分析化学-高效液相色谱法
无机及分析化学第9章-高效液相色谱法
二、方法原理
5.亲和色谱法 主要利用生物大分子与固定相之间的特异亲和力 进行选择性分离及纯化的方法。
原理：于载体表面先键合具有一般反应性能的环氧或联氨（称 为间隔臂），然后再连接上配基。当含有复杂混合试样的流动 相流经这种经固定化的配基时，其中具有亲和力特性的生物大 分子与配基相互作用而被保留，无此作用的则被淋洗出；随后 ，改变流动相pH或组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形 式洗脱出来。
1.高压输液系统 一般由贮液器、脱气装置、高压输液泵、过 滤器、压力脉动阻尼器以及梯度洗脱装置等组成，其中高压输 液泵是核心部件。
（1）贮液器 用来贮存流动相，其材料对流动相是化学惰性的 。常用的材料为玻璃、不锈钢或表面涂聚四氟乙烯的不锈钢等
（2）过滤和脱气装置 流动相在使用前应根据其性质选用不 同材料的滤膜过滤，一般选用市售的0.45 m的水性和油性滤 膜进行过滤 。样品溶液一般用市售的0.45 m针形滤器过滤。 另外，在流动相入口、泵前、泵和色谱柱间都配置有各种各样 的滤柱和滤板。
一、分离类型的选择 色谱分离类型的选择原则列于图9－3中。
图9－3 PHLC分离类型的选择参考表
二、固定相和流动相的选择
（一）固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为 刚性固体和硬胶两大类。固定相按孔隙深度可分为表 面多孔型和全多孔型固定相。
1. 表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃球，在玻璃 球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离 子交换剂、分子筛、聚酰胺等。
例1 有机氯农药的测定，采用液－固色谱法。
色谱条件：50cm×2.5mm（内径）色谱柱；
三、HPLC法应用实例
流动相：正己烷； 固定相：薄壳硅胶 CorasilⅡ37~50μ m）；
简述高效液相色谱法中流动相的要求
简述高效液相色谱法中流动相的要求高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography，HPLC）是一种用于分离和分析化学、生物和制药样品的色谱技术。
在高效液相色谱过程中，流动相的选择和性能对分析的准确性和分离效果有着重要的影响。
下面将详细介绍高效液相色谱法中流动相的要求。
1.基础流动相特性：流动相应具有一定的极性和溶解性能。
常用的流动相包括水和有机溶剂，如甲醇、乙醇和乙腈等。
流动相的选择应考虑到待分离组分的性质和分析目的，要保证样品能够溶解并很好的分离。
常用的流动相配比为水/有机溶剂（如乙腈）的比例，比如常见的70:30、50:50等。
2.pH值调节：根据待分离物和色谱柱的性质，适当调节流动相的pH值可以改变待分离物的电离状态，从而影响它们在色谱柱上的分配行为。
比如，对于具有酸性基团的分析物，可以通过酸或碱的加入来调节流动相的pH值，以影响它们与色谱固定相之间的相互作用。
3.离子强度调节：有些样品中可能存在电解质，其离子强度会对分离产生影响。
在这种情况下，可以通过添加相应的盐来调节流动相的离子强度，以改变分析物与色谱固定相的相互作用。
常用的盐有甲酸铵、硫酸铵、三氟乙酸等。
4.流速控制：流动相的流速也对色谱分离的效果有着重要的影响。
流速过快可能导致分离不充分，流速过慢则会增加分析时间。
流速的选择需根据待分离物的性质、色谱柱的尺寸和色谱仪的性能等因素综合考虑。
5.除气和过滤：流动相中的气泡和杂质会影响液相的流动性和检测信号的稳定性。
因此，在使用前应对流动相进行除气处理，以减小气泡对色谱分离的干扰。
同时，对流动相进行过滤处理，可以去除其中的固体颗粒和微生物等。
通常使用0.45μm的滤膜进行过滤。
6.流动相稳定性：流动相应具有良好的稳定性，以保证分析结果的准确性和重复性。
一般来说，流动相中的溶液成分要充分溶解，不发生相分离和析出现象。
所以，流动相的配制要求严格，要遵循相应的配方和混合方法，并在使用前进行充分的搅拌和均匀。
高效液相色谱和超高效液相色谱
高效液相色谱和超高效液相色谱高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）和超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC），是现代分析化学中常用的分离技术。
