免疫组化结果判断和常见问题的分析报告

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免疫组化结果判断及常见问题的分析

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四、免疫组化异常着色及对策
1.非特异性着色及其对策
非特异性着色原因操作过程冲洗不充分内源性过氧化物酶
内源性生物素电荷吸附抗体不纯
切片制片不当加试剂后切片干燥
对策每步冲洗3×5min
3％H2O2封闭使用生物素阻断试剂盒阻断
非免疫动物血清封闭
采用单克隆抗体
改善取材和制片
2.染色的不均一性阳性细胞的染色分布不均，片状或点状散在分布染色强弱不等，颜色深浅反映抗原量的多少
3.排除人为造成的非特异性染色切片的折叠、刀痕，色素沉着，组织细胞坏死。
4.颗粒性显色 DAB显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀着色。
精选
5
免疫组化标准化照片
CK10 ER CD44v6
精选
6
精选
切片制片不当加试剂后切片干燥
对策每步冲洗3×5min
3％H2O2封闭使用生物素阻断试剂盒阻断
非免疫动物血清封闭采用单克隆抗体改善取材和制片防止切片干燥
精选
43
无信号片
精C选D30
44
2. 染色的假阴性及其对策
染色假阴性原因
组织处理不当（固定、浸蜡）一抗与二抗种属连接错误抗体失效显色系统不相适配操作不当，遗漏重要步骤
精选
CD34
21
K-ras
精选
VEGF
22
附：定量分析——图象处理系统
1、图象处理：
利用仪器按照不同的目的进行图象的修正、变换、特征提取和测量。 1）“狭义”指消除图象的模糊不清部分，校正畸变。 2）“广义”包括对图象的结构分析，提取特征进行测量。
精选

免疫组化结果判断及常见问题的分析

非特异性染色
总结词
非特异性染色是由于抗体与非目标组织成分的交叉反应导致的。
详细描述
非特异性染色是免疫组化实验中常见的问题，通常是由于抗体与组织中非目标成分的交叉反应。为了减少非特异性染色，可以尝试降低抗体浓度、增加洗涤步骤或使用阻断剂等方法。
背景染色
总结词
背景染色是由于组织中其他成分的非特异性染色或由于抗体与组织中其他成分的交叉反应导致的。
免疫组化结果判断及常见问题的分析
目
CONTENCT
录
• 免疫组化基本概念 • 免疫组化结果解读 • 常见问题及解决方法 • 免疫组化在临床上的应用 • 免疫组化技术新进展
01
免疫组化基本概念
定义与原理
定义
免疫组化是一种利用抗原-抗体反应原理，通过标记的抗体在组织或细胞中检测特定抗原的方法。
免疫组化可以与其他技术如原位杂交、原位PCR等联合应用，以同时检测抗原和相关基因的表达，提供更全面的分子信息，有助于深入了解疾病的发生发展机制。
联合应用多种技术可以相互补充，提高检测的敏感性和特异性，为临床诊断和治疗提供更可靠的依据。
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数字免疫组化技术
数字免疫组化技术是一种基于数字图像分析的免疫组化技术，通过高分辨率数字成像系统获取组织切片图像，利用计算机软件进行图像分析和处理。
数字免疫组化技术能够实现自动化、高通量的组织切片分析，提高检测效率，减少人为误差，特别适合大规模临床筛查和流行病学研究。
免疫组化与其他技术的联合应用
04
免疫组化在临床上的应用
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
免疫组化技术可以检测肿瘤组织中特定抗原的表达，从而确定肿瘤的性质和来源。通过对不同肿瘤标志物的检测，有助于医生对肿瘤进行准确的诊断。

实验结果免疫组化结果解读

实验结果免疫组化结果解读
免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种用于检测组织中特定蛋白质表达的技术。

