实验五--核酸琼脂糖凝胶电泳
实验五 DNA的限制性酶切和电泳
实验五 DNA的限制性酶切和电泳实验五dna的限制性酶切和电泳实验五dna的限制性酶切和琼脂糖电泳一、实验目的掌握dna的限制性酶切的基本原理和琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术二、实验原理1、dna的限制性酶乌限制性内切酶是基因操作中不可缺少的工具酶，它能够识别双链dna的特定位点并切开dna，这个特定位点是一段具有旋转对称结构的dna片段。
绝大多数的管制酶辨识长度为4~8个核苷酸且呈圆形二重等距的如上所述序列。
ecori的辨识序列就是g↓aattc，bmhi的辨识序列就是g↓gatcc，hindiii的辨识序列就是a↓agctt。
每种限制性内切酶都有特定的反应条件，如特定的ph范围，缓冲液组分，温育温度等，具体的使用也可参考有关的工具书或文献或产品说明。
一般温度37℃，ph7.5~8.0对大多数酶来讲是适合的，但缓冲液的组分则变化很大，典型的组分应有tris、nacl、mgcl2，和巯基试剂(如巯基乙醇或二硫苏糖醇)。
典型的反应体系中包含lμg或更太少的dna和1单位酶以及最合适的反应介质。
反应总体积通常掌控在20和50μ之间，反应时间在1小时，而反应的中止则由edta溶液的重新加入顺利完成，因为它能够鳌再分核酸酶活性所所需的金属离子。
2、dna的琼脂糖电泳dna的电泳存有琼脂糖电泳和共聚丙烯酰胺电泳，它们就是拆分、鉴别和提纯dna片段的标准方法。
dna的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。
在ph值为8.0－8.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。
琼脂糖凝胶电泳所需样品量仅0.5~1ug。
琼脂糖凝胶对dna的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至50kb的dna。
而分离小片段dna（5~500bp）则需采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，其分辨力极高，能分离相差1bp的片段。
琼脂糖凝胶电泳分离核酸分子量
琼脂糖凝胶电泳分离核酸分子量
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的核酸分子量分析方法。
在琼脂糖
凝胶电泳中，核酸样品首先被混合到琼脂糖凝胶中，然后通过电场
进行分离。
琼脂糖凝胶的孔隙大小会影响核酸分子的迁移速度，从
而实现分子量的分离。
琼脂糖凝胶电泳分离核酸分子量的过程中，我们需要考虑一些
因素。
首先是琼脂糖的浓度，不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离不同
范围大小的核酸分子。
其次是电场的强度和时间，这些参数会影响
核酸分子的迁移速度和分离效果。
另外，还需要考虑使用何种缓冲
液来维持电泳过程的稳定性。
在实际操作中，我们通常会使用DNA或RNA分子量标准品作为
参照物，通过与标准品的比较来确定待测核酸分子的分子量。
此外，琼脂糖凝胶电泳也可以结合染色剂如乙溴化蒽酮（Ethidium Bromide）来观察核酸分子的迁移情况，从而进一步分析核酸的分子量。
总的来说，琼脂糖凝胶电泳是一种简单而有效的核酸分子量分
析方法，通过合理设置实验条件和对照标准品，可以准确地分离和
测定核酸分子的分子量。
这种方法在生物学和分子生物学领域被广泛应用，为研究人员提供了重要的实验数据。
琼脂糖凝胶电泳实验
琼脂糖凝胶电泳实验⼀、实验原理：琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA ⽚段的常⽤技术。
把DNA样品加⼊到⼀块包含电解质的多孔⽀持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。
由于DNA分⼦的双螺旋⾻架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。
在⼀定的电场强度下，DNA分⼦的迁移速度取决于分⼦筛效应。
具有不同的相对分⼦质量的DNA⽚段泳动速度不⼀样，因⽽可依据DNA分⼦的⼤⼩来使其分离。
凝胶电泳不仅可分离不同分⼦质量的DNA，也可以分离相对分⼦质量相同，⽽构型不同的DNA分⼦。
在电泳过程中可以通过⽰踪染料或相对分⼦质量标准参照物和样品⼀起进⾏电泳⽽得到检测。
相对分⼦质量标准参照物相对可以提供⼀个⽤于确定DNA⽚段⼤⼩的标准。
在凝胶中加⼊少量溴化⼄锭(ethidium bromide, EB)或者ＥＢ类似物，其分⼦可插⼊DNA的碱基之间，形成⼀种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红⾊荧光，因此也可对分离的DNA进⾏检测。
⼀般琼脂糖凝胶电泳适⽤于⼤⼩在0.2kb～50kb范围内的DNA⽚段。
三种不同构型分⼦进⾏电泳时的迁移速度⼤⼩顺序为：超螺旋DNA>线性DNA>开环DNA正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的⽤来进⾏⼤⽚段核酸的电泳，⾼浓度的⽤来进⾏⼩⽚段分析。
低浓度胶易碎，⼩⼼操作和使⽤质量好的琼脂糖是解决办法。
注意⾼浓度的胶可能使分⼦⼤⼩相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
适合的电泳缓冲液常⽤的缓冲液有TAE和TBE，⽽TBE⽐TAE有着更好的缓冲能⼒。
电泳时使⽤新制的缓冲液可以明显提⾼电泳效果。
注意电泳缓冲液多次使⽤后，离⼦强度降低，PH 值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产⽣条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
Marker的选择DNA电泳⼀定要使⽤DNA Marker或已知⼤⼩的正对照DNA来估计DNA⽚段⼤⼩。
琼脂糖凝胶电泳检测实验报告