它们可以对复杂的混合物进行分离和定量分析，广泛应用于药物分析、食品分析、环境分析、生物分析等领域。
本文将从原理、仪器、方法和应用等方面，介绍高效液相色谱和超高效液相色谱的基本知识。
一、原理高效液相色谱和超高效液相色谱的原理基本相同，都是利用样品在流动相中的分配系数差异，通过固定相和流动相的作用，将混合物中的化合物分离出来。
不同的是，超高效液相色谱采用了更小的颗粒固定相，使得流动相可以更快地通过固定相，从而提高了分离效率和分离速度。
在高效液相色谱和超高效液相色谱中，样品首先被注入流动相中，然后通过固定相的柱子。
固定相通常是一种多孔的固体材料，如硅胶、C18等。
样品中的化合物在流动相中的分配系数不同，因此在通过固定相时，会被分离出来。
分离出来的化合物，会在检测器中被检测到，从而实现分离和定量分析。
二、仪器高效液相色谱和超高效液相色谱的仪器基本相同，主要由注射器、流动相泵、柱子、检测器和计算机控制系统等组成。
（一）注射器注射器是将样品引入流动相中的关键部分。
常用的注射器有手动注射器和自动进样器。
手动注射器通常用于小样品量的分析，而自动进样器可以实现高精度、高效率的样品进样。
（二）流动相泵流动相泵是将流动相送入柱子中的装置。
其主要功能是控制流动相的流速和流量，并确保流动相的稳定性。
常用的流动相泵有恒压流量泵和梯度流量泵。
恒压流量泵可以保持恒定的流量，适用于等浓度的流动相。
梯度流量泵可以实现不同浓度的流动相混合，从而实现更好的分离效果。
（三）柱子柱子是高效液相色谱和超高效液相色谱的核心部分，用于固定相的分离。
常用的柱子材料有硅胶、C18、C8等。
什么是高效液相色谱(HPLC)
什么是HPLC（高效液相色谱）？简史和一些定义液相色谱(LC)是俄国植物学家Mikhail S. Tswett在20世纪初定义的概念。
他当时专注于使用填充有颗粒的柱子分离用溶剂从植物中提取的化合物[叶色素]，这是液相色谱史上的先驱性研究。
Tswett用颗粒填充开放式玻璃柱。
他发现粉状白垩[碳酸钙]和氧化铝这两种特殊材料对分离有用。
他将样品[均质化植物叶子的溶剂提取物]倒入柱中，使样品通过颗粒床。
然后使纯溶剂通过。
当样品在重力作用下穿过柱子时，可以观察到样品分成了不同颜色的谱带，这是因为某些组分的移动速度快于其他组分。
他将这些不同颜色的分离谱带与样品中最初包含的不同化合物联系起来。
根据各种化合物对颗粒的化学吸引力强度不同，对这些化合物进行了分析分离。
对颗粒有更强吸引的化合物移动速度减慢，而对溶剂有更强吸引的其他化合物移动速度较快。
该过程可以描述如下：样品中包含的化合物在称为流动相的移动溶剂与称为固定相的颗粒之间以不同的方式分布或分配。
这导致各种化合物以不同的速度移动，从而引起化合物的分离。
Tswett创造了色谱(chromatography)[来自希腊词chroma（意思是颜色）和graph（意思是书写）的组合，即“彩色的书写”）]一词来描述其色彩斑斓的实验。
[有趣的是，俄语名字Tswett的意思是颜色。
]目前，各种形式的液相色谱已成为分析化学领域的一种强大工具。
液相色谱(LC)技术液相色谱可使用平面技术[技术1和2]或柱技术[技术3]来实施。
柱液相色谱的功能更为强大，并且具有更高的样品容量。
在所有情况下，样品都必须先溶解在液体中，然后输送到色谱装置之上或色谱装置内部。
技术1.将样品以点状形式上样到固定在玻璃板表面上的色谱颗粒[固定相]薄层上，然后使液流流过该薄层。
板的底部边缘置于溶剂中。
当溶剂[流动相]扩散至干燥颗粒层并沿玻璃板向上移动时，通过毛细管作用产生液流。
这种技术被称为薄层色谱或TLC。
高效液相色谱法教学【全】精选全文
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
高效液相色谱方法及应用
高压输液泵及梯度洗脱装置
一、高压输液泵 高压输液泵可以分为以下两类： 1．恒流泵：可输出恒定体积流量的流
动相。 （1）注射式泵（又称注射式螺杆泵） （2）往复型泵 2．恒压泵：恒压泵又称气动放大泵，
一类是选择性检测器，如紫外一可 见分光光度检测器；
另一类是通用型检测器，如示差折 光检测器。
(1)紫外一可见分光光度检测器。
如今此技术已在分析咖啡中的黄嘌泠、调料中的核苷酸及核苷、果汁中的有机酸、米中的维生素、牛奶中的维生素D等都对食品营养价 值提供有效数据。 热不稳定物、离子型化合物及高聚物的分离及测量有困难，致使其应用受到了很大的限制。 又如止痛药或退烧药也可用此法分离并测得各组分的含量。 染料厂排出废水中的苯胺等。 用液相色谱分析简便迅速。 分析食品中的有毒成分，如苹果中农药萘乙酸、稻米中的黄曲霉素、鱼体中的有机汞等。是输出恒定压来自的泵。二、梯度洗脱装置