通过对组织切片进行染色，可以观察到特定蛋白在组织中的分布和表达水平。

在解读免疫组化结果时，需要考虑以下几个方面：
1. 样本准备，首先需要确认样本的质量和处理是否符合实验要求。

样本的保存和处理对免疫组化结果至关重要，因为不恰当的处理可能会导致蛋白质的降解或者失活，影响最终的结果。

2. 阳性对照，在解读免疫组化结果时，需要对照阳性对照组织切片，确保实验条件和试剂的有效性。

阳性对照通常是已知含有目标蛋白的组织切片，用于验证实验条件和试剂的有效性。

3. 组织结构，观察组织切片的整体结构和形态，确保实验过程中组织的完整性和准确性。

免疫组化结果需要在正确的组织结构基础上进行解读，以排除可能的伪阳性或伪阴性结果。

4. 染色结果，观察组织切片的染色结果，包括颜色强度、分布和细胞定位。

根据染色结果的强弱和分布情况，可以初步判断目标
蛋白在组织中的表达水平和分布情况。

5. 数据分析，将染色结果进行定量分析，通常使用图像分析系统或者手动计数的方式进行。

通过定量分析可以得到目标蛋白的表达水平，进一步验证免疫组化结果的可靠性和准确性。

6. 结果解读，根据样本准备、阳性对照、组织结构、染色结果和数据分析，对免疫组化结果进行综合解读。

需要考虑目标蛋白在组织中的表达水平和分布情况，结合实验条件和其他实验结果进行综合分析。

综上所述，解读免疫组化结果需要综合考虑多个因素，包括样本准备、阳性对照、组织结构、染色结果、数据分析和综合解读，以确保结果的准确性和可靠性。

免疫组化常见结果及解读

免疫组化常见结果及解读免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测组织或细胞中特定蛋白质的表达情况。