琼脂糖凝胶电泳检测实验报告一、实验目的本实验旨在通过琼脂糖凝胶电泳检测方法，对DNA分子进行分离和检测，掌握琼脂糖凝胶电泳技术的操作步骤和原理，并了解其在生物学领域中的应用。
二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离DNA分子的方法。
其原理是利用电场作用力将DNA分子从样品中移动到凝胶中，并根据DNA分子大小不同，在凝胶中形成不同迁移距离的带状图案。
根据带状图案可以得到DNA片段大小及其相对含量。
三、实验步骤1.制备琼脂糖凝胶：将1g琼脂糖加入100ml TAE缓冲液中，加热搅拌至溶解，冷却至60℃左右时倒入模具中，待冷却成固体后取出。
2.制备DNA样品：将待检测DNA样品加入适量TAE缓冲液中，使其浓度为50ng/ul。
3.装载样品：取出制备好的琼脂糖凝胶，将其置于电泳槽中，加入适量TAE缓冲液，然后将DNA样品注入琼脂糖凝胶孔中。
4.进行电泳：将电泳槽盖好，接通电源，设定电压和时间，进行电泳。
5.染色和成像：取出琼脂糖凝胶，进行染色处理，然后用成像仪拍摄带状图案。
四、实验结果通过琼脂糖凝胶电泳检测方法，成功分离出待检测DNA样品中的DNA分子，并形成了带状图案。
根据带状图案可以看出不同大小的DNA片段在凝胶中形成了不同迁移距离的带状图案。
五、实验分析1.影响DNA迁移距离的因素：DNA片段大小、琼脂糖浓度、电场强度等因素都会影响DNA分子在凝胶中的迁移距离。
一般来说，较小的DNA片段在相同条件下迁移距离较大。
2.应用领域：琼脂糖凝胶电泳技术广泛应用于生物学领域中对DNA分子的检测和分析。
例如，可以用于分析DNA序列、检测基因突变等。
六、实验总结通过本次实验，我们掌握了琼脂糖凝胶电泳技术的操作步骤和原理，并了解了其在生物学领域中的应用。
同时，我们也发现琼脂糖凝胶电泳技术具有操作简单、成本低廉、结果可靠等优点，是一种常用的DNA分子检测方法。
最新实验五植物基因组DNA提取知识讲解
注意事项
1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 CTAB 抽提 液充分混匀；
2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添 加巯基乙醇（2－5％），尽可能选取幼嫩的材料；
3）收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再 溶解难；
4）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采 用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同 时还要避免核酸降解酶类的降解。
核酸的理化性质
DNA为白色类似石棉样的纤维状物， RNA的纯品 呈白色粉末或结晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于 水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比 游离酸易溶于水。
在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液 中较稳定。
操作步骤 细胞破碎
抽提去蛋白质 沉淀核酸
3. 12000r/min 离心 5min，取上清液700μL转到另一离心管 中。加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒 混匀。12000r/min，离心 5min。抽提去蛋白
4．将上清液移入新的1.5mL离心管内，加 600µL异丙醇。颠 倒混匀，可见 DNA 絮状沉淀。沉淀核酸
5．12000r/min，离心 1min，倒掉上清液，将离心管倒置干 燥。 将沉淀回溶于20µL TE 缓冲液待测。
作用： ①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 ②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 ③使样品呈色，使加样操作更方便。
核酸染色剂
溴化乙锭（EB）
是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在 紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正 比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng。
05 实验五 DNA的限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳(λ DNA,Hind III)(考核15%)
理和适用范围有什么异同？
如果用EcoR
I酶解λ DNA，电泳后的胶
图会如何？
解释限制性核酸内切酶专一性的机理。
器材
电泳仪（DYY-2C），水平电泳槽 微量加液器（10 uL），枪头（10 离心管0.5 mL，离心管架 恒温水浴
uL）
凝胶成像仪（Gel Logic
Gold
淹没胶孔。
制样
1号样：2 uL λ DNA + 18 uL 蒸馏水 + 5 uL 加样缓冲液，混匀，取10 uL点样。 2号样：20 uL λ DNA酶切液 + 5 uL加样
缓冲液，混匀，取10 uL点样。
点样
吸取10
uL样液；
将枪头贴近样孔上沿，略微插入样孔；
（注意：枪头不要戳破胶孔底部）
212 PRO）
view溶液
10×Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，
100 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 二硫苏糖醇， 500 mmol/L NaCl ）
试 剂
5×TBE缓冲液：Tris[111] 54
g，硼酸
[61.83] 27.5 g，20 mL 0.5 mol/L EDTA
0.5×TBE电泳缓冲液：用5×TBE液稀释 Gold