1．梯度洗脱（gradient elution）又称 停流进样是在高压泵停止供液、体系压力下降的情况下，将样品直接加到柱头。
一、与经典液相色谱法比较
为梯度淋洗或程序洗脱。在同一个分析 用离子交换柱和缓冲游泳梯度淋洗。
多种不同性能的配位体键联在固相基体上 分析食品中的有毒成分，如苹果中农药萘乙酸、稻米中的黄曲霉素、鱼体中的有机汞等。
高效液相色谱法的特点
一、与经典液相色谱法比较 经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装
填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经 色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱 入口压力低，仅有低柱效，分析时间冗长。
高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填 在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵 进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散 速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效 和高分离能力。
hplc的注意事项
HPLC，即高效液相色谱法，是一种在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着广泛应用的技术。
在使用HPLC进行实验时，需要注意以下事项：流动相的纯度：流动相必须是高纯度的，以保证色谱柱和检测器的性能。
如果流动相中含有杂质，可能会堵塞色谱柱，影响分离效果。
流动相的脱气：流动相在使用前需要进行脱气处理，以避免在实验过程中产生气泡，干扰实验结果。
样品处理：对于复杂的样品，需要进行适当的预处理，如提取、浓缩、纯化等，以去除干扰物质，提高分离效果。
色谱柱的清洗和维护：色谱柱是HPLC的核心部件，需要定期清洗和维护，以保证其性能和使用寿命。
检测器的选择：根据实验需求选择合适的检测器，如紫外检测器、荧光检测器等。
实验条件的选择：根据实验需求选择合适的实验条件，如流速、流动相组成、柱温等。
数据的记录和处理：实验过程中需要记录详细的实验数据，并采用适当的软件进行数据处理和分析。
总之，使用HPLC进行实验需要注意细节，严格遵守实验操作规程，以保证实验结果的准确性和可靠性。
高效液相色谱法
1971年科克兰等人出版了《液相色 谱的现代实践》一书，标志着高效液相 色谱法 (HPLC)正式建立。在此后的时 间里，高效液相色谱成为最为常用的分 离和检测手段，在有机化学、生物化学、 医学、药物开发与检测、化工、食品科 学、环境监测、商检和法检等方面都有 广泛的应用。高效液相色谱同时还极大 的刺激了固定相材料、检测技术、数据 处理技术以及色谱理论的发展。
高效液相色谱的特点
高压——压力可达150～300 kg/cm2。色 谱柱每米降压为75 kg/cm2以上。 高速——流速为0.1～10.0 mL/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中 同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达 0.01ng。同时消耗样品少。
高效液相色谱法基本原理
（1）正键合相色谱中，采用和反相液液分配色 谱相似的流动相，流动相的主体成分为己烷或庚 烷。 （2）反相键合相色谱中，流动相采用和反相液 液分配色谱相似的流动相，主题为水。 4.应用 （1）正键合相色谱法的应用：多用于分离各类 极性化合物如染料、炸药、多巴胺、氨基酸等； （2）反键合相色谱法的应用：由于操作简单， 稳定性和重复性好，该方法已成为一种通用型液 相色谱分析方法。在生物化学、医药研究、食品 分析和环境污染分析等多个领域有了很大的应用 和发展。
高效液相色谱 分析法
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一、概述