通过免疫组化可以确定细胞或组织中特定蛋白质的存在、定位和表达水平，从而为疾病的诊断和治疗提供重要的依据。

下面将介绍免疫组化常见结果及其解读。

1. 阳性结果：阳性结果表示目标蛋白质在组织或细胞中存在。

阳性结果可以分为强阳性、中阳性和弱阳性。

强阳性表示目标蛋白质的表达水平很高，中阳性表示表达水平适中，弱阳性表示表达水平较低。

阳性结果的解读需要结合临床病史和其他检查结果来综合判断。

2. 阴性结果：阴性结果表示目标蛋白质在组织或细胞中不存在。

阴性结果可能有多种原因，如目标蛋白质在该组织或细胞中不表达、表达水平很低或实验操作不当等。

阴性结果的解读需要排除其他可能的原因，并结合临床病史和其他检查结果来综合判断。

3. 异常表达：有时免疫组化结果显示目标蛋白质的表达情况与正常组织或细胞有明显差异，称为异常表达。

异常表达可能是疾病的标志，也可能是实验操作不当或其他因素导致的假阳性结果。

解读异常表达结果需要结合临床病史和其他检查结果来综合判断。

4. 亚细胞定位：免疫组化可以确定目标蛋白质在细胞中的亚细胞定位。

常见的亚细胞定位结果包括细胞核、细胞质、细胞膜和细胞器等。

亚细胞定位结果的解读可以提供有关目标蛋白质功能和调控机制的重要信息。

5. 异常分布：有时免疫组化结果显示目标蛋白质在组织中的分布与正常组织有明显差异，称为异常分布。

异常分布可能是疾病的标志，也可能是实验操作不当或其他因素导致的假阳性结果。

解读异常分布结果需要结合临床病史和其他检查结果来综合判断。

6. 异常表达模式：有时免疫组化结果显示目标蛋白质的表达模式与正常组织有明显差异，称为异常表达模式。

异常表达模式可能是疾病的标志，也可能是实验操作不当或其他因素导致的假阳性结果。

解读异常表达模式结果需要结合临床病史和其他检查结果来综合判断。

总之，免疫组化常见结果的解读需要结合临床病史和其他检查结果来综合判断。

免疫组化染色过程中存在的问题原因分析及对策

免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提;由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节,每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果,因此,要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事;需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片;虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题,但从染色的结果看,一般可分为两类：无色片即无阳性信号和“杂音”染色片有阳性信号;一、无色片染色结束后,切片中见不到任何阳性信号;这是常规工作中比较常见的现象,出现这种现象,有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题,组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原;2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映;假阴性结果又可分为两种情况：1、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞;出现这种情况,要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了,要麽是技术员选错了蜡块;获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提;由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事,病理医生也起着不可缺少的作用;2、染色过程中的某一或某些环节出了问题;比如,组织未进行抗原修复,有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效,虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程,但偶尔也遇到突然失效的情况,抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因;也可见于染色过程中漏掉了某一环节,如忘记加二抗或三抗,或用了两次二抗而缺少了三抗,或配制DAB时少了过氧化氢;为了避免这种简单的错误,有一种简单的方法：在三抗孵育结束时,将切片上的三抗甩在一张白纸上,在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色;如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程没有错误;如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号,问题一定是出在三抗以前;如果纸上不出现棕色反应,问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程;这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因;解决阴性染色的问题非常简单,就是设立“阳性对照”;如果阳性对照有了表达,说明染色的全过程和所有试剂都没有问题;如果此时测试片仍为阴性,便是真实的阴性,说明组织或细胞没有相应的抗原表达;反之,如果阳性对照没有着色,表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题;应一一寻找原因;阳性对照包括两种,一种称为“自身对照”或“内部对照”,这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原,如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原,CD20或CD3都应该有表达;自身对照是一种比较理想的对照,对照和测试组织或细胞都在同一张切片中,都处于相同的试验条件下,结果更可靠也更具有可比性;在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分,这样有利于对比;另一种称为“外部对照”,有时在测试的切片中不存在已知的抗原,如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤,需要用HMB45或Mart-1来检测,在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原,如果病变出现阳性反应结果,尚能提示是恶黑,但是如果出现阴性结果,就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原,还是技术问题;因此,应另外设立一个已知的阳性对照;这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”;在实际工作中需要设立外部对照的情况很多,如果每一种抗体都要选不同的阳性对照,工作量会很大;为了解决这个问题,目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起,制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等,其连续切片储备待用,需要时取出一张便可作为阳性对照;另外,比较简单的方法,是采用阑尾作为阳性对照,因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多,如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等;一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体;设立阳性对照是病理医生的任务或责任,而不是技术员的责任;病理医生观察了HE切片,了解切片中是否有自身对照,如果没有,就应告诉技术员采用阳性对照;因此,病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的;抗体未覆盖上测试组织：当多块散开的小组织染色时,可能漏掉某块组织染色;二、“杂音”染色片免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色,这些非正常的着色称为“杂音”染色;“杂音”染色种类繁多,产生的原因也多种多样,为了便于说明,笔者将其归纳为下面几种; 