食蟹猴人工授精及体外受精实验初步程序

食蟹猴人工授精及體外受精實驗初步程序
KHI Bioservices(Hong Kong)Limited 袁濤 D.V.M
1人工授精及體外受精實驗初步程序 :
1人工授精 (artificial insemination)
1.1母猴準備
利用獨立籠檢視母猴月經, 選擇有正常及規律性月經之猴子進行
利用腹腔鏡(Laparoscopy)或超聲波(Ultrasound)檢查卵巢及卵泡發育情況, 自月經後第5天每隔一天檢查, 接近排卵期時每天進行檢查, 直至確定排卵.
[ 另有學者進行荷爾蒙測試 (estrogen, progesterone, LH) 確定排卵 (estrogen ,↓
↑↑腹腔鏡(Laparoscopy)或超聲波(Ultrasound)較能直接檢視卵泡發育狀progesterone , LH ),
況 ]
1.2公猴取樣
-電激棒取樣
一般分有penile stimulation 及 rectal probe stimulation
電激棒之規格
-精子處理
方法
1取樣後, 凝固精液放於37C 30分鍾 5% CO2 培育箱液化
2液態精液以Tyrode albumin lactate pyruate-HEPES (TALP-HEPES)稀釋1:5
3抽取小許檢視精子活力, 形態及數量
4稀釋至2.0 – 4.0 x 108精子/ml [另有日本研究用2.5 – 5.0 x 107精子/ml 濃度進行
授精]
5培育於30 – 32 , 2-3小時 [另有加入1mM Caffeine使精子活能化(capacitation) ] 1.3授精程序
有文獻提及, 日本獼猴人工授精實驗中, 授精於陰道內之猴不能授精,而只有授精於子官內方可成功. 於食蟹猴陰道及子官均可.
1當母猴証實排卵時, 每天進行0.2ml輸精, 一般由11-14天
2麻醉母猴
3利用1ml 針筒及老鼠餵管或人工授精導管進行子官內輸送精子
4另外手指進入直腸確定子官頸及子官位置, 協助引導管道進入子官, 伸入管道於母猴陰道及子官頸, 管道輕輕引導進入子官內.
5如進入子官頸有困難, 可利用擴張器擴大陰道, 然後繼續找尋
6導管進到子官內, 慢慢注射
-懷孕檢測程序
1Progesterone測試
1progesterone 於最近之月經30天後進行測試. [月經後30天Progesterone應該
降低, 如升高代表懷孕]
2超聲波 Ultrasound 測試
於50-60天可進行超聲波 Ultrasound 測試
1.4冷凍精液
-程序方法
培養液製法
Tris-base medium:300mM Tris. 28mM glucose, 95mM critric acid, 5%(v/v) glycerol,
1000IU/ml gentamicin, 1mg/ml streptomycin, 20% (v/v) chicken egg yolk.
1取樣後, 固態精液放於37C 30分鍾液化
2液態精液以Tris-based medium稀釋5倍
3稀釋精液慢慢冷凍至5 C 在90-120分鐘內於4 C雪櫃
4精液以200ul分裝, 以乾冰冷凍60 – 90s, 貯存於liquid nitrogen, -196 C
5於IVF或AI 前, 試管內冰凍顆粒於37 C水箱搖動45-60s解凍
6解凍精液供IVF以TALP稀釋至20x10^6 精子/ml, 精液用於人工授精則不用稀釋, 直接採用.