View：每100 mL琼脂糖胶加5 uL
试 剂
加样缓冲液（5×）（Loading dye）
溴酚蓝 （300 bp） 二甲苯腈蓝 （4000 bp） 蔗糖（甘油） Tris-HCl
思考题
加样缓冲液中各个组分的作用是什么？ 琼脂糖电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳的原
轻轻将样液一次连续注入样孔。
质粒的提取及凝胶糖凝胶电泳鉴定
实 验 步 骤
50 mM 葡萄糖 25 mM Tris-HCl 10 mM EDTA-Na2
200 mM NaOH 1% （W/V） SDS
2
5 min
3 M NaAC
省去Leabharlann 30 min 以上四、DNA的琼脂糖凝胶电泳原理
不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电 泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带。
8.12000rpm，4℃，离心10min，弃上清，将管口倒置于纸巾上使所有液体尽 可能流出。
9.加入1ml70%乙醇洗沉淀一次。12000rpm，4℃，离心10min。 10.弃上清，将管口倒置于纸巾上使液体流尽，放置干燥或真空干燥，即得质粒 DNA制品。 11.将沉淀溶于20ulTE缓冲液，（临用前加入1u 或20ug/ml RNaseA）待用。
细菌质粒是基因工程中常用的基因载体，也是 分子生物学中研究基因结构、功能及其复制、表达 的好材料。
二、实验原理
碱变性抽提法法是常用的方法之一. 此法基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性差异而达
到分离的目的。
在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺 旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺 旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用 pH4.8 的 Kac 高 盐 缓 冲 液 调 节 pH 至 中 性 时 ， 变 性 的 质 粒 DNA又恢复到原来的构型，以可溶性状态存在于液相中， 而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳 定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。
2.凝胶板的制作： 用1cm宽的胶带纸沿平板电泳槽模板两 端边缘围成高4mm的墙，在其一端放置样品梳。将准备好的 模板置于水平台上，迅速将上面 胶液倒在模板的中央，让胶液自 由流向四周。待胶液充分冷却凝 固，将胶纸围墙慢慢取下，制备 好的凝胶板放入电泳槽中，加电 泳缓冲液直至没过胶面约1mm深， 取出样品梳。
琼脂糖凝胶电泳 实验报告
琼脂糖凝胶电泳实验报告琼脂糖凝胶电泳实验报告引言：琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离和分析生物大分子的方法。
它基于琼脂糖凝胶的孔隙大小，通过电场作用下分离样品中的不同分子。
本实验旨在通过琼脂糖凝胶电泳技术，分离并分析DNA样品中的不同片段。
实验材料与方法：1. 实验材料：-琼脂糖凝胶：用于制备凝胶基质，提供分离分子的孔隙。
-缓冲液：用于维持凝胶的pH值和离子浓度稳定。
-DNA样品：包含待分离的DNA片段，可通过PCR扩增获得。
2. 实验步骤：（1）制备琼脂糖凝胶：将适量琼脂糖加入缓冲液中，加热搅拌至溶解，待冷却至大约60℃时，倒入凝胶模具中，插入梳子，待凝胶完全固化后，取出梳子。
（2）样品处理：将待分离的DNA样品与DNA加载缓冲液混合，加热至95℃，使DNA变性，然后迅速冷却至室温。
（3）电泳分离：将凝胶模具放入电泳槽中，加入足够的缓冲液，将DNA样品加入凝胶孔中，连接电源，施加适当电压，进行电泳分离。
结果与讨论：经过电泳分离后，我们观察到琼脂糖凝胶上出现了一系列DNA条带。
这些条带的迁移距离与DNA片段的大小成反比，即较小的片段迁移距离较远，较大的片段迁移距离较短。
实验结果的解释可以通过琼脂糖凝胶电泳的原理来理解。
琼脂糖凝胶的孔隙大小决定了不同大小的DNA片段在凝胶中的迁移速度。
较小的DNA片段能够更容易通过凝胶孔隙，因此迁移距离较远；而较大的DNA片段则受到凝胶孔隙的限制，迁移距离较短。
通过对DNA条带的大小和形状进行分析，我们可以获得关于DNA样品的重要信息。
例如，我们可以确定样品中是否存在特定的DNA片段，或者在PCR扩增中是否成功地放大了目标片段。
总结：琼脂糖凝胶电泳是一种简单而有效的生物大分子分离和分析方法。
通过电泳分离DNA样品，我们可以快速获得关于样品中DNA片段的信息。
这种技术在分子生物学、遗传学等领域有着广泛的应用，对于研究和诊断基因相关的疾病具有重要意义。
在今后的研究中，我们可以进一步探索琼脂糖凝胶电泳的应用，并结合其他分析技术，提高实验的准确性和灵敏度。
生化实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳
加样缓冲液
0.25%溴酚蓝（深蓝色，300bp) 0.25% xylene cyanlo FF （天蓝色，2000bp） 40%蔗糖
EB（溴化乙锭）染色液（有毒）
0.5ug /ml，用水配制
溴化乙锭(ethidium bromide，EB)
每一种限制性内切酶都有特定的反应条件 pH范围：7.5~8.0
缓冲液组份: Tris(三羟甲基氨基甲烷） NaCl、MgCl2、 巯基乙醇
温度：37℃
琼脂糖凝胶电泳
是一种简便、快速的分离纯化 和鉴定核酸的方法。
琼脂糖是一种线性多糖聚合 物。琼脂糖粉末加热到熔点后冷 却凝固,会形成良好的电泳介质。
是一种扁平分子荧光染料，可嵌入核酸 的碱基对之间，在紫外线激发下，发出 桔红色荧光。
电泳结束后，将凝胶浸入 0.5ug/ml的EB 溶液中染色10min。在紫外光照射下可见 核酸电泳带，DNA量一般>5ng。
操作步骤