高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography 简称(HPLC) 高效液相色谱法 又叫做高压或高速液相色谱、高分离度液相色谱 或近代柱色谱,以液体为流动相，采用高压输液 系统，是色谱法的一个重要分支。 它是用高压 输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的 混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色 谱柱，经进样阀注入待测样品，由流动相带入柱 内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器进 行检测，从而实现对试样的分析。这种方法已成 为化学、生化、医学、工业、农业、环保、商检
高效液相色谱法（hplc）
高效液相色谱法(HPLC)一．概述色谱法是一种应用范围相当广泛的分离分析技术，它已有近百年的发展史。
二十世纪五、六十年代石油及石油化工的突起促使了GC技术大发展，而七、八十年代生命科学、生化、制药工业的发展推动了HPLC的迅速发展。
目前除分析化学外，生物化学，石油化学，有机化学，无机化学等学科都普遍采用色谱技术。
现代高效液相色谱仪，以其高效，快速和自动化等特点成为当代分析仪器中发展最快的仪器。
HPLC已成为操作方便、准确、快速并能解决困难分离问题的强有力的分析手段。
1．HPLC的特点（1）适用范围广已知有机物中仅20%不经预先化学处理，可用GC分析；而其余80%有机物可用HPLC分析。
HPLC适于分离生物、医学大分子和离子化合物，不稳定的天然产物，种类繁多的其它高分子及不稳定化合物。
（2）流动相及固定均与样品分子作用，而GC仅固定相与样品分子作用。
（3）具有独特性能的柱填料（固定相）种类较多，具有多种分离方式，适于各种化合物分析。
（4）分离温度较低，提高了分离效率。
（5）具有一些独特的检测器：电化学，示差折光，可见紫外吸收及荧光检测器等。
（6）样品易回收。
2．HPLC分类按分离机理分为四类：吸附色谱（液固）：通过试样组分对活性固体表面吸附亲合力的不同实现分离。
对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性，早期应用较多，现在大多可用正相键合相色谱替代，常用硅胶柱。
分配色谱：不同溶质分子按其在固定相和流动相中分配系数不同得到分离。
现代分配色谱即化学键合相色谱，是将各种不同的有机基团通过化学反应键合到硅胶表面，具有很好的化学稳定性和热稳定性。
大部分分离问题都可用键合相色谱解决。
离子交换色谱：以离子交换剂为固定相，试样中电离组分与交换剂基体相反电荷的离解部位亲合力不同而分离。
用于分离无机或有机离子。
固定相为阴（阳）离子交换树脂，流动相为电解质溶液。
分子排阻色谱：按物质分子量大小进行分离。
不仅对高聚物，对分子量差别较大的低聚物或小分子化合物也可进行分离。
【大学课程】分析化学第20章 高效液相色谱法
梯度洗脱装置
外梯度（高压梯度）: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按 一定的比例送入梯度混合 室，混合后进入色谱柱。
内梯度（低压梯度）: 一台高压泵, 通过比
例调节阀,将两种或多种 不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混 合。
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（2）进样装置
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：
3 L2
L2
0.75cm
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液相色谱仪（3）
Agilent 1200 LC Systems
安捷伦1200 液相色谱系统
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液相色谱仪（4）
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二、流程及主要部件
1.流程
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2.主要部件
（1）高压输液泵：
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的 是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的 一元或多元溶剂。
