅速混匀，用UV一120光度计测定反应开始后4 min内对波长294 nm光线的吸光度(用“OD ’表示)的数值变化AOD2g4。
以1．00 mL CAT粗酶提取液与2．00mL H20的混合液为空白对照。
CAT与H202反应只在前5 min内呈线性关系，因此要在酶加底物后的30 S内读出原始读数。
CAT的活性测定-紫外吸收法
过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法一、仪器与用具紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml 容量瓶1个；刻度吸管2支，2ml 刻度吸管1支；10ml 试管3支；恒温水浴；二、试剂L 磷酸缓冲液L H 2O 2（用L 高锰酸钾标定）。
[L H 2O 2：市售30%H 2O 2大约等于L ，取30%H 2O 2溶液，稀释至1000ml ，用标准L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；L 高锰酸钾标准液称：取KMnO 4（AR ），用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml ，再用L 草酸溶液标定；L 草酸：称取优级纯 ，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml 。
]三、步骤1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10ml 离心管中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液。
置5℃冰箱中静置10min ，在4000rpm 下离心15min ，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
5℃下保存备用。
2.测定：取10ml 试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。
表40-2 紫外吸收法测定H 2O 2样品液配置表25℃预热后,逐管加入 L 的H 2O 2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm 下测定吸光度，每隔1min 读数1次，共测4min ，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
四、结果计算：以1min 内A 240减少的酶量为1个酶活单位（u ）。
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=FW t V .V A T⨯⨯⨯⨯124010∆式中∆A240 = A S0－() A AS S122+A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值；A S1, A S2—样品管吸光值；Vt—粗酶提取液总体积（ml）；V1—测定用粗酶液体积（ml）；FW—样品鲜重（g）；—A240每下降为1个酶活单位（u）；t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。
CAT酶活性测定
植物组织中过氧化氢酶的活性测定—紫外吸收法【原理】H 2O 2在240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A 240)随反应时间而降低。
根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与用具】紫外分光光度计；冷冻离心机；研钵；容量瓶；刻度吸管；恒温水浴；分析天平 【试剂】1. 0.05mol/L pH7.0磷酸缓冲液2. 0.2mol/L H 2O 2溶液：30% H 2O 2 11.36ml 溶于磷酸缓冲液中，定量至250ml 。
3.0.05 mol/LTris-Hcl 缓冲液（pH7.0） 【材料】正常生长或经逆境处理的新鲜植物组织 【方法步骤】1.酶液提取：称取剪碎混匀的植物样品（如叶片等）1.00g 置与预冷的研钵中，加入适量预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂冰浴研磨成匀浆后，转入10ml 容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到10ml 。
取提取液5ml 于离心管中，在4℃、15000g 下离心15min ，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
4℃下保存备用。
2.CAT 活性测定（1）取10ml 具塞试管，加2ml 酶提取液于沸水浴中加热煮死，冷却备用。
（2）取10ml 具塞试管，3支为测定管（3个重复），1支为对照，按下表加入试剂：将上述4支试管于25℃水浴中预热3min 后,逐管加入0.2ml 0.2mol/L 的H 2O 2溶液，每加完一管立即在紫外分光光度计上测定A240（蒸馏水调零），每隔30s 读数一次，共测3min,记录4支试管的测定值。