酶切反应
反应体系
λ－DNA 10 x Buffer Hind III H2O
电泳
在电场的作用下，在某种支持介 质上，将一个混合物分离成若干条 区
琼脂糖浓度(%)
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 12.0
线型DNA分离范围(Kb)
5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.9～6 0.2～3 0.1～2
试剂
TBE电泳缓冲液
Sample 1自提DNA 5ul+2ul Loading Dye Sample 2自提DNA酶切液20ul+4ul Loading Dye Sample 3λ-DNA 5ul+2ul Loading Dye Sample 4λ-DNA 酶切液20ul+4ul Loading Dye
实验五--核酸琼脂糖凝胶电泳
实验五核酸琼脂糖凝胶电泳一、实验目的琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。
本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。
二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。
琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。
DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率也不同。
溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。
但是EB具有致癌性，所以我们选用无毒，高灵敏度是Ex Green染料，。
此核酸染料在紫外透照仪及可见光透射仪上均可使用。
ExGreen外观呈红色，与核酸结合后，可用300 nm（紫外透射仪）激发。
三、材料、仪器和试剂1、材料大肠杆菌中提取的质粒DNA2、仪器电泳仪；台式离心机；恒温水浴锅；微波炉；紫外透射仪；照相机或者凝胶成像系统3、试剂（1）50×TAE电泳缓冲液：称取Tris 242g，EDTA 37.2g，加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解，加入57.1ml的醋酸，充分搅拌，加去离子水定容至1L，室温保存。
（2）6×电泳上样缓冲液：0.25%溴酚蓝、40%（W/V）蔗糖水溶液，贮存于4℃。
（3）溴化乙锭（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/mL。
用铝箔或黑纸包裹容器，贮存于室温即可。
（4）分子量标准DNA：DNA Marker四、操作步骤1、制备1%琼脂糖凝胶(大胶用40ml，小胶用30ml)：称取0.7 g(0.5 g) 琼脂糖置于锥形瓶中，加入70 ml(50ml) 1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。
微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。
实验五 琼脂糖凝胶电泳分离DNA
2、胶板的制备
①取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内 槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。
②将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。
③将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶液（约40ml），缓缓倒入 有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面
（注意不要形成气泡）。
④待胶完全凝固后，双手轻用力取出梳子（注意勿使样 品槽破裂），即可见到长方形孔格，取下橡皮膏，放在 电泳槽内。
⑤加入1×TAE电泳缓冲液至电泳槽中，使胶板淹没。
3、点样
①取8μl DNA样品液与2μl 溴酚蓝染液(体积比:4/1) 混合 。
②用微量移液器分别加入 到凝胶板的点样孔内。每 个点样孔加10μl左右。
注意：加样时，移液 器枪头穿过缓冲液小心插 入点样孔，但不要损坏点 样孔，然后缓慢地将样品 推进孔内让其集中沉于孔 底部。
三、材料与试剂
➢ 1、材料：
①提取的叶片总DNA
➢ 2、试剂
① 50×TAE（50倍体积的TAE贮存液）
配100ml 50×TAE：
Tris
24.2g
冰醋酸
5.71ml
0.5mol/L EDTA 10ml（pH8.0）
用前稀释成1×TAE 。
② 凝胶加样缓冲液（6×）：
溴酚蓝 0.25%
蔗糖 40%
4、在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料（如 溴酚蓝），用以指示样品移动的距离。
七、作业
为什么要在制琼脂糖凝胶时加入溴化乙锭？
相对分子质量不同的DNA分子，移动速度也不同， 所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。
3、0.6~1.4%琼脂 糖凝胶适用于
不同浓度琼脂糖分离DNA分子的 范围
PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测
实验五 PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测一、实验目的1. 掌握PCR扩增技术的基本原理2. 掌握PCR的常规操作3. 熟悉PCR反应体系中几种主要成分的作用4. 了解PCR技术的应用5. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法6. 熟悉DNA在电泳过程中迁移率的决定因素二、实验原理1. PCR基本原理聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增DNA，类似DNA的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量（106倍）的要扩增的DNA片段。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。