（二）液-液分配色谱：LLC
有正相色谱和反相色谱之分
正相色谱（NPC)
反相色谱(RPC)
固定相极性
大
小
流动相极性
小
大
流动顺序 流动相极性↑，
极性小的组分先
流出 k↓，tR↓
极性大的组分先
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小结
• 掌握Van Deemter 方程在HPLC中的表现形式； • 掌握正相色谱和反相色谱的区别； • 掌握化学键合相色谱，特别是反相键合相色谱
HPLC原理及基本操作
HPLC原理及基本操作HPLC（高效液相色谱法）是一种广泛应用于分析化学和制药工业中的分离技术。
它基于液相色谱法，通过将样品溶解在流动相中，并通过固定填料进行分离和分析。
1.样品的溶解：样品通常是固体或液体，在HPLC中需要将其溶解在流动相中。
流动相可以是水、有机溶剂或它们的混合物。
2.固定相填料的选择：HPLC中的填料通常是高度吸附性和具有大表面积的细小颗粒。
这些颗粒被填充在色谱柱中，提供了分离和分析的平台。
3.流动相选择：流动相的选择取决于样品的性质和目标分析的目的。
流动相的成分和配比可以根据需要进行调整，以改变分离效果和分辨率。
4.注射样品：将样品通过注射器引入HPLC系统，注射器将样品推入色谱柱中。
5.流动相的微量泵：流动相的微量泵非常重要，它通过控制流动相的流速将样品推过填料。
6.色谱分离：样品在填料中根据其亲水性（亲水性成分被保留在固定相上，疏水性成分则被推至溶剂流动相）进行分离。
固定相越亲水，则与样品中的亲水性成分相互作用越强；固定相越疏水，则与样品中的疏水性成分相互作用越强。
7.检测器：色谱柱的末端通常装有检测器，用于检测样品溶液中目标化合物的浓度。
8.数据处理：使用计算机系统分析检测器输出的图形数据，然后计算和解释结果。
HPLC基本操作：1.准备样品：将样品溶解在适当的溶剂中。
2.准备色谱柱：将填料装入色谱柱中，并使其适当压实。
3.连接色谱柱：将装有填料的色谱柱连接至HPLC系统。
4.设置流动相：根据需要设置流动相的组成和配比，通过微量泵提供流动相。
5.设置检测器：根据需要设置检测器，选择适合目标化合物的检测方法。
6.注射样品：使用自动或手动注射器将样品引入HPLC系统。
7.运行分析：通过微量泵控制流速，运行HPLC系统使样品通过色谱柱，分离和分析目标化合物。
8.数据处理：使用计算机系统分析检测器输出的图形数据，进行峰面积计算、峰高定量等数据处理。
9.结果解释：根据分析结果解释样品中的目标化合物的存在和浓度。
高效液相色谱法的定义
高效液相色谱法的定义
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种分离和分析化学物质的方法。
它利用液相作为流动相，将待检样品按照其在固定填充物上的亲和性差异进行分离。
HPLC的基本原理是：将样品溶解于流动相中，通过高压泵将流动相推动样品通过固定填充物（也称为色谱柱），然后根据样品组分的亲和性差异，在固定填充物上进行分离。
随后，通过检测器对分离出的组分进行监测，并以信号形式输出，从而可以获得各个组分的峰图谱。
HPLC方法具有如下特点：
1. 高分辨率：由于使用高效的填充物和流动相，HPLC方法能够提供较高的分离效果和分辨率，使得能够分离出复杂混合物中的各个组分。
2. 定量精确：通过检测器对分离出的组分进行定量分析，可以提供准确和可靠的定量结果。
3. 广泛应用：HPLC方法适用于多种化学物质的分析，包括无机物、有机物、生物大分子等，因此被广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全、生命科学研究等领域。
4. 多样选择：根据不同的需求，可以选择不同类型的HPLC柱和流动相，以实现对不同化合物的最佳分离效果。
5. 自动化程度高：HPLC方法通常配备有自动进样器、自动调节流速、自动数据采集与处理等设备，使其操作更加方便快捷，并提高
分析的自动化程度。
总之，高效液相色谱法是一种重要的分离和分析技术，具有高分辨率、定量精确、广泛应用等特点，为化学分析和科学研究提供了有效的工具和方法。
现代色谱法分析技术—高效液相色谱法(分析化学课件)
分析乙苯及二甲苯三个异构体的样品，用归一化法定量结果如下，计 算各组分百分含量。
组分 峰面积A 重量校正因子
乙苯 120 0.97
对二甲苯 75 1.00