1、全片着色全片着色是指整个切片全都染上了颜色,着色的强度可深可浅,总之,分不清那些组织是阳性那些组织是阴性;出现这种现象的原因有： 1、抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一;解决办法是,每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试,使每一抗体个体化,找到适合自己实验室的理想工作浓度,既使是即用型的抗体也应如此,不能只简单的按说明书进行染色; 2、抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是,严格执行操作规程,最好随身佩带报时表或报时钟,及时提醒,避免因遗忘而造成时间延长;现在流行的二步法Polymer敏感性很高,要求一抗孵育的时间不是传统的1小时,而是30分钟,因此,要根据染色结果进行调整; 3、DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配,如有沉渣应进行过滤后再用;配制好的DAB不应存放时间太长,因为在没有酶的情况下,过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力,未用完的DAB 存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的;DAB的显色最好在显微镜下监控,达到理想的染色程度时立即终止反应;不过当染色片太多时或用染色机时,这样做似乎不现实,但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控,避免显色时间过长; 4、组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因;解决的办法是操作要认真仔细,采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈,可以有效的避免液体流失,也能提高操作速度; 5、切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长大于24小时：原因上不清楚,但现象存在;有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复,第二天加抗体进行免疫组化染色,如果将装有切片和修复液的容器放在4ºC冰箱过夜,对结果无明显影响,如果放在室温,特别是炎热的夏天,会出现背景着色,因此,不可存放时间太长;6、一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期,过期的抗体要麽不显色要麽背景着色;用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较; 2、切片边缘着色切片边缘着色也是一种常见的现象,这种现象称为边缘效应;产生的原因：1、组织边缘与玻片粘贴不牢,边缘组织松脱漂浮在液体中,每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致;解决办法：制备优质的胶片APES或多聚赖氨酸,切出尽量薄的组织切片,不厚于4微米,组织的前期处理应规范,尽量避免选用坏死较多的组织;2、切片上滴加的试剂未充分覆盖组织,边缘的试剂容易首先变干,浓度较中心组织高而致染色深;解决办法：试剂要充分覆盖组织,应超出组织边缘2 mm;用DAKO笔画圈时,为了避免油剂的影响,画圈应距组织边缘3-4 mm; 3、“阴阳脸”着色指组织一半着色一半无着色,形成交界清晰或不甚清晰的两种染色结果;其成因是试剂仅覆盖了部分组织而不是全部;如加试剂后未让试剂流散开而集中在部分组织上;通常应该在加完试剂后,仔细看一遍,是否有的组织未被试剂完全覆盖,如有这种情况,建议用牙签而不是用吸头或试剂瓶口将试剂引流开使之将组织全部覆盖;另外,染片盒不平,切片倾斜,虽然开始试剂已全部覆盖了组织,但后来试剂流向一边,部分组织未被试剂覆盖;对于这种问题,只要留心或想到了很容易发现,也很容易解决;有时,用DAKO或PAP笔在组织周围画圈时,划线太靠近或画到了组织上,由于笔油的力学原理,试剂不能达到靠近划线附近的组织;还有气泡也可引起阴阳分明的着色,只是不着色区域是圆形,由于气泡中含气,试剂被推到周围,因此,气泡中心的组织不着色;解决办法是滴加试剂时手法要轻,有气泡时用牙签捅破; 4、灶片状着色切片中着色区东一块西一块,呈灶片状分布,出现这种问题的原因有：1、裱片时水未排尽,在局部形成气泡使组织突起,染色时试剂渗入后不易洗尽,显色过深所致;解决办法是,漂片盒里的气泡应去尽,晾片热台不能平放,应有45度左右的斜度,利于水流走和蒸发;2、坏死组织灶,组织坏死后细胞破坏、酶的释放、蛋白游离、分解,复杂的肽链残段如Fc段可能与一抗或/和二抗结合导致最终着色;解决办法是在选择染色切片时应避免选择坏死组织较多的切片;3、制作APES胶片时,胶的浓度太高,干燥后在玻片上留下白色小点,显色时白色小点着色;解决办法是按照标准的制备方法进行,即5%盐酸酒精5ml盐酸+95%酒精95ml浸泡玻片4小时、热水冲洗玻片1小时、蒸馏水洗玻片1分钟、丙酮浸泡玻片5秒钟后空气干燥室温、2%APES2 ml APES+98 ml丙酮浸泡玻片5分钟、玻片过一下丙酮1-2秒钟、玻片过一下蒸馏水1-2秒钟、37°C 过夜干燥、室温储存备用;如果制片过程中,因丙酮逐渐挥发而胶变浓时可适当加入一些丙酮; 5、间质着色着色部位主要在间质,间质着色的原因很多,如抗体与组织中的蛋白质因蛋白疏水基团相互作用形成非特异性的连接而着色,加一抗前的血清封闭这一步就是为了避免非特异型的结合;又如血清中的免疫球蛋白常常渗出到组织间质,很容易与抗体结合,造成间质着色,特别是lambda和kappa染色时;当甲状腺胶质外溢到组织间质时,做甲状腺球蛋白染色也会出现间质着色;抗体不纯或抗体被污染也可出现间质着色,我们曾遇到CD20抗体不纯,除了染上B细胞外还染上了间质; 6、细胞浆着色胞浆着色是所有“杂音”染色中最具有欺骗性的着色,着色区局限在细胞内,间质无着色,看上去与真实的免疫反应着色几乎一样,很难区别;胞浆里含有较多的蛋白质,因此,很多非特异性的染色除了见于间质也可以出现在胞浆中;这种原因造成的着色,可以通过血清封闭解决;还有因内源酶造成的着色,如血红蛋白红细胞、肌红蛋白肌细胞、细胞色素粒细胞、单核细胞、过氧化氢酶肝、肾,这些可用过氧化氢进行封闭;巨噬细胞吞噬各种抗原物质或Fc片断而出现胞浆着色,这种着色不易避免,但可以通过形态学辨认出巨噬细胞而引起重视;内源性生物素的着色最具有欺骗性,因为它广泛的存在于组织细胞中,我们研究结果显示：冰冻组织中存在内源性生物素,经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭,加热抗原修复后造成内源性生物素暴露,内源性生物素暴露的强度在不同的组织有所不同,从弱阳性+到强阳性+++,内源性生物素在组织中的分布形式,既有散在分布也有弥漫分布,主要以颗粒状形式存在于胞浆中,内源性生物素广泛存在于上皮源性组织,特别是腺上皮组织,亦存在部分非上皮组织,内源性生物素不仅存在人体组织也存在大鼠组织,内源性生物素暴露的强弱与修复液有关,其强度增加依次为：柠檬酸、EDTA、EGTA,热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭,非生物素检测系统Polymer两步法EliVision、EnVision可避免生物素干扰; 7、细胞核着色不适当的组织处理可以出现细胞核着色,如组织在二甲苯里浸泡时间太长如从星期五浸泡到下星期一、缓冲液中浸泡时间太长、组织变干、微波修复液的pH值和修复时间不当或修复过程中修复液留下得太少,未没过组织等;解决办法是严格按照操作常规进行工作;。