重复循环“变性—退火—延伸”三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
2. PCR反应体系3. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法，其特点为简便、快速。
琼脂糖凝胶电泳实训报告
一、实验目的通过本次实训，掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作步骤，学习利用琼脂糖凝胶电泳技术分离、鉴定DNA片段，并了解实验结果的分析方法。
二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分子生物学技术，利用琼脂糖凝胶作为电泳介质，根据DNA分子大小和所带电荷的不同，在电场作用下实现DNA分子的分离。
琼脂糖凝胶是一种多聚糖，具有良好的胶凝性和稳定性，其形成的凝胶具有网状结构，孔径大小可调节，能够对DNA分子进行筛选和分离。
在琼脂糖凝胶电泳过程中，DNA分子在电场作用下向正极移动，其迁移速率受到以下因素的影响：1. DNA分子的大小：分子越大，迁移速率越慢。
2. DNA分子的电荷：在高于其等电点的pH溶液中，DNA分子带负电荷，向正极移动。
3. 电场强度：电场强度越大，DNA分子的迁移速率越快。
4. 琼脂糖凝胶的孔径：孔径越大，分子迁移速率越快。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：DNA样品、琼脂糖、电泳缓冲液、DNA分子量标准品、TAE缓冲液、DNA染色剂等。
2. 实验仪器：电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、微量移液器、凝胶成像系统等。
四、实验步骤1. 准备琼脂糖凝胶：按照实验要求配制TAE缓冲液，加入琼脂糖，加热溶解后，冷却至60℃左右，加入DNA样品，混匀后倒入电泳槽，待凝胶凝固。
2. 准备DNA分子量标准品：将DNA分子量标准品稀释至适当浓度，备用。
3. 加样：将DNA样品和DNA分子量标准品分别加入琼脂糖凝胶的样品孔中，注意避免样品溢出。
4. 电泳：接通电源，调整电压至适当值，进行电泳。
5. 染色：电泳结束后，取出凝胶，加入DNA染色剂，染色5-10分钟。
6. 观察结果：使用紫外透射仪观察凝胶，记录DNA片段的迁移距离，并与DNA分子量标准品进行比较，分析实验结果。
五、实验结果与分析1. 观察到DNA分子量标准品在琼脂糖凝胶中形成了清晰的区带，且区带之间的距离与DNA分子量大小呈正相关。
2. 实验样品在琼脂糖凝胶中也形成了清晰的区带，且区带大小与DNA分子量标准品相符。
琼脂糖凝胶电泳实验报告
琼脂糖凝胶电泳实验报告一、实验目的琼脂糖凝胶电泳是一种用于分离和分析 DNA、RNA 等核酸分子的常用技术。
本次实验的目的在于：1、掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。
2、学会制备琼脂糖凝胶，以及正确上样和电泳。
3、能够通过电泳结果判断核酸样品的质量和大小。
二、实验原理琼脂糖是一种从海藻中提取的线性多糖聚合物。
当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固，便会形成网状结构的凝胶。
核酸分子在电场中会向正极移动，由于其分子大小、电荷等性质的差异，在琼脂糖凝胶中的迁移速度不同，从而实现分离。
较小的分子在凝胶中迁移速度较快，较大的分子则迁移较慢。
此外，核酸分子带负电荷，在电场作用下会从负极向正极移动。
通过在凝胶中加入核酸染料（如溴化乙锭），可以在紫外线照射下观察到核酸分子的条带。
三、实验材料与设备1、材料DNA 样品（已知大小的标准 DNA 样品和待测 DNA 样品）琼脂糖50×TAE 电泳缓冲液（Tris乙酸EDTA 缓冲液）核酸染料（溴化乙锭）上样缓冲液（6×Loading Buffer）2、设备电泳仪水平电泳槽微波炉移液器紫外透射仪四、实验步骤1、制备琼脂糖凝胶根据所需凝胶浓度（通常为 08% 2%），称取适量的琼脂糖粉末，加入一定体积的 1×TAE 电泳缓冲液。
例如，制备 1%的琼脂糖凝胶，可称取 1g 琼脂糖加入 100ml 的 1×TAE 缓冲液。
将混合液在微波炉中加热，使其完全溶解，期间需小心搅拌，避免溶液溢出。
待溶液冷却至 50 60℃时，加入适量的核酸染料（如溴化乙锭），轻轻摇匀。
将溶液倒入已放置好梳子的电泳槽中，使其自然凝固。
2、样品处理取适量的 DNA 样品，与上样缓冲液按一定比例混合。
上样缓冲液的作用是增加样品密度，使样品能够沉入加样孔，同时含有指示染料，便于观察电泳进程。
将混合后的样品短暂离心，使样品集中在管底。
3、加样凝胶凝固后，小心拔出梳子，形成加样孔。
核酸质量检测——琼脂糖凝胶电泳
核酸质量检测——琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作为介质的一种电泳方法，其兼具“分子筛”和“电泳的双重作用。
琼脂糖(Agarose)是一种线性多糖聚合物，是从红色海藻产物琼脂中提取而来的，当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的。
经过化学修饰的低熔点的琼脂糖，在结构上比较脆弱，因此在较低的温度下便会熔化，可用于核酸片段的电泳检测。
琼脂糖凝胶电泳检测的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大(超出电泳分离范围)，该方法的可信度非常高。
琼脂糖凝胶电泳的原理荧光染料检测核酸的存在观察琼脂凝胶中核酸的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭(EB) 进行染色，所用的荧光染料含有一个可以嵌入核酸的堆积碱基之间的荧光基团，当染料与核酸结合后呈现荧光。