（需用石英比色杯） 3.结果计算：以1min 内A 240降低0.1（三支测定管的平均值）的酶量为1个酶活单位（u ），先求出3支测定管各自1min 内A 240降低值，按下式计算CAT 活性。
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=FW t V .V A T⨯⨯⨯⨯124010∆式中 ∆A 240 = A S0－—A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值；A S1, A S2,As 3—样品测定管吸光值；( +As 3) A A S S 1 23+Vt—酶提取液总体积（ml）；V1—测定时用酶液体积（ml）；FW—样品鲜重（g）；0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。
实验九_过氧化氢酶(CAT)活性的测定
实验九_过氧化氢酶(CAT)活性的测定一、实验目的1.了解过氧化氢酶的作用和测定方法。
二、实验原理过氧化氢酶(CAT)是一种广泛存在于生物体内的酶，其主要作用是催化过氧化氢(H2O2)分解为水(H2O)和氧(O2)，具有清除细胞内产生的过氧化氢的作用，从而保护细胞免受氧自由基的损伤。
测定过氧化氢酶活性的基本原理是利用过氧化氢酶催化过氧化氢分解的特性，测定其对过氧化氢的催化效率，从而求得过氧化氢酶的活性。
三、实验步骤1.将0.05 mL的0.1 mol/L H2O2加入到0.95 mL反应液中，混匀。
2.分别分装0.1 mL过氧化氢酶标准液A(1 U/mL)、待测样品液和纯水于三个小瓶中。
3.向3个小瓶中加入0.6 mL反应液，混匀后立即读取吸光度值。
4.将三个小瓶依次放入比色皿中，加入等体积的反应液，混匀。
5.在室温下，按照每分钟一次，共计计时5分钟，依次读取吸光度值。
6.根据吸光度值计算过氧化氢酶的活性。
四、实验注意事项1.使用新鲜的过氧化氢酶，避免长时间贮存或受热的过氧化氢酶，因其活性会降低。
2.必须按照比色皿上的顺序加入待测样品、过氧化氢酶标准液和纯水。
3.测定过氧化氢酶活性时，要注意比色皿内的反应物混匀程度和加液顺序。
4.读取吸光度时，要记录时间，使时间相同，以便计算活性值。
五、实验结果处理1.计算反应液的吸光度(OD)值。
2.计算酶活性的计算式为：CAT活性=(sample-Blank)/F/(T2-T1)其中，sample为待测样品的吸光度值；Blank为加入纯水的比色皿的吸光度值；F为稀释系数；T2-T1为反应时间，单位为分钟。
1.活性计算结果应该合理，符合实验要求。
2.实验结果能够表明过氧化氢酶的活性。
七、实验总结本次实验通过测定过氧化氢酶活性的方法，了解了测定过氧化氢酶活性的原理，熟悉了测定过氧化氢酶活性的步骤和操作方法。
同时，也掌握了计算过氧化氢酶活性的方法以及如何进行实验结果分析。
过氧化氢酶活性测定
酵母过氧化氢酶（CAT）的测定方法一、CAT提取1.准备材料、仪器及试剂材料：酵母：5g仪器：天平、电子天平研钵（1个），石英砂，玻璃匀浆器冰箱（1台）玻璃棒（1个）高速离心机离心管容量瓶(1000ml、100ml)量筒SephadexG-75柱试剂：Na2HPO4、NaH2PO4 (0.1M磷酸缓冲溶液（PBS）：PH=7.0 ，20ml)、 (NH4)2SO41.1 0.1M PBS配制母液的配制配制时，常先配制0.2mol/L的NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS），根据需要可配制不同浓度PBS。
0.2M Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于1000ml水；0.2M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml水（3）0.2mol/L pH5.7～8.0的PBS的配制如下：取n ml0.2mol/L的NaH2PO4和mml0.2mol/L的Na2HPO4·12H2O,充分混合即为0.2mol/L的PBS.0.1MPBS配制0.1M PBS（PH=7.0）：取500ml0.2M PBS{38ml 0.2M NaH2PO4（ml）+62 ml 0.2M Na2HPO4（ml）}，加水稀释至1000ml即可。
2.CAT提取称取干酵母5g→研磨→加20 mL 0.1 mol/L (pH7.0 )磷酸盐缓冲液(PBS)→4℃下放置30 min→玻璃匀浆器研磨20 min(使酵母细胞充分破壁，释放出酶) →10000r/min(4℃)离心15 min→取上清液作为粗酶液(用于测定CAT活性，并用于进一步纯化)3.CAT的提纯以上的粗酶上清液中加人固体(NH4)2SO4，使其饱和度达到70%→4℃静置15 min→4℃用14 000 r/min离心15 min→取上清液→测定CAT活性→上清液中加人固体(NH4)2SO4，使其饱和度达到80% → 4℃静置15 min →14 000 r/min离心15 min→取沉淀→沉淀用1 mL 0.1 mol/L的PBS(pH7.0)溶解→测定CAT活性。
抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法
抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法抗氧化酶SOD（超氧化物歧化酶）、POD（过氧化物酶）和CAT（过氧化氢酶）是植物体内重要的抗氧化酶，在植物的抗逆境应对中起着重要的作用。
因此，对这些抗氧化酶的活性进行测定和分析是研究植物生理生化过程的重要方面之一测定抗氧化酶活性的方法一般分为两类：直接法和间接法。
直接法是通过测定一些特定底物的降解速率来反映酶的活性；间接法是通过测定酶催化底物形成的产物的生成速率来间接反映酶的活性。
下面将分别介绍抗氧化酶SOD、POD和CAT活性的测定方法。
1.SOD活性测定方法：SOD活性测定方法主要分为NBT法和EPX法两种。
（1）NBT法：这是一种直接法，其基本原理是SOD将还原型的NBT 还原成穆尔蓝染色形成具有最大吸收峰值的NBT离子。
实验步骤如下：a.首先准备SOD底物溶液，其组成为：50mM磷酸缓冲液（pH7.8）+13mML-甲硫氨酸+75μM硝基蓝硝酸盐（NBT）。
b.将样品加入上述的SOD底物溶液中，混匀。
c.加入适量的酶抑制剂，使停止酶的活性，并将其放在冰上。
d.使上述反应在37℃下进行10分钟。
e.加入已经冷却的硝酸亚铁和磷酸以停止反应，并将其放在冰上10分钟。
f. 测定变色液的吸收光谱在560 nm波长处的吸光度。
（2）EPX法：这也是一种直接法，其基本原理是SOD将乙酸型形成的4-无水乙烯甲基-3-硝基噻吩染色。
实验步骤如下：a. 首先在试管中加入1 ml乙酸型测定液。
b.分别加入适量的SOD样品。
c.在30分钟内使试管中乙酸型完全消除。
d. 测定出试管中产生的4-乙烯基-3-硝基-5-硝基噻吩的吸收光谱在260 nm波长处的吸光度。
2.POD活性测定方法：POD活性测定方法可分为直接法和间接法。
（1）直接法：这种方法基于过氧化反应的特点，利用dianisidine 与过氧化氢在催化剂POD作用下形成有色产物的现象来测定POD的活性。
实验步骤如下：a.在试管中加入0.1M磷酸盐缓冲液（pH6.0）。
过氧化氢酶活力测定CAT
过氧化氢酶活力测定CAT过氧化氢酶活力测定碘量法目的意义过氧化氢酶(Catalase，CAT)普遍存在于植物所有组织中，其活性与植物的代谢强度、抗衰老、抗寒、抗病能力有一定关系，在生产实践中常进行测定。
学习几种测定 CAT活性的方法，理解其测定原理。
一、实验原理过氧化氢酶能把过氧化氢分解为水和氧，其活性大小，可以一定时间内分解的过氧化氢量或生成氧气的量来表示。
H0的测定常采用氧化还原滴定法，碘量法是其经典方法。
其原22理是在有催化剂钼酸铵存在时，过氧化氢与碘化钾反应，放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘，以淀粉指示剂指示滴定终点。
根据空白和测定二者滴定值之差，即可算出酶分解的过氧化氢量。
其反应为:HO十2KI十HS0 ?I十KS0十2H0 22242242I+2NaSO?2NaI+NaS0 222346二、材料、设备与试剂1(植物材料小麦或其他植物新鲜叶片。
2(主要设备天平、研钵、100ml容量瓶、50ml酸滴定管、移液管(1、5、10ml)、100ml三角瓶。
3(试剂(1)碳酸钙粉末(2)1.8mol/L的硫酸取1000ml烧杯1只，加入约500ml蒸馏水，边搅拌边加入100ml浓硫酸，冷却后用量瓶定容到1000ml。
(3)10,的钼酸铵溶液:称取钼酸10g，溶于蒸馏水中使成100ml。
(4)1,淀粉溶液:取1g可溶性淀粉于小烧杯中加约20ml水调匀，慢慢倾入约80m1沸水中，在搅拌下加热至重新沸腾冷却后贮于滴瓶中(可加少量HgCl防腐)。
2(5)0.05mol/L硫代硫酸钠称取NaSO?5HO 25g，溶于新沸腾并冷却过的蒸馏水中，2232加入约0.1gNaCO，，并稀释至1升，保存于棕色试剂瓶中，放置暗处。
一天后进行标定。
23标定方法:精确称取分析纯KCr0约0(15g于500ml三角瓶中，加30ml蒸馏水溶解， 227加入2gKI和5ml 6mol/L盐酸，在暗处放置5min，然后用水稀释至200ml，用0.05mol/L 硫代硫酸钠溶液滴定，当溶液由棕红色变为浅黄色时，加入1ml淀粉溶液，继续滴至溶液由蓝色变为亮绿色(Cr离子的颜色)为止。
CAT酶活性测定
CAT酶活性测定植物组织中过氧化氢酶的活性测定―紫外吸收法【原理】h2o2在240nm波长下存有猛烈稀释，过氧化氢酶能够水解过氧化氢，并使反应溶液喷光度(a240)随其反应时间而减少。
根据测量吸光率为的变化速度即可测到过氧化氢酶的活性。
【仪器与用具】紫外分光光度计；冷冻离心机；研钵；容量瓶；刻度吸管；恒温水浴；分析天平【试剂】1.0.05mol/lph7.0磷酸缓冲液2.0.2mol/lh2o2溶液：30%h2o211.36ml溶于磷酸缓冲液中，定量至250ml。