免疫组化染色常见问题及解释

一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。

在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。

因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。

另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。

离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。

标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。

虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。

因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。

二、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。

如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。

由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成年人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。

因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。

三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。

如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。

免疫组化技术常见问题及处理方法

详细描述
染色弱或无信号问题可能是由于抗体浓度过低、孵育时间不足、组织抗原量少等原因所致。为解决这一问题，可以增加抗体浓度、延长孵育时间、增强组织抗原的暴露等措施，以提高染色强度。
染色背景问题
总结词
染色背景是指染色结果中除了目标蛋白外的其他染色，通常表现为整个视野的弥漫性着色。
详细描述
染色背景问题可能是由于抗体与组织中其他蛋白的交叉反应、组织内源性酶活性、组织处理过程中产生的物质等所致。为解决这一问题，可以采取使用阻断剂、降低抗体浓度、
定期对仪器设备进行校准，确保其性能稳定、准确可靠。同时，对设备进行日常维护，及时排除故障，保证实验的正常进行。
试剂储存和有效期问题
总结词
试剂的储存和有效期直接关系到实验结果的可靠性。
详细描述
严格按照试剂说明书进行储存，避免试剂受潮、光照、高温等不利因素的影响。关注试剂的有效期，避免使用过期试剂。
详细描述
固定和保存组织的目的是为了保持组织结构和抗原性。不同的组织需要不同的固定液和固定时间，以确保抗原的完整性和稳定性。同时，组织的保存条件也需严格控制，以防
抗原丢失或降解。
04
仪器设备和试剂问题
仪器设备校准和维护问题
总结词
仪器设备校准和维护是确保免疫组化实验准确性的关键环节。
详细描述
详细描述
为了促进免疫组化技术的数据共享和交流，需要建立统一的数据库和平台，以便研究人员能够共享数据、交流经验和技巧。此外，应鼓励研究人员在学术会议和期刊上发表研究成果，促进技术的传播和应用。通过加强数据共享和交流，可以推动免疫组化技术的进步和创新，提高其在医学研究中的应用价值。
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免疫组织化学反应结果的判断标准