核酸吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，被结合的染料本身在302nm和366nm有光吸收，这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来，因此，当凝胶中含有游离的EB时即可以检测到DNA和RNA的存在。
注1：由于EB具有很强的毒性，因此在操作时一定要戴手套，并且最好有专门的区域进行电泳检测实验。
注2：可以使用GoldView染料代替EB，其具有相同的检测效果，同时毒性要低很多。
电泳区分核酸大小核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，琼脂糖凝胶电泳即根据这个原理对核酸进行区分。
核酸分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于核酸的戊糖-磷酸骨架在结构上具有重复性，长度相同的核酸链几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
此外，含有琼脂糖的凝胶具有网状结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在琼脂糖凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。
琼脂糖凝胶电泳检测
凝胶成像分析系统
Lambda DNA / EcoRI + HindIII Marker （Ferments）
一个已知分子质量的 DNA样品做最对照， 用来确定待测样品的 相对分子质量。
• 凝胶电泳系统和电泳图像分析系统(凝胶成 像系统)等。
• 琼脂糖、 1XTBE电泳缓冲液、溴化乙锭、 6X载样缓冲液 （ 6X loading buffer）和DNA 分子量标准（ Lambda DNA / EcoRI + HindIII Marker ）等。
凝胶电泳系统
美国Bio-rad伯乐 小型水平电泳槽Mini-Sub Cell GT Cell
（2 ）加样： 5μl质粒DNA+1μl loading buffer ，混匀
15μlPCR产物+3μl loading buffer，混匀 10μl酶切产物+2μl loading buffer，混匀
6μlDNAMark （每板胶加一孔）
（3 ）电泳：电压3-5V/cm，约80-90V，注意电极方向 （4 ）染色：EB染色约15min
• EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废 液要经过处理才能丢弃。
• SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样品 中，价格较昂贵。
【五】实验步骤
1. 制备琼脂糖凝胶（1%） 2. 制备凝胶板 3. 加样 4. 电泳 5. 染色 6. 结果观察
（1）制备凝胶和胶板：
45ml(1×TBE)+0.4g琼脂糖（ 三角瓶 ）， 煮胶，溶解，冷却至60℃(不烫手)，倒板(46mm)，室温下充分凝固，竖直拔下梳子 。 胶板设计（44人）： • 每18孔胶板（5人X3样品+1marker），8胶板 • 每8孔胶板（2人X3样品+ 1marker ），2胶板
核酸琼脂糖凝胶电泳原理
核酸琼脂糖凝胶电泳原理核酸琼脂糖凝胶电泳是一种常用的核酸分离和分析技术，通过将要分析的核酸样品经电泳后分离出来，然后通过染色或探针检测，可以对核酸的大小、数量和纯度进行评估。
通过核酸琼脂糖凝胶电泳技术，可以对DNA和RNA进行分离并确定其分子大小。
首先，准备琼脂糖凝胶：琼脂糖以适量的氯化镁或琼脂糖缓冲溶液溶解，并在特定的pH下扩展成薄膜。
一旦薄膜凝固，形成了网络状结构，这种网络隔离出了分子间的交互作用。
接下来，将琼脂糖凝胶进一步加工成水平槽状凝胶，如琼脂糖凝胶板或琼脂糖凝胶膜。
准备样品，核酸样品通常通过酶切或PCR等方法获得。
然后，将核酸样品与DNA负载缓冲溶液混合。
DNA负载缓冲溶液包含了一些溶剂和染料，用于将维持样品在琼脂糖凝胶上。
核酸样品与DNA负载缓冲溶液混合在一起，然后通过微量注射器或吸管将混合液注入凝胶的槽中。
在电泳开始前，需要连接电源和电流控制器。
一般情况下，较长的核酸碱基会较慢地从电极朝相反方向迁移。
所以，通常会设置短的碱基作为标记物，用于参考并标记分离的核酸样品。
运行电泳，核酸样品在电场的作用下开始迁移。
核酸样品经由DNA负载缓冲溶液在琼脂糖凝胶上逐渐蠕动，较小的碱基会更快迁移。
时间过程中，不同大小的核酸样品会分离出来，在凝胶上形成各自的条带。
电泳结束后，通常使用染料或特定的底物对核酸样品进行染色，或者使用放射性探针或荧光探针进行检测。
这样就可以分析得到各个核酸样品的大小和纯度。
总结起来，核酸琼脂糖凝胶电泳原理是通过核酸在电场中的迁移，结合琼脂糖凝胶对核酸的分离效应，使核酸样品在凝胶上分离出不同大小的条带，以便进行分析和评估。
这种技术在生物学和分子生物学研究中广泛应用，对于核酸分离、纯化和检测具有重要意义。
琼脂糖凝胶电泳实验报告
琼脂糖凝胶电泳实验报告
实验目的：
本实验旨在通过琼脂糖凝胶电泳技术对DNA分子进行分离和检测，以便进一步研究DNA的结构和功能。
实验原理：
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分离和检测方法，其原理是利用DNA分子在电场中的迁移速度差异，通过琼脂糖凝胶的孔隙大小和DNA分子的大小来实现分离。
DNA分子在电场中迁移的速度与其分子大小成反比，因此较小的DNA片段会迁移得更快，而较大的DNA片段会迁移得更慢。
实验步骤：
1. 制备琼脂糖凝胶，按照实验指导书上的配方将琼脂糖加入缓冲液中，混合均匀后倒入凝胶板中，待其凝固成凝胶后形成孔隙结构。
2. 样品处理，将待检测的DNA样品加入负电荷的染料，使其在电场中迁移时能够被可视化。
3. 电泳操作，将样品加载到凝胶槽中，接通电源，让DNA在电场中迁移。
