植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定
转基因植物的检测鉴定方法、遗传转化技术及新技术
PCR检测
• PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段 的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达 到ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭 染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出 基因组中的一些顺序。
• 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩 增，因而对外源基因是否整合需要进行扩增产物 的Southern杂交。
＊已获得专利许可
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Site-specific recombinasemediated transgene excision
loxP
Cre
Transgene
loxP
loxP
Cre
Transgene
llooxP
loxP
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外源基因去除（Gene-deletor)
• “外源基因去除”技术的要点之一是在目标植 物中加入了受DNA调空片段启动子控制的特殊基 因，该基因在启动子的作用下，可根据科学家的 意愿，在需要的时间和部位将外源基因和自身从 转基因植物中切掉，从而使转基因作物的花粉、 种子、果实不再含有外来基因，或将外来基因从 人们所需食用的部分（如植物的茎、叶、块茎） 彻底清除掉，达到用转基因作物生产出非转基因 食品的目的，从根本上解决了长期困扰人们的转 基因植物基因扩散问题和转基因食品的安全性问 题。
ATP
dsRNA
siRNA
蛋白复合物
RISC
靶 正义链
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mRNA
3、无选择标记转化
• 可消除选择标记基因对转基因作物安全性 方面的影响
• 可消除选择标记基因对重复多基因转化叠 加所带来的困难
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marker-free转基因植株
• 共转化法＊(基因枪与农杆菌转化) • 转座元法 • 重组酶法＊ • MAT(Multi-auto transformation)法＊ • 替代法＊
转基因植物的筛选与鉴定
转基因植物的筛选与鉴定随着植物转基因技术的不断进步，它对于分子遗传学研究和植物改良都具有特别重要的意义。
转基因植株的筛选在转基因技术中起着关键性的作用。
将含有35S启动子的基因载体PMDC150经农杆菌介导，利用农杆菌侵染拟南芥花序的方法转入拟南芥后得到T1代种子。
文章通过组织培养来筛选含有Kan抗性的转基因植株。
标签：拟南芥；转基因植物；筛选1 文献综述1.1 转基因植物的研究进展植物的遗传转化是指利用重组DNA，细胞组织培养等方法，将外源基因导入到植物的组织或细胞中，获得转基因植物的技术[1]。
从转基因植株成功之后，转基因技术飞速发展，如今，植物在抗病、抗虫和抗药等方面都有了转基因植株。
这种技术对改进农作物品质、提高产量等方面都有非常大的帮助。
1.2 基因转化技术随着人们对基因转化技术不断地深入研究和探索，现已发现多种基因转化的方法，例如农杆菌介导的基因转化、花粉管通道法等。
相比较其他植物基因的转化方法，农杆菌介导法有着减少成本、容易操作等优点，但对宿主细胞有着严格的要求。
每种方法都有其优缺点，所以根据植物的不同种类，我们要选择合理的转化方法，达到理想的转化效果。
1.3 本论文的目的和意义植物的转基因技术日新月异迅速发展，已经成为许多国家重点发展的新目标新领域，它所产生的巨大的社会和经济效益促使各个国家对其进行更加深入的研究，由其产生的巨大的生产潜能一定会推动社会的进步，改善人类现有的生产、生活质量以及健康水平。
本文以拟南芥为主要研究对象，通过转化后的农杆菌侵染拟南芥花序的方法及组织培养的方法进行了轉基因植物的筛选。
借由本次实验研究，可深入了解基因工程等相关领域的理论，可熟练掌握相关技术例如无菌操作技术、植物转基因技术、植物组织培养技术等等。
2 转基因植物的筛选与鉴定2.1 实验材料2.1.1 植物材料拟南芥2.1.2 载体与菌株重组表达载体PMDC150-35S（由实验室提供）、农杆菌菌株GV31012.1.3 主要试剂75%酒精、84消毒液、侵染缓冲液、限制性内切酶、卡那霉素、壮观霉素（重组表达载体含有的抗性）、利福平2.1.4 培养基LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，15g/L琼脂（只固体培养基添加）1/2MS培养基2.2 实验方法2.2.1 拟南芥种植：将种子放在浸过水的滤纸上，放在4℃的冰箱中，不见光培养24小时，然后取出种子种在营养土里，在光照强度8000Lux，温度25℃的培养箱中经过光照16小时/黑暗8小时培养[2]。
植物的基因工程和转基因技术
植物的基因工程和转基因技术植物的基因工程和转基因技术是现代生物学领域中一项重要的研究内容。
通过利用基因工程和转基因技术，科学家们能够对植物进行遗传改良，从而实现提高作物产量、抗虫病和抗逆性能等目标。
本文将就植物基因工程的原理、应用和潜在的问题进行探讨，以便更好地理解这一领域的重要性和影响。
一、基因工程的原理基因工程是指通过分子生物学技术对生物体的基因进行改造的过程。
植物基因工程的核心是基因的克隆和转移。
首先，科学家们需要从源植物中提取目标基因，然后将其插入到目标植物的染色体中。
这一过程需要利用酶切与黏合技术来切割和粘合DNA分子，从而实现基因的克隆和转移。
二、转基因技术的应用转基因技术是基因工程的一种重要手段，通过这种技术，科学家们可以将外源基因导入到目标植物中，从而使其具备一些新的性状或特性。
转基因技术在农业和食品生产领域有着广泛的应用。
例如，利用转基因技术，科学家们可以培育出具有抗虫病、抗逆性以及更高产量的转基因作物。
此外，转基因技术还可以用于培育抗除草剂的作物，从而降低农药的使用量，并提高农作物的耐草剂能力。
三、转基因技术的优势和潜在问题转基因技术在农业和食品生产中具有许多优势。
首先，转基因作物可以显著提高农作物的产量，从而满足人们日益增长的粮食需求。
其次，经过基因改良的作物具有更好的抗虫、抗逆性能，能够减少农药的使用，对环境友好。
此外，转基因技术还可以提高农作物的营养价值，改善其口感和储存能力。
然而，转基因技术也存在一些潜在的问题和争议。
首先，转基因作物可能对生态系统造成潜在的风险，例如，转基因植物的杂交可能会导致与野生植物的杂种，从而对生态多样性产生负面影响。
其次，由于转基因技术的高昂成本，这些技术可能会加大农民的经济负担。
