胶体金法与酶联免疫法相结合快速检测克伦特罗

胶体金法与酶联免疫法相结合

快速检测克伦特罗

苏存举,陈福生3,高志贤3①,苗颂②,刘楠①,冯屹

(华中农业大学食品科技学院,武汉430070)

摘要:目的研究胶体金免疫层析法(GIC A)与酶联免疫吸附法(E LIS A)相结合,以建立对饲养、屠宰、流通各环节的畜尿克伦特罗(Clenbutero1,C L)定性和定量检测的方法。方法用柠檬酸三钠还原氯金酸,制备20nm粒径的胶体金,胶体金标记单抗后喷涂到玻璃纤维膜上,特异性抗原(C L2BS A)以线状包被在硝酸纤维素膜上,制成快速检测试纸条。用E LIS A进行定量。结果对

G C2MS不确定的36份阴性样品和24份阳性样品用GIC A方法检测,其阴性符合率为97%,阳性

符合率为96%。同样样品用E LIS A方法检测,其符合率为100%。最低检测限为5.0ng/m L;用GIC A法只需在试纸条上滴加4～5滴样液5～10min就可出结果;在2个月的随机抽查中,试纸条的检测结果没有变化。结论本方法准确性高、稳定性好,操作过程简单,适合于作现场大规模、高通量检测。因此本方法具有广泛的应用及推广价值。

关键词:　胶体金;　克伦特罗;　酶联免疫吸附法

中图分类号:R155.5 文献标识码:A 文章编号:1001-5248(2008)03-0176-04

克伦特罗(Clenbutero1,C L)俗称“瘦肉精”,是β2肾2上腺受体激动剂。在家畜养殖中加入C L可以提高瘦肉率或者加速动物的生长。C L作为药物使用时可以治疗哮喘等疾病,但是如果用作家畜生长调节剂,其剂量通常是治疗疾病剂量的5～10倍,这样就可能残留于食品中而引起人体的不良反应,主要包括心跳过快和四肢肌肉颤动等中枢神经中毒后的失控症状,甚至导致死亡〔1〕。目前已有多种方法用于对C L的残留分析,主要包括酶联免疫检测法(E LIS A)、高效液相色谱法(HP LC)、气相色谱2质谱联用法(G C2MS)、液相色谱2质谱联用法(LC2MS)等,主要是依靠特殊仪器进行分析,不能适应市场监督需要快速、简便、价廉的要求。而E LIS A分析法操作简便、检测快捷、灵敏度高、特异性强,适用基层日常应用〔2〕。胶体金免疫层析法(GIC A)解决了以往在现场不能进行快速和定性检测的难题。因此,

基金项目:国家科技支撑计划(2006BAK02A09)

天津市科技攻关基金项目课题(N o.06VFG ZSH02200)

作者简介:苏存举(1981-),男,硕士研究生。从事食品安全快速检测研究。

3通讯作者

①军事医学科学院卫生学环境医学研究所

②山东大学将E LIS A和GIC A相结合应用于C L筛选检测已成为各地开展C L检测工作的主要技术手段。

1　材料与方法

1.1　材料　氯金酸为上海化学试剂厂产品;克伦特罗标准品为Sigma公司产品;克伦特罗单克隆抗体为浙江台州金芯生物工程公司产品;硝酸纤维膜(NC)、玻璃纤维膜、吸水纸、PVC背板均为美国Mill2 pore公司产品;克伦特罗检测试剂盒为江苏微生物研究所产品;其他试剂为国产分析纯。

1.2　仪器　紫外可见光分光光度计,Du2530型, Beckman公司;透射电镜,H27500型,日本HIT ACHI 公司;原子力显微镜,SPM29500型,日本岛津公司;磁力恒温搅拌器,79.3型,上海市曹行无线电元件厂;点膜机,Bio2Dot公司;普通离心机,TG L21613型,上海安亭科学仪器公司;纯水制备装置,AS D型,军事医学科学院卫生装备研究所。