4. 结果分析，观察凝胶板上的DNA条带，根据迁移距离和大小，分析DNA
片段的大小和数量。
实验结果：
经过电泳分离，观察到了DNA条带在凝胶板上的分布情况。
根据条带的迁移距离和大小，我们成功地分离出了不同大小的DNA片段，并且可以进一步对其进行分析和检测。
实验结论：
通过琼脂糖凝胶电泳实验，我们成功地实现了对DNA分子的分离和检测。
这项技术在生物学和遗传学研究中具有重要意义，可以帮助科研人员更好地理解DNA的结构和功能，为进一步的研究奠定基础。
总结：
琼脂糖凝胶电泳是一种简单而有效的DNA分离和检测方法，通过本次实验，我们深入了解了其原理和操作步骤，并取得了令人满意的实验结果。
希望通过今后的实验实践和学习，能够更好地掌握这一技术，为科学研究做出更多的贡献。
DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤
一、实验目的琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。
二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。
DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
不同构型的DNA分子的迁移速度不同。
如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。
这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为: cccDNA＞IDNA＞ocDNA核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而 pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。
不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。
在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。
影响核酸分子泳动率的因素主要是：1、样品的物理性状即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。
一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。
但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。
对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。
DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA＞ID NA＞ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。
核酸的琼脂糖凝胶电泳
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五、影响凝胶电泳的因素 在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其 迁移速率由下列多种因素决定: 1、 DNA的分子大小: 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移 速率与DNA分子量对数成反比。 2、 琼脂糖浓度 一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同 浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数 与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分 子的大小。
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思考题： 1. 琼脂糖凝胶电泳的适用范围？ 2.当两条碱基数相差不大（比如50bp)的双链DNA 分子混在一起时，电泳时将采取什么措施将两 条DNA分子分开？
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3、 DNA分子的构象 当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离 不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量 的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度 是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移 动最慢。 4、 电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压 成正比。但电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将 缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所 加电压不得超过5v/cm。
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九、操作步骤 1、 取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成 0.5×TBE稀释缓冲液,待用。 2、 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶 中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电 炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂 糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼 脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份 蒸发。 3、 胶板的制备：将融化的琼脂冷却至50-60℃，而后 到 入 制胶模具 （ 预先插上样 品梳子）中， 待 胶 完 全 凝 固后拨出梳子 ，取出胶块，放入加有0.5×TBE 电泳缓 冲液的电泳槽内。