此外，一些人对转基因技术持有担忧，担心食用转基因作物可能对人类健康产生潜在的风险。
四、基因工程和转基因技术的发展前景尽管存在一些潜在问题，基因工程和转基因技术仍然具有广阔的发展前景。
转基因植物
载体介导法
➢ T-DNA区可高效整合到植物受体细胞的 染色体上并得到表达。利用这一特点， 将目的基因转入Ti质粒的T-DNA区构建 根瘤农杆菌的转化载体。
一、转基因植物
通过植物基因工程获得转基因植物在农 业生产发展及植物分子生物学研究中有 十分重要的意义，已获得的有重大经济 价值的转基因植物已经很多。
一、转基因植物
基因工程： 就是重组DNA技术，指在体 外将不同来源的DNA进行剪切和重组， 形成杂合DNA或成嵌合DNA分子，然后将 其导入特定的宿主细胞从而得到大量扩 增和表达，使宿主细胞获得新的遗传特 性，产生新的基因产物。
载体介导法
Vir区（virulence region）： ➢ 该区段上的基因能激活T-DNA转移，
使农杆菌表现出毒性，故称之为 毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒 DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质 粒DNA的三分之一。
Ti质粒的基因位点及其功能区域
➢ T-DNA区（transferred-DNA regions）：
产生白化苗，且由于 PEG法对原生质体活力 有害，转化率低。
应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡
椒等植物的转基因植株。
一、转基因植物
载体介导法 具体方法有农杆菌介导法、病毒介导法。 农杆菌介导可采用“共培养法”，(见
书本图10-1 B)，有根癌农杆菌和发根农 杆菌两种载体系统。
载体介导法
以野生型根癌农杆菌载体系统为例： ➢ 野生型根癌农杆菌Ti质粒大小约200-
生物技术 园艺植物基因工程步骤
生物技术园艺植物基因工程步骤
园艺植物基因工程是指通过生物技术手段对园艺植物的基因进行改变或调控，以获得所需的遗传特性。
其步骤主要包括以下几个方面：
1. 目标设定：确定要改变的遗传特性和目标基因，例如提高植物的产量、抗性、品质等。
2. 基因克隆：从目标植物中提取DNA，并使用分子生物学技术将目标基因扩增、纯化，以获得目标基因片段。
3. 基因构建：将目标基因片段插入植物基因工程载体（例如农杆菌载体），并利用适当的限制性内切酶将其与载体DNA连接起来，形成重组DNA。
4. 转化方式选择：选择适合的转化方法将重组DNA导入目标植物细胞，主要有农杆菌介导转化、生物弹射法或冷冻融合法等。
5. 遗传转化：将经过构建的重组DNA导入植物细胞，使目标基因插入植物染色体，形成转基因植物。
6. 试管繁殖：对转基因植物进行离体培养，通过细胞分裂和组织增殖等技术，大规模繁殖转基因植物。
7. 筛选和鉴定：利用分子生物学和生化分析等技术对转基因植物进行鉴定和筛选，确认目标基因的存在和表达情况。
8. 田间试验和推广：在试验田或实际种植场进行转基因植物的田间试验，评估其生长发育、产量、品质和抗性等性状，同时进行安全性评估和环境风险评估。
9. 商业化推广：通过权威部门的安全评估和监管审核，将合格的转基因植物品种进行商业化推广，使其广泛应用于园艺产业。
需要注意的是，园艺植物基因工程步骤可能会因具体目标和植物而有所差异，以上步骤仅供参考。
植物转化及转基因的检测
复杂
复杂
简单
昂贵
昂贵
便宜
低
高
低
可行
广泛
广泛
Agrobacterium tumefaciens
Ti plasmid with the new gene
+
cell’s DNA
Agrobacterium
Plant cell
Transformation
The new gene
Tr2a0n20s/6g/20enic plant
Calli are placed in vacuum chamber, Helium pressure shot DNA into cells
Gene gun
vacuum chamber
Calli remain on the high osmotic media for 2020h2o0u/6r/s20 following shooting.
• 早衰
生长期缩短、早孕早穗等
• 对环境敏感
对水、肥、温度、光照敏感
Transformation is performed by gene gun meia prepare calli for transfomation
2020/6/20
福建省农业遗传工程重点实验室
DNA with desired gene and antibiotic resistance is coated onto the surface of gold particles.
借助标记基因和报告基因的快速筛选和纯合
抗生素抗性基因
新霉素磷酸转移酶基因（nptII）——Kanr，G418r
双氢叶酸脱氢酶基因 潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)——hygr 氯霉素乙酰转移酶基因（cat）——Cre
植物转基因技术原理及要点
通过将与生物燃料生产相关的基因导入植物中，使植物能够生产生物燃料。例如，转基因生物燃料甘蔗和藻类。
THANKS
谢谢
基因枪法
通过物理手段将目的基因 导入植物细胞，常用金粉 或钨粉作为载体。
微管注射法
将目的基因直接注射到植 物细胞内，再通过植物细 胞培养再生出转基因植株。
转基因植物的安全性评价
生态安全评价
评估转基响、基因漂移等。
食品安全评价
评估转基因植物对人类健 康的潜在影响，如食品中 营养成分的改变、毒理学 安全性等。
产量高
转基因技术可以增加植物的光合作用 效率，提高产量，有助于解决全球粮 食安全问题。
品质优良
转基因技术可以改善植物的品质，如 增加营养价值、改善口感等。
转基因植物的缺点
生态风险
转基因植物可能对非目标生物产生影响，破 坏生态平衡。
过敏反应
转基因植物可能产生新的过敏原，引发过敏 反应。
食品安全问题
关于转基因食品的安全性存在争议，长期食 用可能对人体健康产生影响。
高产优质转基因植物
高油酸转基因植物
通过将高油酸相关基因导入植物中，提高植物油中的油酸含量，从而提高油的品质和稳定性。例如， 转基因高油酸油菜和花生。
高纤维转基因植物
通过将高纤维相关基因导入植物中，提高植物纤维的产量和品质。例如，转基因高纤维亚麻和大麻。
其他应用领域的转基因植物
荧光转基因植物
通过将荧光蛋白基因导入植物中，使植物在黑暗中发出荧光，具有观赏价值。例如，转基因荧光烟草和紫茉莉。
植物转基因技术要点
目的基因的选择与获取
目的基因选择
选择对植物生长、产量、抗性等有积 极影响的基因作为目的基因，以提高 转基因植物的性状。
植物基因工程实验教案：遗传转化技术的应用和优化
植物基因工程实验教案：遗传转化技术的应用和优化植物基因工程是一种将目标基因移入植物细胞内的方法，以实现改良作物品种的过程。
