绿色荧光蛋白分子实验 PPT

4、连接产物转化大肠杆菌
实验原理：转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一原核细胞，使受体细胞获得新的遗 传性状的一种手段，它是微生物、分子遗传、基 因工程等研究的基本实验技术。
感受态细胞：在自然条件下,很多质粒都可通过细菌 接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载 体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能 自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如 需将质粒载体转移进受体细菌，需将对数生长期的 细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通 透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子 进入的细胞，称感受态细胞。
实验结果
PCR产物回 收的检验 电泳图。
条带清晰。
3、目的基因与载体的连接
原理：在Mg2 和ATP存在下，T4 DNA连接酶能催化 载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联 接成重组DNA分子。
影响DNA连接反应的因素：
1、连接缓冲液的影响：20-100mmol/L的TriBiblioteka Baidu-HCl，较多
试验方法——热休克法
10 L载 体DNA
40L感 受态菌
On ice混合， 静置10min
200L转化液 +16ulIPTG+40u lX-Gal，涂含抗
菌素的平板
37℃摇1h
42ºC 45秒
加入1mL LB培养基
检验是否从大肠杆菌中提取出质粒DNA 的电泳图。
影响转化率的因素
➢细胞生长状态和密度:
注意事项及影响因素：
1.对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5~2%之间，低浓 度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小 片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼 脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近 的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
2、电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注 意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升， 缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则 的DNA带迁移的现象。
用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，目的是提供合适酸碱 度的连接体系； 25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质 的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。 2、 连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链 间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，传统 上将连接温度定为16℃，时间为4-16h。现经实验发现， 对于一般的黏性末端来说，低温连接较长的时间可取得 较好的连接效果。
不要用经过多次转接或储存于４℃的培养菌，最好从－ 70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态 细胞。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通 过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不 同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
实验结果
pcr扩增获得 目的基因的 凝胶电泳图
PCR产物
模板跑胶条带 几乎看不到。
引物
2、凝胶电泳回收目的基因
基本原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应 和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负 电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上 的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电 荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
4、退火温度对PCR的特异性有较大影响。
5、变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增 失败。
6、循环数——过多易产生非特异扩增。
7、酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶 的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴 乙锭。
8、引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引 物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效 率的不对称扩增。
绿色荧光蛋白报告基因的克隆
1. PCR扩增获得目的基因
基本原理：多聚酶链式反应是DNA的 体外酶促扩增。是利用两个短的单链 引物，在体外快速扩增特异DNA片段 的技术。应用热稳定的聚合酶，通过 双链DNA模板的热变性、引物退火和 引物延伸的重复循环，使目的DNA片 段在一定时间以指数方式增加百万倍。
3、注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带 模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐， 用酚可以去除蛋白。
4、注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也 可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA 样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。
5、正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的 DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上 样量则导致带信号弱甚至缺失。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
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3、 酶浓度的影响：日常使用的DNA浓度比
酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用
量要比连接黏端大10-100倍。
4、 DNA浓度的影响：要求得到环化的有效
连接产物， DNA浓度不可过高，一般不会超过 20nmol/L。要求线性化的连接产物， DNA的浓 度可以高些，至少是接近推荐的浓度。
9、变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极 有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异 性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效 率。
10、靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整 个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性；二是空气中的小片段 核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼 接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生。
影响因素：
1、dNTP的质量与浓度——dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密 切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。
2、模板（靶基因）核酸——模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败 与否的关键环节之一。
3、Mg2+浓度——Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响， 在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为 1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特 异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。