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实验五核酸琼脂糖凝胶电泳
一、实验目的
琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。
本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。
二、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。
琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。
DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率也不同。
溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。
但是EB具有致癌性，所以我们选用无毒，高灵敏度是Ex Green染料，。
此核酸染料在紫外透照仪及可见光透射仪上均可使用。
ExGreen外观呈红色，与核酸结合后，可用300 nm （紫外透射仪）激发。
三、材料、仪器和试剂
1、材料大肠杆菌中提取的质粒DNA
2、仪器电泳仪；台式离心机；恒温水浴锅；微波炉；紫外透射仪；照相机或者凝胶成像系统
3、试剂
（1）50×TAE电泳缓冲液：称取Tris 242g，EDTA 37.2g，加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解，加入57.1ml的醋酸，充分搅拌，加去离子水定容至1L，室温保存。
（2）6×电泳上样缓冲液：0.25%溴酚蓝、40%（W/V）蔗糖水溶液，贮存于4℃。
（3）溴化乙锭（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/mL。
用铝箔或黑纸包裹容器，贮存于室温即可。
（4）分子量标准DNA：DNA Marker
四、操作步骤
1、制备1%琼脂糖凝胶(大胶用40ml，小胶用30ml)：称取0.7 g(0.5 g) 琼脂糖置于锥形瓶中，加入70 ml(50ml) 1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。
微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。
注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的
2、胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。
将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。
在冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液中加入Ex Green染料（10ml:1ul），混匀后小
心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。
室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加1×TAE 电泳缓冲液至没过胶板1-2㎜为止。
注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。
加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。
微波炉中加热时间不宜过长。
倒胶时，不要产生气泡，溶液温度太高(>60℃)，会使得水分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。
3、加样：在点样板或EP管中混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。
用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染。
加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。
（注意：加样前要先记下加样的顺序)。
注意：加样时，要把枪头插入到加样孔里，但是不要插穿加样孔底部凝胶，保证样品尽量在加样孔中而不外溢。
4、电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。
电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。
5、电泳完毕后，取出凝胶
6、观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。
注意事项：
1、操作时带一次性手套，避免DNA酶污染引起DNA降解。
2、及时更换电泳缓冲液，电泳缓冲液在电泳槽中存放过，多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。
3、一般情况，电泳电压<20V/cm，温度<30℃；大分子量DNA链电泳，温度应<15℃。
4、电泳前样品勿受热，以免引起DNA变性。
5、凝胶中DNA的上量要合适，太多会引起DNA条带模糊，太少又会引起条带信号弱或无DNA条带。
思考题
1、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？
2、如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？。