这一技术可以应用于许多方面，如增强作物产量、提高作物品质、促进作物抗病抗虫能力等。
植物基因工程是一个极具潜力的领域。
本文将介绍植物基因工程实验教案中的遗传转化技术的应用和优化。
一、遗传转化技术遗传转化技术是一种将外源基因转移入植物细胞中的方法，该方法包括四个主要步骤：选择载体、制备载体、转化载体和鉴定基因。
选择载体：目前用于植物基因工程的两种载体是农杆菌和冷冻冻融法。
农杆菌转化法是最常用的方法之一，农杆菌以同源重组的方式在植物细胞中形成感染斑。
农杆菌将外源基因植入植物细胞中，目标基因将被插入植物细胞的染色体中。
制备载体：载体是一种可以将外源基因植入植物细胞内的DNA分子。
在制备载体的过程中，需要用到回收携带目标基因的载体。
常用的载体包括质粒和病毒，质粒是一种带有目标基因的圆形DNA分子，可以将目标基因直接植入质粒中。
转化载体：转化载体是指将目标基因输送至植物细胞内的过程。
转化方法主要有两种：物理转化和生物转化。
物理转化是指通过高斯粒子加速器等物理手段将目标基因输送至植物细胞内；生物转化是指使用农杆菌或病毒将外源基因输送至植物细胞内。
鉴定基因：鉴定基因是指确定转化后的植物细胞中是否成功植入了外源基因。
通常使用PCR和Southern杂交等方法对植物细胞进行鉴定。
二、遗传转化技术的应用1. 增强作物产量：遗传转化技术可以实现植物细胞的营养分配和代谢的调节，从而提高作物的生长速度和生产力；2. 提高作物品质：通过遗传转化技术，可以改善作物的色、香、味等特征；3. 促进作物抗病抗虫能力：外源基因的应用可以帮助作物提高其对病菌、虫害等的抵抗力；4. 创建新的生物技术：可以通过遗传转化技术创建新的生物技术，例如转基因药物、疫苗等。
三、遗传转化技术的优化虽然遗传转化技术在基因工程领域中应用较为广泛，但是该技术仍存在一些问题。
转基因植物的鉴定
转录水平上的检测主要方法是Northern 杂交，它是以DNA或RNA为探针，检测 RNA链。 和Southern杂交相同，Northern杂交包括 斑点杂交和印迹杂交。
也可用RT-PCR（reverse transcribed PCR）方 法检测外源DNA在植物体内的转录表达。 其原理是以植物总RNA或mRNA为模板进行 反转录，然后再经PCR扩增。 如果从细胞总RNA提取物中得到特异的cDNA 扩增条带，则表明外源基因实现了转录。 此法简单、快速，但对外源基因转录的最后 决定，还需与Northern杂交的实验结果结合。
PCR检测所需的模板量仅为10ng以内， 而且粗提的DNA就可以得到良好的扩增 效果，因而这一技术的出现为外源基因 整合的检测提供了便利条件，尤其是在 转化材料少又需及早检测的时候。 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现 假阳性扩增，因此检测的只是初步结果。
外源基因转录水平的鉴定
基因表达分为转录及翻译两阶段，转录 是以DNA（基因）为模板生成mRNA的 过程，翻译是以mRNA为模板生成蛋白 质的过程，检测外源基因的表达就是检 测特异mRNA及特异蛋白质的生成。 所以基因表达检测分为两个水平：即转 录水平上对特异mRNA的检测和翻译水 平上对特异蛋白质的检测。
ELISA与经典的同位素标记为基础的液 －液抗原－抗体反应体系不同之处在于 建立了固－液抗原抗体反应体系，并采 用酶标记，抗体与抗原的结合通过酶反 应来检测。 由于酶的放大作用，使测定的灵敏度极 高，可检测出1pg的目的物，同时酶反 应还具有很强的特异性。
探针与其互补的核苷酸序列杂交后，杂 交体也就带上了同样标记，可被检测出 来。 这样，以特定的已知核苷酸序列做探针， 就可以在诸多的核苷酸序列中，通过杂 交探测出与其互补的序列，因而分子杂 交是进行核酸序列分析，重组子鉴定及 检测外源基因整合表达的强有力手段。
转基因植物的检测与鉴定
转基因植物的检测与鉴定宫雪超于丽杰高金秋哈尔滨师范大学环境与生命科学院黑龙江哈尔滨摘要对植物转基因过程中报告基因的种类和应用范围转基因植物的检测和鉴定方法转基因植物检测和鉴定方法的评价进行了综述关键词转基因植物检测鉴定评价中图分类法文献标识码文章编号植物转基因实验因受体系统的限制外源基因的转化频率较低为了达到转化目的必然要获得大量的转化材料如何在数以千万计的转化植株或细胞中快速有效地检测出转基因阳性植株或细胞外源基因是否整合到植物染色体上整合的方式如何整合到染色体上的外源基因是否正确表达等问题就成为重要的研究课题根据外源基因表达的不同水平对外源基因的检测和鉴定可以分为三个水平进行整合水平转录水平和翻译水平本文从外源基因表达的不同水平阐述转基因植物的检测与鉴定外源基因整合水平的鉴定检测外源基因是否转化成功首先是对报告基因进行检测必要时再进行目的基因的检测检测目的基因需要采用分子杂交方法报告基因报告基因必须具有两大特点一是表达产物和产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在二是便于检测目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因大致分为两类抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因现在常用的报告基因主要有基因基因冠瘿碱合成酶基因H基因基因基因荧光素酶基因二氢叶酸还原酶基因等近年来绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因在植物基因转化及基因表达调控中得到应用并显示出较其他几个报告基因更大的优越性基因的检测基因具有以下优点①适用于各种生物的基因转化②检测方法简便无需底物酶辅因子等物质只要有紫外光或蓝光照射其表达产物就可以发出绿色荧光这对转化细胞的检测极为有利③便于活体检测十分有利于活体内基因表达调控的研究④检测时可获得直观信息有利于转基因植物安全性问题的研究及防范若此报告基因通过自然杂交扩散到其他栽培植物或杂草中时很容易通过光照获得直观信息基因的检测基因也是广泛用作转基因植物细菌和真菌的报告基因尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化试验中基因应用的最多基因端与其他结构形成的融合基因能正常表达所产生的融合蛋白仍具有活性这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件这是它的一大优点但是需要注意的是有一些植物在胚胎状态时能产生内源活性在转基因和代的子叶花粉和胚珠中检测到活性随着组织的成熟衰老表达逐渐停止在实验过程中要设定严格的阴性对照活性的检测方法有很多包括组织化学法色谱法荧光法等其中植物切片组织化学定位分析是分辨组织中不同细胞个体和不同的细胞类型基因表达差异的一种有效方法转基因植株的检测聚合酶链式反应是首选的转基因产品检测方法技术能够有效地扩增低拷贝的靶片段可以检测到每克样品含有～的转化基因成分对转基因产品大分子量检测的灵敏度可以达到样品含量的因为的高度特异性及检测所需的模板量仅为以内所以为外源基因整合的检测提供了便利条件尤其是在转化材料少又需及早检测的时