2試管受精 (In vitro fertilization)
2.1 超排 (Superovulation)
-藥物注射程序
方法1
一般超數排卵方法是給予促性激素(FSH, LH, HCG, eCG) 於不同時期注射, 引致卵巢超數排卵, 但注射激素同時易引起排出未成熟卵子, 一般在程序上加入GnRH/GnRH
antagonist(拮抗劑) 注射1至數天, 作用防止卵子未有成熟發育,
1月經開始後, 替母猴皮下注射0.75 – 3.75 mg GnRH
2在第10天至14天時, 以腹腔鏡確定沒有卵胞發育
3肌肉注射9天eCG(孕馬血清) 25 IU/kg/天
4在第5天開始注射eCG後, 每隔一天利用腹腔鏡檢查卵胞發育程度
5在9天注射eCG後, 卵泡上的白皮質(tunica albuginea of the follicle) 開始變薄及透明,卵胞發育足夠成熟後, 注射400 IU/kg hCG
方法2
1月經開始後, 替母猴皮下注射6天0.5 mg/kg GnRH antagonist (Antide)
2在此段時間, 同時注射rh FSH, 每天兩次(30IU)
3注射1-3天rh FSH及 rhLH（各30 IU）每天兩次
4在第7天進行超聲波檢視卵泡生長情況
5當卵泡3-4mm, 注射1000 IU hCG
627 小時後, 收集卵母細胞
2.2收集卵胞
117 – 41 (27 - 32小時for Rhesus monkey) 小時注射hCG後, 以3ml 針筒加有18或19 號針 (70mm 長) 抽取0.2ml Tyrode albumin lactate pyruate-HEPES (TALP-HEPES) 2在腹腔鏡檢視下, 以針頭插入及抽取成熟卵母細胞(oocyte), 抽掉卵泡及其液體
3用顯微鏡檢視成熟卵母細胞, 有cumulus cell為Metaphase II (MII)
[Germinal vesicle, Metaphase I eggs 未夠成熟, 需人工培養方可進行試管受精, 只有
MII egg 適合受精]
4於37 C 5% CO2培育 3-4 小時
5成熟卵母細胞準備試管受精
2.3 精子準備
方法1
1取樣後, 凝固精液放於37C 30分鍾 5% CO2 培育箱液化
2液態精液以2 ml BWW-0.3%BSA 稀釋
3加80% Percoll於試管內, 然後在上面加入60%Percoll, 最後加入精子
4離心20分鍾, 1300 rpm
5抽取BWW-0.3%BSA層, 60%percoll及80%percoll, 留下底部精液部份
6加入5-10ml BWW/BSA, 離心清洗3分鍾, 1300 rpm
7加入10ml BWW/BSA含有1mM咖啡因(Caffeine)及1mM dibutyryl cyclic AMP
於管內, 培育於37 C 30分鍾, 使精子活能化(capacitation)
8離心1000rpm, 2分鐘
9倒去液體部份, 加入0.5 ml 至1.0 ml 培育60分鐘
10抽取游離液體面之精子, 移到另一枝管子
11檢視動力 (Motility) 及 數目(Count)
12加入BWW/BSA, 稀釋至1.0 – 2.0 x 105精子/ml
方法2
1取樣後, 凝固精液放於37C 30分鍾 5% CO2 培育箱液化
2液態精液以2 ml Tyrode albumin lactate pyruate-HEPES (TALP-HEPES) 稀釋
3離心清洗2次, 每次8分鍾, 1300 rpm
4培育於37 C, 4-5小時, 5%CO2
5離心8分鍾, 1300 rpm
6加入10ml TALP-HEPES含有1mM咖啡因(Caffeine)及1mM dibutyryl cyclic
AMP 於管內, 培育於37 C 15分鍾, 使精子活能化(capacitation)
2.4 試管培養 (In vitro fertilization)
1 1 至 5 個成熟卵母細胞(oocyte)及cumulus cells放入100ul TALP-HEPES 培養液
2加上礦物油蓋面
3加入100 ul 稀釋精液
4培育於37 C 5% CO2 培育箱
515 – 16小時後, 若出現2個pronuclei, 卵母細胞成受精
6受精卵母細胞清洗及更換培養液
736至66個小時, 2 至 8個細胞之胚胎選擇進行胚胎移植
3胚胎移植(Embryo transfer)
胚胎移殖方法有不同, 有提及利用腹腔鏡或超聲波引導下進行, 另有剖腹手術(laparotomy), 傳送卵子到輸卵管.
3.1受體選擇
1選擇母猴有正常月經
2於胚胎移植前2-3天排卵之母猴選擇為受體
3胚胎應移入含有黃體之子官輸卵管內
3.2 胚胎移植程序
11至2個胚胎混和於10 ul TALP-HEPES培養液在胚胎移植之導管內
2胚胎移植導管利用平時腹腔鏡插管位插入腹部.
3導管尖移到接近繖(fimbria) 及套入輸卵管(oviducal orific in the fimbria)
4導管尖部插入輸卵管內部15-20mm, 注入胚胎.。