间二甲苯 140 0.96
邻二甲苯 105 0.98
（乙苯21.15％；对二甲苯17.50％；间二甲苯31.35％；领二甲苯24.00％）
高效液相色谱定量分析方法 ——内标法
高效液相色谱定量分析方法
目录
01 面积归一化法
02 外标法
03 内标法
高效液相色谱定量分析方法
什么是定量分析方法
实质是搞清楚样品里各组分含量有多少的问题 。
高效液相色谱法：能将组分分离后再分析含量 。
高效液相色谱定量分析方法—案例
怎样测出食品中的添加剂是符合标准的呢？
高效液相色谱定量分析方法—案例
高效液相色谱定性分析方法
目录
01 高效液相色谱法定性分析原理
02 高效液相色谱法定性分析方法
高效液相色谱定性分析方法
天麻为天麻片的主药，怎么鉴别 天麻片里是否真正含有天麻呢？
功效 祛风除湿 舒筋通络 活血止痛
医学用途 治疗肢体拘挛 治疗手足麻木 治疗腰腿酸痛
高效液相色谱定性分析方法 01.定性分析原理
高效液相色谱定性分析方法
课后思考
复方感冒片里主要有伪麻黄碱、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、右美沙芬这四种成份，请你结合
前面所学知识，说一说如何采用高效液相色谱法定性鉴别这四种成份呢？ 如下图所示，这个样品中是否含有这四种有效成份呢？
高效液相色谱法概念
高效液相色谱法概述
一、高效液相色谱法简介
液相色谱分析是在经典的液体柱色 谱基础上，引入了气相色谱的理论；
分析化学 高效液相色谱法
'
2
W
H eff
L neff
2、 分离度
R 2(tr2 tr1 ) neff • 1 (W1 W2 ) 4
3、 速率方程
H A B Cu u
B 2DM
溶质在液相流动相 中的扩散系数，约 为气相中扩散系数
的万分之一
在大多数情况下， B 0 u
修正的速率方程： H A Cu
柱径：0.9 cm
F：30 mL/h
t分离: >20 h
高效液相色谱仪
经典液相色谱 HPLC
150-200 μm 3-10 μm 重力或低压泵 高压泵
HPL C
t分离：1 h
很慢
快(1-10mL/min)
与经典液相色谱法相比
颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，(键合相) 传质阻抗小，柱效高，分离效率高；
注意：
流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶溶解；(也有适用宽pH 范围的键合相)。
固定相
固体吸附剂
硅胶－强极性 氧化铝－弱极性 活性炭－非极性 分子筛－强极性 高分子多孔微球(GDX)
硅胶表面结构
硅胶表面结构经热处理发生的变化
二、化学键合相色谱法的流动相
对流动相的要求：
与固定相不发生化学反应。
2、固定相
键合烷基的疏水性随碳链的延长而增 加，溶质的k也增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶 质的k越大。
3、流动相
极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大
溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂
溶剂比例：水的比例增加，使k增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大
pH：影响弱酸、弱减的离解
流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大； 弱碱k变小。
高效液相色谱法的应用与发展前景
高效液相色谱法的应用与发展前景高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分析方法，在多个领域中都有着广泛的应用。
该方法基于色谱原理，通过高效分离技术，对样品进行检测和分析。
本文将介绍高效液相色谱法的应用及其在未来可能的发展前景。
药物分析在药物分析领域中，高效液相色谱法已成为一种重要的分析方法。
通过对药物及其代谢产物的定性和定量分析，该方法能够有效地控制药品质量和药物疗效。
例如，利用高效液相色谱法可以测定药物中杂质的含量，确保药品的安全性和有效性。
食品质量检测在食品质量检测方面，高效液相色谱法可用于检测食品中的添加剂、有害物质和营养成分等。
该方法具有高灵敏度和快速分析的特点，可有效保障食品安全和人民健康。
例如，通过高效液相色谱法测定水果和蔬菜中的农药残留量，确保农产品质量安全。