候现在已经利用该技术对欧美杨番茄辣椒葡萄豆瓣菜小麦等转基因植物进行鉴定是转基因植物鉴定中最简单最常用的方法检测具有用量少操作简单成本低耗时少不需要同位素等优点但检测也存在缺点由于扩增十分灵敏有时会出现假阳性扩增因此检测只能作为初步结果杂交证明外源基因在植物染色体上整合情况的最可靠方法是杂交只有经过分子杂交鉴定为阳性的植株才可以称为转基因植物年第期牡丹江师范学院学报自然科学版总第期收稿日期利用杂交~可以确定外源基因在植物中的组织结构和整合位置~拷贝数以及转基因植株世代外源基因的稳定性]分子杂交是进行核酸序列分析~重组子鉴定及检测外源基因整合表达的强有力手段~它具有灵敏性高~特异性强的特点~是当前鉴定外源基因整合及表达的权威方法杂交可以清除操作过程中的污染以及转化愈伤组织中质粒残留所引起的假阳性信号~准确度高~但杂交程序复杂~成本高~且对实验技术条件要求较高根据杂交时所用的方法~核酸分子杂交又可分为印迹杂交<>~斑点<>杂交或狭缝<>杂交和细胞原位<>杂交等现在已在水稻]~玉米~大白菜]~豆瓣菜]~马铃薯~杏~烟草等植物中得到广泛应用外源基因转录水平的鉴定转录水平上的检测方法主要就是杂交~它以和探针杂交的技术检测基因在转录水平上的表达杂交杂交和杂交相比~更接近性状表现~更具有现实意义~被广泛用于转基因植物的检测~]~现已用于杨树~豆瓣菜~马铃薯~草莓~烟草等转基因植物的检测中但提取条件严格~在材料内含量不如高~不适于大批量样品的检测检测<>也是检测外源在植物体内转录表达的一种方法如果从细胞总提取物中得到特异的扩增条带~则表明外源基因实现了转录此法简单~快速~但对外源基因转录的最后决定~还需与杂交的实验结果结合外源基因表达蛋白的检测外源基因编码的蛋白在转基因植物中能够正常表达并表现出应有的功能是植物基因工程的最终目的杂交杂交是集蛋白质电泳~印迹和免疫测定为一体的检测方法它具有很高的灵敏性~可以从植物细胞总蛋白中检出的特异蛋白质~若是提纯的蛋白质~可检出～杂交检测目的基因在翻译水平的表达结果~可得知被检植物细胞内目的蛋白是否表达~表达的浓度大小及大致的分子量能直接显示目的基因在转化体中是否经过转录~翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现一般来讲~杂交的结果与性状表现有直接关系~]检测<酶联免疫吸附法>是一种利用免疫学原理检测抗原~抗体的技术由于酶的放大作用~使测定的灵敏度极高~可检测出的目的物~同时酶反应还具有很强的特异性除了可溶性抗原<抗体>之外~还可以检测含表面抗原的细胞该方法已用于辣椒~水稻~烟草~番茄~]等转化植株的鉴定工作中的检测虽然很灵敏~但容易出现本底过高的问题~应予以充分的注意蛋白检测试纸蛋白检测试纸是一种基于的改进方法或者~用于转基因植物表达量的检测]先将特异性抗体吸附在膜上~将膜蘸入样品溶液~蛋白质随着液相扩散~遇到抗体~发生抗原抗体反应~通过阴性对照筛选阳性结果~给出转基因成分含量的大致范围此方法操作简单~费用低~耗时少<～>原位杂交检测原位杂交技术目前在植物基因工程研究中已成为外源基因在染色体上整合定位及在组织细胞内表达定位的主要方法原位杂交技术主要有同位素原位杂交和荧光原位杂交<>~使用放射性同位素标记~放射自显影检出该方法灵敏性强~对于单拷贝的序列检出非常有效原位杂交可以分为三个层次:①染色体原位杂交~可以确定外源基因在染色体上的整合位置及整合方式~还可以研究外源基因的整合方式对外源基因遗传稳定性~外源基因表达的影响~以及不同的转化方式与外源基因整合方式的关系等重大机理问题;②组织细胞原位杂交~对特定的基因表达的进行组织细胞分布的空间定位~获得外源基因在植物组织细胞内表达情况<是否表达~表达位置~表达量等>;③外源基因表达蛋白的组织细胞免疫定位~指利用外源基因表达蛋白的抗体~通过免疫反应确定表达蛋白在转基因植物组织及细胞中的分布该方法也是研究转基因植物中外源基因功能~外源蛋白稳定性及功能蛋白含量的重要手段检测方法的评估用提取方法对目的基因进行检测方法简便~适合大批量样品的分析~又能检测目的基因的完整性~是早期检测的较好方法]~~杂交分别从整合~转录~翻译水平检测外源基因~是检测外源基因最经典~最可靠的方法虽然现在出现了一些像~等功能类似~方便快捷的检测技术~然而由于其技术本身的原因~还不能取代以上技术在转基因植物检测和鉴年第期牡丹江师范学院学报!自然科学版"# !总第期"定上的权威地位随着科学技术的发展 各种新的检测方法也在不断涌现 例如生物传感器筛选法 远红外线光谱法 定量 实时基因芯片等 每种检测方法都有其自身的优点和不足 应该根据不同的检测目的和要求 选择合适的方法 在实际工作中把几种方法结合运用 可获得外源基因不同表达水平的信息 是准确检测转基因植物产品的合理策略参考文献王学聘 卞祖娴 张晋华 等 欧美杨转基因植物的 检测 林业科学 朱新产 导入外源 对小麦基因表达的影响 西北植物学报 刘建强 孙仲序 赵春芝 转基因植物鉴定方法的研究概况 山东林业科技 李乃坚 袁四清 卡那霉素胁迫对转基因烟草种子发芽的影响 广东农业学报毛慧珠 唐惕 曹湘玲 等 抗虫转基因甘蓝及其后代的研究 中国科学 辑编辑 琳莉收稿日期 基金项目 黑龙江发展高新技术产业专项资金无基质喷雾栽培法生产脱毒小薯的研究于洪涛黑龙江省农业科学院绥化研究所 黑龙江绥化摘要 研究了无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不同品种 不同苗来源及不同收获方式对块茎产量的影响 结果表明 无基质喷雾栽培法生产马铃薯小薯以扦插苗分期收获效果最佳 无基质喷雾栽培比较适合栽培早熟品种以早大白最佳 关键词 无基质 马铃薯 脱毒小薯 中图分类法 文献标识码 文章编号在马铃薯良种繁育体系中 原种的生产是关键环节 其质量的高低和数量的多少直接影响马铃薯的生产 无基质喷雾栽培法是一种极有前途的核心种薯生产方法 其主要技术是将适于马铃薯不同发育时期的营养液适时适量地喷于保持在黑暗状态下的马铃薯植株根际 使马铃薯根际获得充分的养分 促进马铃薯块茎的生长 马铃薯喷雾栽培技术在我国尚属起步阶段 提高其生产效率是生产实践中亟待解决的问题 为此 本试验对无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不年第 期牡丹江师范学院学报 自然科学版总第 期转基因植物的检测与鉴定作者：宫雪超， 于丽杰， 高金秋， GONG Xuechao， YU Lijie， GAO Jinqiu作者单位：哈尔滨师范大学环境与生命科学院,黑龙江,哈尔滨,150025刊名：牡丹江师范学院学报（自然科学版）英文刊名：JOURNAL OF MUDANJING TEACHERS' COLLEGE(NATURAL SCIENCES EDITION)年，卷(期)：2007(1)被引用次数：3次1.Datta S K;A Petew 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农杆菌转化法及转基因植物检测方法
农杆菌转化法及转基因植物检测方法摘要：近年来，植物基因工程技术飞速发展，转基因植物在很多领域的研究推广取得了令人瞩目的成绩。
