CAT过氧化氢酶活性测定方法

1．2．2 CAT提取方法

方法①：按文献[3]i己述的方法。取花瓣1．00 g，加入少量石英砂、质量分数10％的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，及i00 mg的CaCO3、2．O0 mL水，冰浴研磨；用50 mol／L pH 7．0 的磷酸缓冲液定容至10 mL；过滤；取滤液1．O0 mL，稀释lO、i00、200、500、1 000、2 000倍。此为CAT粗酶提取液。

方法②：按文献[4]记述的方法。取花瓣0．500 g，加入10ⅡlL质量分数10％的PVP，及少量石英砂、2 mmol／L的EDTA、2．5 mmol／L的DTT、体积分数0．5％的一巯基乙醇，冰浴研磨；6 000 r／min、4cC离心20 min；取上清液，稀释10、100、200、500、1 000、2 000倍。此为CAT粗酶提取

液。

1．2．3 CAT 活性测定方法

方法①：文献[1]记述的碘量滴定法。碘量法利用H20z能将KI中的I一氧化，生成Iz，以淀粉作为滴定终点指示剂，用硫代硫酸钠滴定，计算出生成Iz的量，再换算成所消耗Hz0z 的量。

方法②：文献[3]记述的紫外分光光度碘量法。该方法利用I 在波长350 nm处有一个吸收高峰，吸光度与I 的含量成正比来计算生成Iz的量。用UV一120光度计测定样品对波长为350 nm光线的吸光度(OD值，用“0D350”表示)。

方法③：直接紫外分光光度法。该方法利用H2oz在波长294 nm处有一个吸收高峰[4]，吸光度与lH20 含量成正比来计算。取CAT粗酶提取液1．00 mL，加入30~mol／L的H202 2．00ⅡlL，迅速混匀，用UV一120光度计测定反应开始后4 min内对波长294 nm光线的吸光度(用“OD ’表示)的数值变化AOD2g4。以1．00 mL CAT粗酶提取液与2．00mL H20的混合液为空白对照。CAT与H202反应只在前5 min内呈线性关系，因此要在酶加底物后的30 S内读出原始读数。

1．2．4 数据分析方法

试验数据采用国际通用统计分析软件SAS 6．12进行分析。

利用外标法测定CAT活性。即配制浓度为0、1、5、10、15、20 p~nol·L 的H202标准溶液；取2．o0ⅡlL各种浓度的H20 溶液，各加入1．00ⅡlL用方法①提取的CAT酶的100倍稀释液，反应4 min后测定CAT活性；用3．00ⅡIL水调0。结果如表3。

----测定切花中过氧化氢酶活性的3种常用方法的比较、①

陈晓敏②(华南热带农业大学园艺学院海南儋州 571737)

方法二过氧化氢酶的活力测定——紫外吸收法

H 2O

2

在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液

吸光度(A

240

)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活力。

三、材料、仪器与试剂

（一）、材料：小麦叶片

（二）、仪器（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定）

紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml 容量瓶1个；0.5ml 刻度吸管2支，2ml 刻度吸管1支；10ml 试管3支；恒温水浴； （三）、试剂（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制）

0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H 2O 2（用0.1mol/L 高锰酸钾标定）。 四、实验操作：

1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g 置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml 容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min ，取上部澄清液在4000rpm 下离心15min ，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。

2.测定：取10ml 试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。

22速倒入石英比色杯中，240nm 下测定吸光度，每隔1min 读数1次，共测4min ，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活力。 五、计算

以1min 内A 240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u ）。

过氧化氢酶活力(u/gFW/min)=FW t V .V A T

⨯⨯⨯⨯124010∆

式中 ∆A 240 = A S0－()

A A S S 122+

A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值； A S1, A S2—样品管吸光值； Vt —粗酶提取液总体积（ml ）； V 1—测定用粗酶液体积（ml ）； FW —样品鲜重（g ）；

0.1—A 240每下降0.1为1个酶活单位（u ）； t —加过氧化氢到最后一次读数时间（min ）。 六、注意事项

凡在240nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰。 七、思考题

1.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?

2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?