环境监测在环境监测领域，高效液相色谱法可用于检测水体、土壤和大气中的污染物。
该方法能够准确地测定环境中的重金属离子、有机污染物等有害物质，为环境保护和治理提供科学依据。
例如，利用高效液相色谱法检测水体中的有毒物质，为水资源的保护和管理提供技术支持。
随着科学技术的不断进步，高效液相色谱法在未来也将迎来更多的发展机遇和挑战。
下面就简要讨论一下高效液相色谱法的发展趋势和可能面临的挑战，以及如何应对这些挑战。
技术创新与优化未来，高效液相色谱法将继续在技术上进行创新和优化。
例如，开发新型的固定相和流动相，提高分离效率和检测灵敏度；采用新型的检测器，如质谱检测器、拉曼光谱检测器等，拓展了高效液相色谱法的应用范围；引入人工智能和大数据等先进技术，对色谱数据进行深入挖掘和分析，提高检测准确性和效率。
多维分离技术的发展随着样品分离需求的不断提高，多维分离技术将成为未来高效液相色谱法发展的重要方向。
多维分离技术是指同时或依次在多个分离维度上进行样品分离，如反相色谱、离子交换色谱、体积排阻色谱等。
这些技术的结合，可以实现复杂样品的高效分离和精确分析。
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影响容量因子的因素
–离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，
溶质的k增大；在一定范围内试剂的浓度升高， 溶质的k增大
–流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子
化时（离子对的形成），组分的k值最大
–固定相 、流动相性质（同一般RP-HPLC）。
适用范围和离子对试剂的选择
适用范围：有机酸、碱、盐，离子型和非离子型
第十八章 高效液相色谱法
high performance liquid chromatography；HPLC
经典液相色谱法为基础， 引入气相色谱法的理论和实验技术， 高压输送流动相， 高效固定相及高灵敏度检测器， 现代液相色谱分析方法。
与经典液相色谱法相比
颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的 固定相，(键合相)传质阻抗小，柱效高，分 离效率高；
（三）反相离子对色谱法 paired ion chromatography；PIC ion pair chromatography；IPC
把离子对试剂加入到含水流动相中，组 分离子在流动相中与离子对试剂的反离 子（counter ion）生成中性离子对，
增加溶质与非极性固定相的作用，使k
增加，改善分离效果。
第一节 高效液相色谱法的主要类型 和原理
一、主要类型 四类基本类型色谱法
–分配色谱法（partition chromatography） –吸附色谱法（adsorption chromatography） –离子交换色谱法（IEC） –空间排阻色谱法（SEC）
第一节 高效液相色谱法的主要类型和 原理
一、主要类型 四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC） 化学键合相色谱法
其他色谱类型 亲合色谱法（affinity chromatography；AC） 手性色谱法（chiral chromatography；CC） 胶束色谱法（micellar chromatography；MC） 电色谱法（electrochromatography；EC）
pH：影响弱酸、弱减的离解
流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大； 弱碱k变小。
反相键合相色谱法
离子抑制色谱法（ion suppression chromatography；ISC ）
用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相 的pH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏
水缔合作用，使k变大。
适用于3≤pKa≤7的弱酸、7≤pKa≤8的弱碱
的选择性高 正相（normal phase，NP）和反相
（reversed phase，RP）键合相色谱法： 根据化学键合相与流动相极性的相对强弱
（一）正相键合相色谱法
固定相：极性键合相 –如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羟基 键合硅胶。（经典：水饱和的硅胶）