植物基因工程中常用的转化方法一般是通过土壤农杆菌系统、植物病毒系统和DNA直接导入法这三种方法进行。
另外，转基因技术快速发展的同时转基因植物检测技术也在不断地进歩和完善，目前被广泛应用的转基因植物检测方法有三类：整合水平上的检测、转录水平上的检测和表达水平上的检测。
本文着重对农杆菌介导的植物转化方法和转基因植物的检测两方面进行综述。
关键词：农杆菌，转化，转基因植物，检测方法伴随着生命科学的飞速发展，植物组织培养技术以及植物组织分化、植物基因重组等技术发展迅速并得到广泛应用。
1984年转基因烟草的诞生[1]，使外源基因导入植物细胞从而获得转基因新品种的设想成为现实。
随后，转基因技术被广泛应用于各个方面如：植物新品种的改良、植物性状改良、植物抗性的提高以及植物基因功能的研究等[2-4]。
新型转基因大豆、转基因番茄及转基因玉米等转基因新品种陆续面世[5]。
植物转基因技术不但能够打破植物的物种界限，还能够使物种基因彼此进行交流。
使植物育种年限缩短，植物育种进程加快，植物抗性也在一定程度上得到很大提高，使来自于不同生物种类的优良目的基因导入植物并得到优良植物新品种。
同时，运用转基因技术研究植物自身基因结构组成及其基因功能调控等方面也取得了一定成果；运用转基因技术还研制出生物反应器和雄性不育系[6]。
目前，利用转基因技术将目的基因导入植物基因组中的常用方法主要有：土壤农杆菌介导的基因转化、DNA直接导入和植物病毒系统介导法。
本文着重介绍土壤农杆菌介导的目的基因转化法，同时也对目前转基因植物的检测进行适当总结。
1 土壤农杆菌介导系统的种类土壤农杆菌中的发根农杆菌和根癌农杆菌能够侵染植物伤口并形成与土壤农杆菌中大质粒有关的植物肿瘤和冠瘿。
能够诱发此类肿瘤的根瘤农杆菌中常常带有分子量为200-250kb的Ti质粒。
转基因植物的分子检测与鉴定方法及进展
转基因植物的分子检测与鉴定方法及进展随着分子生物学和植物基因工程的不断发展，越来越多的育种工作者开始利用转基因技术获得常规育种技术难以得到的新种质和新品种。
植物转基因技术最大的好处在于可以打破自然界物种间原有的生殖隔离，促进基因在不同物种间的交流，极大地丰富变异类型，增大遗传多样性，为植物新品种的培育提供丰富的育种资源。
通过对基因功能的研究，筛选m目的基因，还可实现植物性状的定向改良。
因此该技术自1983年首次获得转基因植物以来，便深受育种工作者青睐，得到了蓬勃地发展。
至今已有30多科约200多种植物转基因成功；国际上相继有30多个国家批准3 000多例转基因植物进入田间试验，并且在美国、加拿大、中国等20多个国家成功进行了商品化生产…。
到2006年止，全球转基因作物的商业种植面积达1．02亿hm2，比2005年增长13％，是1996年的62倍。
转基因作物品种在农业生产中日益显现出巨大潜力。
植物转基因操作中，除利用抗生素抗性和除草剂抗性等选择基因排除非转化细胞而留存转化细胞，以及利用Gus和CFP等报告基因显示转基因成功外，更重要的是从分子水平鉴别出阳性转化体，明确目的基因在转基因植株中的拷贝数和转录与表达情况。
本文就常用的转基因植株检测与鉴定方法作一概述，并对近期发展起来的新方法做简要介绍。
1 外源基因整合与否及其整合拷贝数的鉴定1．1 PCR(p01 ymera se chain reaction)检测1．1．1 常规PCRPCR技术对目的片段的快速扩增实际上是一种在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下利用DNA聚合酶的酶促反应，通过3个温度依赖性步骤(即变性、退火和延伸)完成的反复循环。
经PCR扩增所得目的片段的特异性取决于引物与模板DNA间结合的特异性。
根据外源基因序列设计出一对引物，通过PCR反应便可特异性地扩增出转化植株基因组内外源基因的片段，而非转化植株不被扩增，从而筛选出可能被转化的植株。
第十章 转基因植物的检测与鉴定
二、外源基因整合的PCR-Southern检测
该方法是先对被检测材料进行外源基因的PCR扩增， 然后再用目的基因的同源探针与扩增的特异性条带 进行杂交。 注意：设置三个对照 空白对照：无任何DNA模板；
阳性对照：以外源基因的重组质粒DNA为模板；
阴性对照：以非转化植株基因组DNA为模板。
图28-3地高辛标记探针杂交体检出原理示意图
3、标记方法
放射性标记有体内标记法及体外标记法。体外 标记法包括化学法、酶法和PCR法
酶法：是先将标记物标记在核苷酸上，然后通
过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸 序列中，产生合适探针。 包括切口平移法及随机引物法。
PCR法：是利用Taq酶可将修饰的核苷酸掺入到 PCR产物中（如32P-dNTP、地高辛-dUTP荧光素 标记的dNTP）所得PCR产物可用作探针。 化学法：是通过标记物的活性基团与核酸分子 中的某种基团发生化学反应而继续标记，标记 物直接与核酸分子相连。
抗生物素蛋白可与酶、荧光素等物质结合，是抗生物 素蛋白被这些物质标记，杂交时，生物素标记探针与 被检的单链DNA中同源序列杂交，检出时，加入被酶等 标记物标记的抗生物素蛋白，生物素与被标记的抗生 物素蛋白特异结合，形成杂交DNA-生物素-抗生物素酶等标记物的杂交检出体系，根据抗生物素蛋白上的 标记物性质进行检出。
一、ELISA检测
1、抗体的制备
抗体：是机体应抗原刺激产生的一组特殊的 球蛋白，Ig表示。
ELISA检测中涉及的抗体有两种，未标记的抗 体和酶标记的抗体，酶标记的抗体有包括两 种：一是针对特异抗原的酶标一抗，一是针 对一抗的酶标二抗。
植物基因转化与转基因植株鉴定
3. 目标基因 PCR 扩增 采用 PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 高保真酶从玉米 cDNA 中扩增 ZmMKK4 全长编码序列（GenBank 序列号：NM_001158890.1）。 ZmMKK4 扩增引物：F-ZmMKK4，R-ZmMKK4。 25μL 反应体系为：5 μL 5× PrimeSTAR Buffer (Mg2+ Plus)，2 μL dNTP Mixture (各 2.5 mM)，1μL 上游引物（5μM），1μL 下游引物（5μM），1 μL cDNA，0.25 μL PrimeSTARTM HS DNA Polymerase，加 ddH20 至 25μL。PCR 扩增程序为 98C 98C 58C 72C 72C 1～3 min 10 s 15 s 1.5 min 10 min
图 1 外源基因转化流程图