3.0.05mol/ltris-hcl缓冲液（ph7.0）【材料】正常生长或经逆境处置的新鲜植物非政府【方法步骤】1.酶液提取：称取剪碎混匀的植物样品（如叶片等）1.00g置与预冷的研钵中，加入适量预冷的ph7.0磷酸缓冲液和少量石英砂冰浴研磨成匀浆后，转入10ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到10ml。
取提取液5ml于离心管中，在4℃、15000g下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
4℃下保存备用。
2.cat活性测量（1）取10ml具塞试管，加2ml酶提取液于沸水浴中加热煮死，冷却备用。
（2）取10ml具塞试管，3支为测定管（3个重复），1支为对照，按下表加入试剂：表中40-2紫外稀释法测定h2o2样品液布局表管号s11.00.11.7(4)s21.00.11.7(4)s31.00.11.7(4)s41.00.1(煎死去酶液)1.7(4)tris-hcl细酶液(ml)蒸馏水(ml)将上述4两支试管于25℃水浴中预演3min后,怱管及重新加入0.2ml0.2mol/l的h2o2溶液，每加满一管立即在紫外分光光度计上测量a240（蒸馏水调零），内要30s读数一次，共测3min,记录4两支试管的测量值。
（需以石英比色杯）3.结果排序：以1min内a240降低0.1（三支测定管的平均值）的酶量为1个酶活单位（u），先求出3支测定管各自1min内a240降低值，按下式计算cat活性。
CAT 测定方法
二、氧化氢酶的活性测定--高锰酸钾滴定法[原理]过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
据此，可根据H202的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量(反应过量)的H2O2溶液，经过酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2 5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4[仪器和用具]研钵；三角瓶50ml4个；10ml酸式滴定管；恒温水浴锅；容量瓶25ml1个。
[试剂]10％H2SO4；0．2mol?L-1磷酸缓冲液pH7.8; 0．1mol?L-1高锰酸钾标准液；称取KmnO4(AR)3.160克，用新煮沸泠却的蒸馏水配制成1000ml,用0.1moL.L-1草酸溶液标定；0.1mol.l-1H2O2：市售30％H202大约等于17．6m01?L-1，取30％H202溶液5．68ml,稀释至于1000ml,用标准0.1molKMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定0.1mol.L-1 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O12.607g,用蒸馏水溶解后，定容至1L。
[方法]1．酶液提取：取小麦叶片2．5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000r?min-1离心15min,上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2．取50ml三角瓶4个(2个测定，2个对照)，测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml0.1mol01?L-1H202，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10％H2S042.5ml3．用0.1mol?L-1KMnO4标准溶液滴定H202，至出现粉红色(在30min内不消失)为终点。
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1．2．2 CAT提取方法
方法①：按文献[3]i己述的方法。
取花瓣1．00 g，加入少量石英砂、质量分数10％的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，及i00 mg的CaCO3、2．O0 mL水，冰浴研磨；用50 mol／L pH 7．0 的磷酸缓冲液定容至10 mL；过滤；取滤液1．O0 mL，稀释lO、i00、200、500、1 000、2 000倍。
此为CAT粗酶提取液。
方法②：按文献[4]记述的方法。
取花瓣0．500 g，加入10ⅡlL质量分数10％的PVP，及少量石英砂、2 mmol／L的EDTA、2．5 mmol／L的DTT、体积分数0．5％的一巯基乙醇，冰浴研磨；6 000 r／min、4cC离心20 min；取上清液，稀释10、100、200、500、1 000、2 000倍。
此为CAT粗酶提取
液。
1．2．3 CAT 活性测定方法
方法①：文献[1]记述的碘量滴定法。
