流式细胞仪的基本结构

流式细胞仪主要由以下五部分构成：流动室及液流驱动系统；激光光源及光束形成系统：光学系统；信号检测与存储、显示、分析系统；细胞分选系统(图4-3)。

1．流动室和液流系统是流式细胞仪的核心部件。流动室由样品管、鞘液管和喷孔等组成。常用石英等透明、稳定的材料制作。样品管储放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘液包绕通过流动室内的一定孔径的孔。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞啦单行排列依次通过激光检测区。为了保证液流速度稳定。一般限制液流速度小于10 m／s。流动室孔径有60 μm、100μm、150μm、250 μm等多种。

2．激光源和光学系统经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的激光管是氩离子气体激光管，它的发射光波长488nm，此外可配备氦氖离子气体激光管(波长633nm)和(或)紫外激光管。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。氩离子激光器的发射光谱中，绿光

514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80％；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。将有机染料作为激光器泵浦的一种成分，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodanline 6G水溶液的染料激光器，则可得到550～650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。

为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，大致可分为流动室前和流动室后两组。流动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小孔的将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚

焦成横截面较小的椭圆形激光光束，使通过激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度地减少杂散光的干扰。

为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤片区段的光线滤除或通过。例如使用525nm带通滤片只允许FITC发射的525nm绿光通过。长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种咀上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜，将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22μmx66μm)，使通过激光检测区的细胞受照强度一致。

3．光电管和检测系统经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管(photomultiplier tube，PMT)最为常用。PMT的响应时间短，仅为数秒；光谱响应特性好，在200～900nm的光谱区，光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从103到108可连续调节，因此对弱光测量十分有利。也有用硅光电二极管的，它在强光下稳定性比PMT好。从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类放大器。一类是输出信号幅度与输入信号呈线性关系，称为线性放大器。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例如DNA测量等。另一类是对数放大器．输出信号和输人信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，它们的荧光强度相差1～2个数量级；而且在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。

4．计算机和分析系统经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道分析器出来的信号再经模，数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存储于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用。计算机的存储容量较大，可存储同一细胞的6～8个参数。存储于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理和分析，最后给出结果。