三、实验目的和实验要求 目的： 学习和掌握从基因分离克隆到植株转化及转基因植株的筛选整个实验 体系。 要求： 综合利用前面的单个实验环节所掌握的知识， 获得完整的实验理念， 并在实验过程中学会设计、构建适合的载体并将外源基因转化植株。 四、实验材料和方法 （一）实验仪器 PCR 仪， 凝胶成像系统， 台式高速离心机， 台式高速冷冻离心机， DU 640 紫 外分光光度计，UV-2450 分光光度计，精密 pH 计，微量移液器，控温摇床，电 子天平，制冰机，-80C 超低温冰箱，电热恒温水浴锅，自动电热压力蒸汽灭菌 器，超净工作台，光照培养箱等 （二）试剂及配方 Trizol试剂，RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit，DNase I，2× PCR Master Mix，FastDigest 限制性内切酶，T4 DNA Ligase，PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 高保真酶， pEASY-Blunt C， 质粒提取试剂盒 （E.Z.N.A. Gel Extraction Kit） ， 凝胶回收试剂盒 （E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I） ， DNA提取试剂盒， Kanamycin （Kan） ，Ampicillin（Amp） ，Carbenicillin（Cb） ，电泳缓冲液，LB培养基、YEB 培养基，烟草培养基如下表1.
植物转基因的操作流程
植物转基因的操作流程
植物转基因的操作流程主要包括以下步骤：
1. 选取目标基因并克隆
根据需要改良的性状选取对应的基因，并利用分子生物学技术从已知的基因库中克隆出该基因的DNA序列。
2. 构建基因载体
基因载体是将外源基因导入目标细胞中的工具。
将已克隆好的目标基因插入基因载体的适当位点，并加入一些必要的辅助元件（如启动子、终止子和激活子等）来调控基因的表达。
3. 转化植物细胞
把构建好的基因载体经过化学方法或物理方法导入目标植物细胞中，使其成为转基因细胞。
4. 筛选转基因植物
利用特定筛选工具（如抗生素抗性或苯丙烯酰胺酶等）来区分转基因细胞和非转基因细胞，从而筛选出转基因植物。
5. 鉴定转基因植物
采用多种方法（如PCR、Southern blot、Northern blot等）来验证转基因植物中是否成功导入了目标基因，并确定其正确性
和表达级别。
参考资料：
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转基因实验报告
转基因实验报告转基因实验报告引言：转基因技术是一种通过改变生物体的基因组来获得新的性状的方法。
它在农业、医学、环境保护等领域具有广泛的应用前景。
本篇报告将对转基因实验进行详细的描述和分析。
一、实验目的本次实验的目的是通过转基因技术将一种抗虫基因导入植物中，以提高植物对害虫的抵抗能力。
通过观察转基因植物与普通植物的差异，评估转基因技术在农业领域的应用潜力。
二、实验设计我们选取了一种常见的作物植物作为实验对象，将一种抗虫基因导入其基因组中。
通过基因工程技术，我们将目标基因与载体DNA连接，并利用农杆菌介导转化技术将其导入植物细胞中。
随后，通过培养、筛选和鉴定，获得了转基因植物。
三、实验过程1. 基因克隆：从抗虫植物中提取目标基因的DNA序列，并利用PCR技术扩增目标基因。
2. 载体构建：选择适当的载体，将目标基因与载体DNA连接，形成重组DNA。
3. 细胞转化：将重组DNA导入农杆菌中，利用农杆菌介导转化技术将目标基因导入植物细胞中。
4. 培养和筛选：将转基因植物细胞培养在含有适当选择剂的培养基上，筛选出含有目标基因的转基因植物细胞。
5. 鉴定和培育：通过PCR、Southern印迹等技术对转基因植物进行鉴定，并进行后续培育。
四、实验结果经过一系列的实验步骤，我们成功获得了含有目标基因的转基因植物。
与普通植物相比，转基因植物在抗虫方面表现出显著的优势。
在虫害侵袭下，转基因植物的叶片损伤较轻，生长状态更为健康。
这表明转基因技术在提高农作物抗虫能力方面具有巨大的潜力。
五、讨论与分析转基因技术在农业领域的应用引发了广泛的争议。
一方面，转基因技术可以提高农作物的产量和抗病虫能力，有助于解决全球粮食安全问题。
另一方面，人们对转基因食品的安全性和环境影响存在担忧。
因此，在推广转基因技术的过程中，需要加强科学研究，确保转基因作物的安全性和可持续性。
六、结论通过本次转基因实验，我们成功将抗虫基因导入植物中，获得了具有抗虫能力的转基因植物。
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定1. 引言植物基因转化是一种重要的生物工程技术，利用这种技术可以引入外源基因或修改内源基因，从而改变植物的性状和功能。
转基因植物是通过植物基因转化技术获得的具有外源基因的植物，具有重要的应用价值。
本文将介绍植物基因转化的基本原理和方法，并探讨转基因植物的分析与鉴定方法。
2. 植物基因转化的基本原理和方法2.1 基本原理植物基因转化利用穿透细胞壁的技术，将外源DNA导入植物细胞，通过细胞的内源机制使其稳定地表达。
常用的植物基因转化方法包括农杆菌介导的转化、生物弹射法和基因枪法等。
2.2 基本方法2.2.1 农杆菌介导的转化农杆菌介导的转化是最常用的植物基因转化方法之一。
基本步骤包括构建表达载体、感受剂的处理和遗传转化的选择和鉴定。
构建表达载体时，将目标基因插入适当的载体上，并添加转录和翻译的调控序列，如启动子和终止子，以确保目标基因的表达。
感受剂的处理是将表达载体导入农杆菌中，并通过培养条件的优化，使农杆菌中的表达载体得到高效表达。
遗传转化的选择和鉴定是将感受剂经过适当的处理后，转化到植物细胞中，并通过筛选和鉴定来确定转化成功的细胞株。
2.2.2 生物弹射法生物弹射法是将DNA以高速撞击植物细胞，使其穿透细胞的质壁和细胞膜，进而将外源基因导入细胞内。
生物弹射法通常使用微粒子加速器或毛发管射击法进行。
微粒子加速器是一种将金属微粒或微球与外源DNA一起加速，并将其发射到目标细胞上的设备。
通过微粒的高速撞击，外源基因能够穿透细胞的质壁和细胞膜。
毛发管射击法是将DNA包裹在微小的金属颗粒上，然后使用高压气体将金属颗粒射击到目标细胞上。
这种方法也能够使外源基因穿透细胞膜进入细胞。
2.2.3 基因枪法基因枪法是将外源DNA包裹在金粒或微米级金属颗粒上，并使用高压气体或炮发射器将其穿过细胞质，进入植物细胞。
基因枪法不需要依赖转化菌或细胞融合等辅助手段，直接将外源DNA送入目标细胞，因此具有较高的成功率。
植物转基因技术的原理和方法
植物转基因技术的原理和方法
植物转基因技术的原理和方法
植物转基因技术，又称作基因工程技术，是将外源的非植物基因植入植物体内的一种技术，它通过改变植物的遗传特性，实现改良植物的性状的一种技术。
其特征是跨物种边界的转化，从而获得转基因植物，即拥有外源基因的植物。
转基因植物的建立步骤主要有以下三个：
第一步：获取准备好的外源基因，外源基因来源于微生物、动物或其他植物，这些基因要有良好的质量和纯度。
第二步：植物基因转移，将外源基因转移到植物体内，常见的方法有包括靶向转化、花粉转化、有限期转化等。
第三步：育种筛选，将转化后的植株繁殖繁育，并筛选出拥有新基因的植株，最终建立转基因植物。