流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂 –如烷烃加醇类。（与水不混溶的溶剂）
化合物的混合物。
分析酸类或带负电荷物质：用季铵盐，如四丁基
铵磷酸盐（TBA）和溴化十六烷基三甲基铵（CTAB） 等。
分析碱类或带正电荷的物质：用烷基磺酸盐或硫
酸盐，如正戊烷基磺酸钠（PICB ）、正己烷基磺
适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性 的分子型化合物 –如一些在硅胶柱上分离的物质
正相键合相色谱法
分离机制？
分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相 的溶解 吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作 用
分离选择性：
极性强的组分k大，后洗脱出柱。 流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小， tR 减小。
二、学键合相色谱法
以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合 相色谱法(bonded phase chromatography； BPC)
化学键合相：采用化学反应的方法将官能团 键合在载体表面所形成的固定相
优点：
固定相的均一性和稳定性好，在使用过程 中不易流失，使用周期长；
柱效高；重现性好； 能使用的流动相和键合相的种类多，分离
（二）反相键合相色谱法 固定相：非极性键合相
如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键 合硅胶
流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶 的极性调整剂 常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广 非极性至中等极性的组分， （还有有机酸、碱及盐等）
保留机制 疏溶剂 （solvophobic theory）
高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度 快；
高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检 测器最小检测限可达109g，而荧光检测器最 小检测限可达1012g。
与气相色谱法相比
不受试样的挥发性和热稳定性的限制， 应用范围广；
可选用各种溶剂作为流动相，对分离的 选择性有很大作用，选择性高；
一般在室温条件下进行分离，不需要高 柱温。
溶质的保留主要是溶质 分子与极性溶剂分子间 的排斥力，促使溶质分 子与键合相的烃基发生 疏水缔合。
不是溶质分子与键合相 间的色散力。
反相键合相色谱法
保留行为的主要影响因素
–1、溶质的分子结构（极性）
极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。 同系物碳数越多，极性越弱，k越大； 引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。
反相键合相色谱法
保留行为的主要影响因素
–2、固定相
键合烷基的疏水性随碳链的延长而增
加，溶质的k也增大。
硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶
质的k越大。
反相键合相色谱法
保留行为的主要影响因素
–3、流动相
极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大
溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂
溶剂比例：水的比例增加，使k增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大
反相离子对色谱法
离子对模型 流动相
固定相
B + H+ RSO3 Na
BH +
+ RSO3 + Na+
通式
B+ + A
( BH+ RSO3 )m
离子对
(B+ A )m
( BH+ RSO3 )s
(B+ A )s
K B [[ B B A ]m ]s [[B B ] m [ A A ]] sm A m E BA A m