骨组织形态计量学方法

2.5.4骨组织形态计量学方法

2.5.4.1 不脱钙骨骨标本的包埋

（1）包埋前单体（甲基丙烯酸甲酯）的洗脱方法

①将1500ml的甲基丙烯酸甲酯倒入分液漏斗（2L）中。

②加入5% NaOH溶液500ml，充分摇匀，静置，待溶液分层后，放出下层溶液，弃去。

③重复操作“2”三次，三次的总量与单体量相当（洗脱阻滞剂）。

④加入500ml蒸馏水，充分摇匀，静置，待溶液分层后，放出下层溶液，弃去。

⑤重复操作“2”三次，三次的总量与单体量相当（洗脱NaOH）。

⑥将上述处理过的单体放入无水CaCl2（1000 ml：500g）脱水2次。

⑦滤纸过滤，收集滤液。

⑧-20℃保存备用，第二天取出看有无冰晶漂浮：无，表明无水可备用；有，则需重新脱水。

（2）胫骨上段包埋前的制备过程

①暴露骨髓腔

将固定液中的胫骨用低速锯锯开，暴露骨髓腔，解剖部位如下：

②脱水

分别通过70%乙醇2天，95%乙醇2天，100%乙醇1天，100%乙醇1天，四个脱水过程，二甲苯透明1天。

③渗透

先后用浸液Ⅰ、浸液Ⅱ、浸液Ⅲ分别浸透2天。

三种浸液的配制方法如下：

浸液Ⅰ甲基丙烯酸甲酯90ml，邻苯二甲酸二丁酯10ml，磁力搅

拌器上搅拌3小时。

浸液Ⅱ甲基丙烯酸甲酯90ml，邻苯二甲酸二丁酯10ml，过氧化

笨甲酰1.0g，磁力搅拌器上搅拌4小时。

浸液Ⅲ甲基丙烯酸甲酯90ml，邻苯二甲酸二丁酯10ml，过氧化

苯甲酰2.5g，磁力搅拌器上搅拌6小时。

（3）包埋

用新鲜配置的浸液Ⅲ（当日配置）倒入装有浸润好的骨头块容积约为15 ml 的小瓶中，倒入的包埋剂约，盖好瓶盖，并在瓶盖上插一注射器针头，室温过夜。第二天把包埋瓶置入37-39℃的水育箱中聚合约48小时，直至包埋块形成。

若为胫骨中段骨，则需在包埋前几天预先倒入少量包埋剂于小玻璃瓶中作包埋块底衬，变硬后为1.5cm高为宜。包埋时将胫骨中段至于瓶中央，在倒入2cm高的包埋剂。若为胫骨上段，仅需将其锯开面贴瓶底中央包埋，倒入约3.5cm高的包埋剂即可。

2.5.4.2 不脱钙股组织片的制备

（1）载玻片的制备

①清洗

把玻片在酸缸中浸泡24小时，取出，先用自来水冲洗，后用单蒸水冲洗，晾干。

②上胶

称取1.8g明胶溶于200ml的双蒸水中，加热溶解明胶（90度）称取1g的硫

酸铬钾溶于25ml的双蒸水中，待其完全溶解后缓缓倒入沸腾的明胶溶液中，边加边搅拌，直至其完全溶解再停止加热，溶液室温冷却至60℃左右即可使用；将载玻片浸入60℃的胶液中2min，取出晾干后即可使用。

（2）切片

①打磨

用石膏打磨机将包埋块打磨成合适大小，并暴露切面，把切面打磨到合适位置。

②切片

将打磨好的块固定在切片机上，右手慢慢切下。同时，左手用一沾有40%乙醇的软毛刷轻轻地拨下切片，注意不要弄烂切下的片，然后用毛刷把片转移到滴有一滴70%酒精的载玻片上，再滴一滴70%酒精，然后漫漫展平切片，盖上一张薄塑料片，并用滤纸将多余的酒精吸干。一个标本切两种厚度的片5μm （薄片）和9μm（厚片）：薄片用于Masson-Goldner Trichrome染色数破骨细胞；厚片可直接封片，测量动态参数；或硝酸银染色，测量静态参数。

③烤片

将切好的一组片，用夹子夹稳，放入40℃左右的鼓风烤箱中烤4小时左右，取出备用。

（3）骨片染色

5μm的薄片常采用Masson-Goldner Trichrome染色，染色后，骨质为绿色，骨髓为红色，用于观察骨小梁表面的破骨细胞和测量其周长。9μm的厚片可采用硝酸银染色，染色后，骨质为黑色，反映矿化后的骨质，用于观察骨量和骨结构，下面是Masson-Goldner Trichrome染色过程。

①工作液的准备

A．Weigert hematoxylin工作液：溶液A含Mematoxylin（苏木素精）1g加入95%酒精100ml中过滤备用；溶液B含29%氯化铁4ml、稀盐酸1ml（用40%的盐酸加蒸馏水1:4稀释），然后加蒸馏水至100ml。将等份的溶液A和溶液B 混合即得工作液。

B. Poncean Fuchsin Stock工作液：配制溶液A含Poncean（丽春红）1g加

蒸馏水100 ml，溶液B含Acid Fuchsin（品红）1g加蒸馏水100ml；将3份的溶液A和1份的溶液B混合配成原液，然后将原液用0.2%的醋酸按5:1的比例稀释成工作液。

C. Phosphotungstic acid-Orange G工作液：将Orange G 2g和Phosphotungstic acid 4g加入100ml蒸馏水中，用前过滤。

D. Light green工作液：将Light green（亮绿）0.2g和醋酸0.2ml加入100ml 蒸馏水中，用前过滤。

②染色过程

脱塑剂2-Methyloxethyl acetate 25min 2次

↓

Weigerts hematoxylin工作液25min

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蒸馏水漂洗

↓

自来水漂洗10min

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蒸馏水漂洗

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Poncean-Fuchsin工作液染色17min

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1%醋酸漂洗2次，每次1min

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新鲜过滤的Orange G液染色7min

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1%醋酸漂洗2次，每次1min

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新鲜过滤的Light green染色15min-20min

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1%醋酸漂洗2次，每次1min