转基因技术是综合运用基因工程和植物育种技术的一种生物学技术，它有助于改良植物的性状和提高植物的产量，同时允许植物具有抗病能力、抗虫能力、耐高盐胁迫能力等特性，此外，它还有助于改良植物的树形、叶片颜色、叶绿素含量、抗旱性等。
转基因技术从本质上来说，是一种改良植物品质的有效手段，可以让植物拥有一些有用的新使命。
转基因植物的检测与鉴定
第七章转基因植物的检测与鉴定主要内容一、PCR检测二、报告基因的表达检测三、Southern杂交鉴定四、Northern杂交鉴定五、外源基因表达蛋白的检测六、其它方法根据国内外几十年的研究，目前认为转基因植物的证据应有以下几点：①要有严格的对照（包括阳性及阴性对照）；②转化当代要提供外源基因整合和表达的分子生物学证据（PCR检测、Southern杂交，Northern 杂交，Western杂交）与表型数据（酶活性分析或其它）；③提供外源基因控制的表型性状证据（如抗虫、抗病等）；④根据该植物的繁殖方式（有性繁殖还是无性繁殖）提供遗传证据。
有性繁殖作物需有目的基因控制的表型性状传递给后代的证据，无性繁殖作物有繁殖一代稳定遗传的证据。
一、PCR检测1.概述2.基本原理3.特点4.步骤一、PCR检测1. 概述PCR是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）的简称。
它模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，根据检测的目的片段及一定的原则设计引物，与模板DNA经过变性、退火、延伸三步骤的数个循环，对特异DNA序列进行扩增，可以在一只小小的离心管中几小时内使目的DNA 片段扩增数百万倍。
一、PCR检测1. 概述PCR检测所需的模板量仅为10ng以内，而且粗提的DNA就可以得到良好的扩增效果，因而这一技术的出现为外源基因整合的检测提供了便利条件，尤其是在转化材料少又需及早检测的时候。
但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩增，因此检测的只是初步结果。
穆利斯(Kary Mullis 1944～)美国化学家Nobel prizewinners in chemistry 1994一、PCR检测2.基本原理•DNA模板变性双链DNA是通过94℃左右的高温使其发生变性，形成单链DNA。
•模板与引物退火将合成的两个寡核苷酸引物分别与待扩增DNA 两端的序列互补。
通过控制退火条件，引物就能准确地与扩增区域的两端配对。
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植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定〖实验目的〗1．了解创建烟草突变体库的方法；2．理解每种方法的基本原理；3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。
〖实验原理〗随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。
植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。
在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。
与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。
最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。
烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。
突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。
通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。
T-DNA 载体构建转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子筛选T2，获突变子，应为3:1分离确定T-DNA与突变型共分离的个体产生纯合后代克隆T-DNA两侧的植物DNA（Tail PCR)利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因基因功能的验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化突变体，回复功能）图实验4-1 T-DNA标签克隆基因的基本流程TAIL-PCR分离法是利用多个嵌套的T-DNA插入序列特异性引物（根据T-DNA中靠近右边界处的核苷酸序列设计的引物，Tm值57-62℃和一个短的随机简并引物（AD，Tm值44-46℃）组合，以突变体基因组DNA为模板，进行多次PCR反应，采取高温特异性扩增与低温随机扩增相间进行的方法，最后获得T-DNA插入侧翼区特异性扩增片段（实验图4-2），可作为探针，筛选分离基因。
TAIL-PCR分离法可以降低非侧翼区特异产物的背景，同时它可以产生2个以上嵌套的目的片段，与其它方法相比TAIL-PCR 方法具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特点，已经在拟南芥和水稻等植物中获得了成功及广泛的应用。
实验图4-2 TAIL-PCR反应流程图本实验用含T-DNA载体质粒pCAMBIA1301的LBA4404农杆菌菌株转染烟草愈伤组织，让T-DNA随机插入烟草的基因组中形成T-DNA突变体，通过PCR特异扩增HPT基因片段来鉴定转基因烟草，以TAIL-PCR法获得转基因烟草突变体的侧翼基因片段，测序后将获得侧翼基因片段的序列与GeneBank中的已知序列对比，获得功能基因的全序列。
〖仪器、材料和试剂〗（一）仪器高速冷冻离心机，PCR仪，超净工作台，恒温摇床，隔水式恒温培养箱，光照培养箱，紫外可见分光光度计，凝胶成象仪或Dark Reader，恒温水浴锅，微孔加热器，电泳仪，水平板电泳槽，天平，酸度计，旋涡混合器。
（二）材料烟草幼苗，含T-DNA载体质粒pMD83rc的LBA4404农杆菌菌株，Ex-taq DNA 聚合酶，DNA 1kb laddeer，GoldView核酸染料。