免疫组织化学反应是一种通过对细胞或组织中特定抗原的免疫反应进行定位和定量分析的方法。

免疫组织化学反应结果的判断标准对于研究和临床诊断具有重要意义。

本文将从深度和广度两个方面探讨免疫组织化学反应结果的判断标准。

一、浅谈免疫组织化学反应免疫组织化学反应是通过特定抗原和抗体的结合来识别目标分子在组织中的位置和表达水平的方法。

在实验室中，常用的免疫组织化学方法包括免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）等。

这些方法通过特定的染色试剂或荧光标记物与靶分子结合，再通过显微镜观察，可以定量和定位组织中的目标分子。

免疫组织化学反应作为一种重要的实验技术，在肿瘤诊断、生物医药研究等领域具有广泛的应用价值。

二、免疫组织化学反应结果的判断标准免疫组织化学反应结果的判断标准包括阳性和阴性的判断、定量的判断以及定位的判断。

阳性和阴性的判断是根据染色或荧光信号的强弱来确定目标分子在组织中的表达情况。

通常情况下，染色强度越强，表示目标分子在组织中的表达水平越高，反之则表示表达水平较低或不表达。

而定量的判断则是通过图像分析系统对染色或荧光信号进行定量化分析，得到具体的表达水平数值。

定位的判断则是通过观察目标分子的染色或荧光信号在组织中的位置，从而确定其在细胞或组织中的分布特点。

在判断标准的具体操作过程中，通常会参考一些常用的评价指标，例如染色强度评分、阳性细胞比例、荧光信号强度值等。

一般来说，染色强度评分可分为0-3级，0级表示无染色，1级表示轻度染色，2级表示中度染色，3级表示重度染色。

而阳性细胞比例一般通过计数阳性细胞和总细胞的比例来确定。

三、个人观点和理解对于免疫组织化学反应结果的判断标准，我认为应该根据具体实验的目的和研究问题来确定。

在某些情况下，我们可能更加关注目标分子的表达水平，因此定量分析显得尤为重要；而在另一些情况下，我们可能更加关注目标分子在组织中的定位，因此定位的判断就显得至关重要。

对于不同的研究问题，我们应该灵活运用免疫组织化学反应结果的判断标准，从而获得更加准确和全面的实验结果。

免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结

免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。

如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。

就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。

2、免疫组化最大的优势是定位和定性。

相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。

尤其对于有些因子的转位研究十分有用。

3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。

免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。

4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。

阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。

前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。

5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。

如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。

当然也不能做假阳性或假阴性结果。

6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。

我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。

失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。

免疫组化结果判断及常见问题的分析

三、结果分析
1-day CM
阳性强度 20×10视野下，随机选
取5个视野，测100个阳性细胞的平均光密度即为此 4-day CM 片的阳性强度。
PCNA
S-P×400 S-P×400
阳性细胞百分比
计数100个瘤细胞，其中阳性细胞的比例：
＜5%
（－）
5%~30% （＋）
30%~50% （＋＋）
利用仪器按照不同的目的进行图象的修正、变换、特征提取和测量。 1）“狭义”指消除图象的模糊不清部分，校正畸变。 2）“广义”包括对图象的结构分析，提取特征进行测量。
2、图象处理系统组成
图象输入（显微镜、扫描仪）图象处理运算（病理图文分析软件）图象、数据输出
3、图象处理系统功能
几何形态学定量分析细胞核、浆的大小、面积、核浆比；细胞分布密度、个数；血管、腺体的面积、密度；间质的面积免疫组织化学分析按着色灰度分类，计算阳性、阴性细胞的面积含量 DNA倍体分析计算正常细胞及肿瘤细胞DNA 含量，给出倍体参数、DNA参数分布直方图 AgNOR分析颗粒分析：数目、大小、面积、比例
全片着色
Cyclin D1 套细胞淋巴瘤
全片着色
边缘着色
“阴阳脸”着色
气泡
非特异性着色及其对策
非特异性着色原因操作过程冲洗不充分内源性过氧化物酶
内源性生物素电荷吸附抗体不纯
切片制片不当加试剂后切片干燥
对策每步冲洗3×5min
3％H2O2封闭使用生物素阻断试剂盒阻断
非免疫动物血清封闭采用单克隆抗体改善取材和制片防止切片干燥
四、免疫组化异常着色及对策
1.非特异性着色及其对策
非特异性着色原因操作过程冲洗不充分内源性过氧化物酶

