慢病毒包装

慢病毒包装．

慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，它需要相对较长的孵育时间，所以称之为“慢”病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。它包括人免疫缺陷病毒（HIV）、猫免疫缺陷病毒（FIV）、猿免疫缺陷病毒（SIV）、牛免疫缺陷病毒等。其中研究最多的是HIV-1慢病毒。

慢病毒载体（Lentivirus vector）是以慢病毒基因组为基础，由所需的目的基

因取代部分基因构建而成。目前使用的慢病毒载体多采用HIV-1基因组改造而来。与一般的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力而具有更广的宿主范围。慢病毒载体还可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而实现持久表达。在感染能力方面可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，又很少引发机体免疫反应，能达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。

随着人们对慢病毒载体的深入研究，为了提高慢病毒在临床上使用的安全性，慢病毒载体的优化也在不断的探讨中。慢病毒载体的发展经历了三个阶段，第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表，在构建时把HIV-1基因组中进行包装、逆转录和整合所需的顺式作用原件与编码反式作用蛋白的序列分离，分别构建在三个质粒表达系统上，即包装质粒、包膜质粒和载体质粒。包装质粒在巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）启动子的作用下，控制除env以外所有病毒结构基因的表达；包膜质粒编码水泡口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）G 糖蛋白；载体质粒中含有目的基因。用这三种质粒共转染包装细胞如人胚胎肾293T细胞，在细胞上清中即可收获只有一次感染能力、而无复制能力的慢病毒颗粒。第一代慢病毒载体系统的特点是在构建三种包装质粒时，为了降低产生有复制能力的病毒的可能性，尽可能减少三种质粒之间的同源序列，但包装质粒中仍然保留HIV的附属基因。第二代慢病毒载体系统是在第一代的基础上进行改进，在包装质粒中删除了HIV的所有附属基因。这些附属基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性。第三代慢病毒载体系统又增加了两个安全特性：一是构建自身失活的慢病毒载体，即删除了U3区的3′LTR,

使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；二是去除了tat基因，用异源启动子序列代替，这样原始的HIV基因组中的9个慢病毒载体中只保留了3个（gag、pol和rev）。因此第三代慢病毒载体系统更加安全。

目前慢病毒已被广泛地应用在RNA干扰研究中。由于有些类型的细胞脂质体转染的效果差，转移到细胞内的shRNA半衰期短，体外合成的siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因此其应用也受到了较大的限制。采用事先体外构建能表达shRNA的载体，然后包装成能表达shRNA的慢病毒颗粒，就能直接感染一些难对付的细胞，不仅方便易行，且可以达到基因表达的持久抑制效果。基于慢病毒的慢病毒载体的研究已经发展到一定水平，因此用慢病毒作为基因转移载体的临床研究已经开始，在实验室和临床研究中，慢病毒具有特别的优点，尤其是能感染非分裂期的细胞、免疫反应小。现在基于HIV的慢病毒载体的临床研究已经开始应用于人体。．

吉凯基因向市场提供的慢病毒产品使用的是安全性能更高第三代慢病毒载体系统，包装质粒提供必要的慢病毒基因，来形成病毒粒子的结构蛋白和包装功能；包膜质粒提供包膜蛋白；载体质粒不仅表达目的基因，还提供包装信号和顺式作用原件。吉凯基因向市场提供的慢病毒滴度可达到1E+8 TU/mL，不必浓缩和纯化，就能感染目的细胞。慢病毒感染目的细胞后用嘌呤霉素(puromycin)进行筛选，或通过GFP发出的绿色荧光来筛选。让您对人、小鼠、大鼠等基因

功能研究更加方便、快捷。

慢病毒使用操作手册

2011-10-28 00:00 来源：百度百科点击次数：1453 关键词：慢病毒操作注意事项安全性

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一、慢病毒的储存与稀释:

1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病

毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）

①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议

在使用前需要重新滴定病毒滴度

②反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使

用量进行分装。

2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养

目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。混匀分装

后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。

二、慢病毒用于体外（In Vitro）实验：

感染培养原代细胞和建系细胞。慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献

支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。

慢病毒感染目的细胞预实验

1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项：

①测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细）作为平行实验的对照细胞。Hela，(HEK293T胞

②在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。

③一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：88个具有生物活性即每毫升病毒液中至少含有>1X101X10 TU/ml 病毒滴度为的

慢病毒颗粒。