（三）试剂1. 2×CTAB提取液100mmol/L Tris-HCl pH8.02％（w/v）CTAB1.4mol/L NaCl40mmol/L b-巯基乙醇20mmol/L EDTA2. TE缓冲液10mmol/L Tris-HCl pH8.01mmol/L EDTA3. 50´TAE电极缓冲液1000mlTris 54g硼酸27.5g0.5mol/L EDTA 20ml4. 10％次氯酸钠5. 氯仿：异戊醇(V:V，24：1)6. 70％乙醇7. 溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris.HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0）100ml8. 溶液III：60ml 5mol/L乙酸钾，11.5ml 11.5％冰乙酸，28.5ml无菌水100ml9. 溶液II：分别配制0.4 mol/L NaOH和2％SDS溶液（各30ml），用时1:1混合10. LB液体培养基配制每升培养基，应在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(bacto-typtone) 10g酵母提取物(bacto-yeast extract) 5gNaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，加入200uL 5mol/L NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1升，121℃高压灭菌20分钟。
11. MS基本培养基大量元素mg/L 微量元素mg/L 有机营养mg/LNH4NO31650 KI 0.83 甘氨酸 2.0KNO31900 H3BO3 6.2 烟酸0.5 CaCl2·2H2O 440 MnSO4·4H2O 22.3 盐酸吡哆醇（Vb6）0.5 MgSO4·7H2O 370 ZnSO4·7H2O 8.6 盐酸硫胺素（Vb1）0.lKH2PO4170 NaMoO4·2H2O 0.25 肌醇100CoCl2·6H2O 0.025CuSO4·5H2O 0.025FeSO4·7H2O 27.8配制方法母液：大量元素（50×）400mL硝酸铵33g；硝酸钾38g；磷酸二氢钾3.4g；七水合硫酸镁7.4g；铁元素（100×）200mL七水合硫酸亚铁0.556g；七水合EDTA二钠0.746g；有机营养（100×）200mLGly 0.040g；VB1 0.002g；VB6 0.010g；肌醇2g；烟酸0.010g；微量元素（1000×）200mL碘化钾166mg；硼酸1240mg；一水合硫酸锰3380mg；七水合硫酸锌1720mg；二水合钼酸钠44mg；五水合硫酸铜5mg；六水合氯化钴5mg；氯化钙（50×）400mL 氯化钙8.8g12. 愈伤组织诱导与分化培养基：MS基本培养基＋0.2mg/L 6-BA＋0.02mg/L NAA＋3%蔗糖＋0.6%琼脂其中6-BA 取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL；NAA取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL；2,4-D取50mg用少量1M NaOH溶解后定容到100mL；以上激素母液均为0.5mg/mL13. 筛选培养基：MS基本培养基＋0.2mg/L 6-BA ＋0.02mg/L NAA＋3%蔗糖＋0.6%琼脂＋100mg/L羧苄青霉素14. 抗生素母液的配制KANA（50mg/mL）1g KANA溶于20mL蒸馏水；RIF（50mg/mL）0.25g RIF溶于少量乙醇再定容至50mL；STR（30mg/mL）0.6g STA溶于20mL蒸馏水；羧苄青霉素（100mg/mL）2g羧苄青霉素溶于20mL蒸馏水。
潮霉素B（50mg/mL）可以直接购买〖实验步骤〗I 烟草外植体的无菌培养和诱导再生1. 烟草叶片预培养：取烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。
在超净工作台中将叶片浸于70％酒精中30秒，然后移入10％的次氯酸钠溶液中5～10分钟（消除外植体表面的微生物）。
无菌水至少洗涤3次（消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净），每次停留3～5min。
将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm大小块或用6mm打孔器凿成圆盘。
2. 烟草叶片的诱导再生：自行设计MS培养基中的NAA、6-BA植物激素浓度，诱导烟草叶片生根或生芽；将上述处理过的无菌叶片接种在含有不同浓度植物激素的MS固体培养基中，每周定期观察并更换培养基。
II 转基因烟草的培养1. 农杆菌的培养：将含T-DNA载体的农杆菌单菌落接种到20ml LB液体培养基中（Kana50ug/ml、RIF、STR），27℃，180r／min振摇培养过夜。
将2ml菌液转入20ml LB液体培养基中，与上述的相同条件培养6小时左右，使菌液达到OD600＝0.2～0.5，用来侵染烟草叶片。
2. 烟草叶片预培养：取烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。
在超净工作台中将叶片浸于70％酒精中30秒，然后移入10％的次氯酸钠溶液中5～10分钟（消除外植体表面的微生物）。
无菌水至少洗涤3次（消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净），每次停留3～5min。
将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm大小块或用6mm打孔器凿成圆盘。
3. 愈伤组织转化：在80r/min摇床上旋转浸染5～10分钟。
将叶外植体置于无菌滤纸上吸去多余的菌液（如果叶片粘附细菌过多，可以在无菌水中漂洗1～2次）。
4. 共培养：将侵染过菌液的叶片接种在MS愈伤组织诱导和分化培养基上，在26℃黑暗条件下共培养3天。
5. 筛选培养与分化：将共培养处理的烟草叶片转移到凝固后的筛选培养基上（100ug/L羧苄青霉素和50ug/L潮霉素B，羧苄青霉素起到抑制农杆菌生长的作用。
如果农杆菌生长未被抑制，农杆菌将抑制叶外植体的生长）。
每隔3～4天继代一次，培养条件为，光照2000lx，温度26℃，日照16h。
4周后转基因细胞分裂生长形成大量愈伤组织并有根、芽分化。
接种烟草叶片于无激素的MS培养基上培养，培养条件同上，同时作为对照实验（无愈伤组织生长和器官分化）。
Ⅲ转基因烟草的检测1. 剪取培养后的转化烟草和前期实验未转基因烟草叶片小片，液氮中研磨至粉末状，加入0.5mL65℃预热CATB抽提液65℃水浴抽提30min，间歇混匀；2. 取上清各加入0.5mL氯仿异戊醇（体积比24:1）去除蛋白，12000rpm离心10min；3. 取上清加入1体积预冷异丙醇至-20℃出沉淀30～60min，8000rpm离心15min；4. 弃上清，70%乙醇洗涤2次干燥，避光保存；5. 加入15μL蒸馏水溶解并电泳检测（0.7%琼脂糖凝胶电泳）；6. 提取pMDC83rc质粒：（1）3-5ml过夜菌12000rpm离心1min，弃上清；（2）加300μL预冷溶液I，颠倒混匀6-8次；（3）加300μl新鲜不预冷溶液II，颠倒混匀6-8次；（4）加300μl预冷溶液III，颠倒混匀6-8次；（5）12000 rpm 15min，转移上清液；（6）加入0.5倍体积的异丙醇，混匀，室温放置3min，如上离心12min；（7）弃上清，70%乙醇洗沉淀；（8）空气干燥，20ml 蒸馏水溶解，-20℃贮存。