免疫组化实验结果的判定和分析

免疫组化实验结果的判定和分析免疫组化实验结果的判定和分析就实验结果而言，免疫组化技术服务主要涉及抗体实验结果的描述与分析、图片的确定与选取、相关数据的提供，上述工作是免疫组化工作的重点内容。

只有严格的实验设计、标准的实验操作、专业化的结果分析才能满足客户的要求，更好地为客户提供最优质的服务。

免疫组化结果的判定原则：1•必须同时设对照染色。

没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。

2•抗原表达必须在特定部位。

如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53 蛋白应定位在细胞核内；EMA 应定位在细胞膜上等等。

不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。

3•阴性结果不能视为抗原不表达。

由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。

4•尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免疫标记。

因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。

5•对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应结合临床资料、X线等影像学及实验结果综合分析。

对照染色设计：（一）对照染色的目的设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。

假阴性的原因主要有三种：①组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽；②抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体）；③染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液pH 和离子强度不当等。

假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有：①自发荧光或内源酶等干扰；②抗体试剂不纯（特别是一抗）；③操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；④Fc 受体的干扰，等等。

（二）对照的种类及其选用目的对照染色大致可分为四类：即阳性组织对照、阴性组织和阴性试剂对照及自身对照。

•阳性组织对照指用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照。

正确的结果应呈现阳性，目的是为了证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。

免疫组化操作及问题分析

免疫组化操作及问题分析一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。

在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。

免疫系统酶组化技术就是通过共价键将酶相连接在抗体上，做成酶标抗体，再借酶对底物的如上所述催化作用，分解成有色的不溶性产物或具备一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下展开细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可以将其分成轻易法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用作标记的抗体可以就是用免疫系统动物制取的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最出色就是特异性弱的高效率价的单克隆抗体。

轻易法就是将酶轻易标记在第一抗体上，间接法就是将酶标记在第二抗体上，检测非政府细胞内的特定抗原物质。

目前通常采用免疫系统酶组化间接染色法。

三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％h2o2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；将切片灌入0.01m枸橼酸缓冲液，微波中最小火力（98℃-100℃）冷却至融化，加热（约5-10min），反反复复两次；5，将切片自然冷却至室温，pbs洗涤3次，每次5min；6，半封闭，5％bsa，室温20min，限制住多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，pbs冲洗3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，pbs冲洗3次，每次3min；11，滴加sabc，37℃，30min；12，pbs冲洗3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，dab显色剂布局不好后，几滴埃基奇切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。

免疫组织化学染色质控及常见问题分析

第18卷第1期2009年2月中国组织化学与细胞化学杂志CHINESE JO URNAL O F HISTOC HEMISTRY A N D CYTOCHEMIST R YVol 1181No 11Fe b 12009免疫组织化学染色质控及常见问题分析栗　娜3　黄　虎(第161医院病理科,武汉　430010)　〔关键词〕　免疫组织化学;　质量控制〔中图分类号〕　R737133 〔文献标识码〕　A DOI :1013870/zgzzhx.2009.01.022〔收稿日期〕2525　〔修回日期〕22〔作者简介〕栗娜,女(年),汉族,病理科技师。