碘量法利用H20z能将KI中的I一氧化，生成Iz，以淀粉作为滴定终点指示剂，用硫代硫酸钠滴定，计算出生成Iz的量，再换算成所消耗Hz0z 的量。
方法②：文献[3]记述的紫外分光光度碘量法。
该方法利用I 在波长350 nm处有一个吸收高峰，吸光度与I 的含量成正比来计算生成Iz的量。
用UV一120光度计测定样品对波长为350 nm光线的吸光度(OD值，用“0D350”表示)。
方法③：直接紫外分光光度法。
该方法利用H2oz在波长294 nm处有一个吸收高峰[4]，吸光度与lH20 含量成正比来计算。
取CAT粗酶提取液1．00 mL，加入30~mol／L的H202 2．00ⅡlL，迅速混匀，用UV一120光度计测定反应开始后4 min内对波长294 nm光线的吸光度(用“OD ’表示)的数值变化AOD2g4。
以1．00 mL CAT粗酶提取液与2．00mL H20的混合液为空白对照。
CAT与H202反应只在前5 min内呈线性关系，因此要在酶加底物后的30 S内读出原始读数。
1．2．4 数据分析方法
试验数据采用国际通用统计分析软件SAS 6．12进行分析。
利用外标法测定CAT活性。
即配制浓度为0、1、5、10、15、20 p~nol·L 的H202标准溶液；取2．o0ⅡlL各种浓度的H20 溶液，各加入1．00ⅡlL用方法①提取的CAT酶的100倍稀释液，反应4 min后测定CAT活性；用3．00ⅡIL水调0。
结果如表3。
----测定切花中过氧化氢酶活性的3种常用方法的比较、①
陈晓敏②(华南热带农业大学园艺学院海南儋州 571737)
方法二过氧化氢酶的活力测定——紫外吸收法
H 2O
2
在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液
吸光度(A
240
)随反应时间而降低。
根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活力。
三、材料、仪器与试剂
（一）、材料：小麦叶片
（二）、仪器（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定）
紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml 容量瓶1个；0.5ml 刻度吸管2支，2ml 刻度吸管1支；10ml 试管3支；恒温水浴； （三）、试剂（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制）
0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H 2O 2（用0.1mol/L 高锰酸钾标定）。
四、实验操作：
1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g 置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml 容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。
混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min ，取上部澄清液在4000rpm 下离心15min ，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
5℃下保存备用。
2.测定：取10ml 试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。
22速倒入石英比色杯中，240nm 下测定吸光度，每隔1min 读数1次，共测4min ，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活力。
五、计算
以1min 内A 240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u ）。
过氧化氢酶活力(u/gFW/min)=FW t V .V A T
⨯⨯⨯⨯124010∆
式中 ∆A 240 = A S0－()
A A S S 122+
A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值； A S1, A S2—样品管吸光值； Vt —粗酶提取液总体积（ml ）； V 1—测定用粗酶液体积（ml ）； FW —样品鲜重（g ）；
0.1—A 240每下降0.1为1个酶活单位（u ）； t —加过氧化氢到最后一次读数时间（min ）。
六、注意事项
凡在240nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰。
七、思考题
1.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?
2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?。