3通讯作者(T ) 免疫组织化学是应用免疫学和组织化学原理,对组织切片中抗原成分进行原位的定位、定性、定量研究的一种技术,在病理科工作中对疑难病例的诊断和分型有重要作用,并对指导临床治疗,了解肿瘤预后发挥重要作用,已成为病理科不可缺少的技术支持,因此免疫组化的质量控制显得尤为重要。

本室经过长期实践对其流程进行了严格规范,制定了严格的标准化流程,现介绍本室流程如下并对常见问题作逐一分析。

材料和方法11材料　常规送检病理标本,全自动脱水机,Leica 切片机,包埋机等。

21主要试剂　ER 、PR 、C K 、C EA 、CD20、CD30、CD15、K i67、S100、N F 2κB 、P27、P53等一抗及免疫组化染色S 2P 试剂盒、浓缩型DAB 试剂盒、抗体稀释液等,均购自上海长嘉生物技术有限公司。

31组织材料处理　1)固定:组织取材新鲜,固定及时,形态保存完整,抗原物质的抗原性不丢失、不扩散、不破坏是获得良好免疫组织化学结果的前提。

根据组织类型不同其固定时间一般应在6至48h ,固定时间不足,会造成抗原丢失,可产生组织表面抗原为阳性表达,中央为阴性表达,固定时间超过72h 会使抗原不可逆性破坏,无法修复,而产生阴性表达。

本室固定液采用低酒精浓度(75%的酒精)的混合固定液,p H 值3152410,固定时间为6至24h ,应注意当固定液p H 值大于810容易造成背景染色。

免疫组织化学技术常见问题分析及改进措施

免疫组织化学技术常见问题分析及改进措施目的：分析免疫组织化学技术中常见问题，并提出相应改进措施。

方法：以2010年1月-2012年12月笔者所在科收治的80例患者病史资料为依据，根据切片方法不同分为A、B两组，比较两组切片质量及常见问题。

结果：本次研究的患者中A组有15例切片出现质量问题。

改进操作后的患者切片即B组均清晰地观察到阳性细胞。

结论：免疫组织化学技术环节多、问题多，应提出有针对性地改进措施，不断完善。

标签：免疫组织；化学技术；改进措施要进行免疫组织化学检测，必须首先有良好的免疫组化学切片。

这一制作过程相对复杂，有许多环节，故而容易出现问题，而每一个环节出错都将影响最终结果。

所以相关医务技术人员应具备扎实的技术功底，把好每一关，最终得出准确的检测结果。

笔者结合自身工作经验，对常见问题的改进做出分析，现报告如下。

1 资料与方法1.1 一般资料分析笔者所在科2010年1月-2012年12月对80例患者进行病理分析的诊断结果数据，患者中有15例需要鉴别低分化癌与肉瘤，20例需要鉴别转移癌的性质，13例需要分析肿瘤细胞来源以及其分化程度，10例要检测患者组织耐药基因，12例为检测肿瘤组织分化活性，10例是肿瘤患者治疗后的回访检测。

根据切片方法不同分为A、B两组。

经过对患者组织切片的临床观察，A组鉴别低分化癌与肉瘤的患者中有4例确诊为低分化癌，之后接受化疗，2例为肉瘤的患者则采取手术切除治疗；11例患者已经发生淋巴及血液转移；肿瘤细胞来源及分化程度分析的患者中有6例是由癌细胞转移发病，2例为原发癌，均为高分化癌；5例经过治疗后的患者MDR1耐药基因表达明显升高；检测肿瘤组织分化活性的6例患者中有4例为G1，分化活性较低，2例G2，即中分化；回访检测的患者中3例复发，2例目前无变异。

B组6例确诊为低分化癌，3例为肉瘤；9例患者已经发生淋巴及血液转移；3例是由癌细胞转移发病，2例为原发癌；5例治疗后的患者耐药基因表达升高；3例分化活性较低，3例中分化；回访检测中3例复发，2例无变异。