1.3　方法

1.3.1　胶体金的制备　按照文献〔324〕采用柠檬酸三钠还原法制备20nm胶体金颗粒〔5〕。取0.01%氯金酸水溶液100m L,用恒温电磁搅拌器加热至沸腾,一次性加入l%柠檬酸三钠水溶液

2.52m L,再加热

20min,至溶液呈酒红色,室温冷却,4℃保存。用Beckman Du2530分光光度计对胶体金在可见光范围400～600nm进行扫描,发现其主峰宽度较小,表明制备的胶体金颗粒较均匀(λmax为520nm)。

1.3.2　抗体的标记与纯化

取20nm胶体金的溶液10m L,用0.1m ol/L的K2C O3溶液将pH调至9.0左右,4000r/min离心20min,弃沉淀。将适量单抗溶液逐滴加人胶体金溶液,搅拌后静置30min,再逐滴加入1.1m L经微孔滤膜过滤的10%BS A,搅拌15min,4℃过夜。标记后的抗体溶液于4000r/min 离心20min,弃沉淀,然后10000r/min离心1h,弃上清,沉淀用l m L胶体金保存液重悬,分装后4℃保存。

1.3.3　结合抗原的制备　采用重氮化法:称取1mg

C L,加入200μL1m ol/L HC1和500μL蒸馏水,连续3次加入0.2m ol/L NaNO220μL,间隔为20s。将混合液置于4℃下轻微搅拌1h,加入(NH4)2S O4终止反应(30μL,1.5mg)。将重氮化的C L缓慢滴入到BS A溶液(4.5mg BS A溶于0.5m L0.1m ol/L磷酸盐缓冲液,pH值为8)中,滴加中不断用1m ol/L NaOH溶液调节pH值使其维持恒定。将反应生成的橙黄色反应液置于4℃下轻微搅拌过夜。将偶联反应后的反应液移入透析袋中,置于0.01m ol/L磷酸盐缓冲透析液(pH值为7.4,0.15m ol/L NaC1)于4℃充分透析。将透析后的偶联产物C L2BS A分装、冷冻储存备用,避免反复冻融。C L的最大吸收波长为296nm,BS A的最大吸收波长为278nm,偶联蛋白液的最大吸波长在C L和BS A标准液的最大吸收波长之间,为280.5nm。

1.3.4　GIC A试纸条的制作　测试条由玻璃纤维膜,硝酸纤维膜(NC膜),加样纸,吸收纸4部分组成。将玻璃纤维膜裁成6mm的细条,然后放入含1%BS A,1%T ween220的P BS液中浸泡30min,37℃烘干,最后将胶体金探针灌注已处理好的玻璃纤维膜上,真空干燥备用。在NC膜上用点膜机将C L2 BS A和羊抗兔IgG喷成2条线,经真空干燥后,采用1%BS A、0.01m ol/L P BS封闭2h,以0.01m ol/L P BS洗涤,再真空干燥。30mm吸水纸、25mm NC 膜、6mm玻璃纤维膜、15mm加样纸,由顶部依次粘于PVC板上,裁成细条备用。

2　结果

2.1　制备所得胶体金颗粒的特征　采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒均一,颗粒的平均直径为(20±3)nm。均一的颗粒为胶体金探针的制备打下良好的基础,并且对试纸条检测线产生可目测的强烈信号至关重要。

2.2　制备胶体金探针的最优化条件　胶体金探针的制备主要是通过范德华力和相互之间的疏水作用力的介导作用使得胶体金吸附在抗体表面。抗体用量是影响标记结果的一个重要因素,用量较标记所用量低时,会产生游离的胶体金,而高于所要求的含量则会影响到最终检测的灵敏度。抗体最佳用量可以采用Mey氏稳定化试验测定。用0.1m ol/L的K2C O3将胶体金溶液pH调至8.0左右然后取试管8支,分别加入1.0m L胶体金溶液。将抗体稀释后,各取等体积不同浓度稀释液分别加入上述试管中,另设一不加抗体的对照管。放置10min,在各管中加入0.1m L10%NaCl,混匀后静置2h。观察各管中胶体金溶液变化,未加抗体及加入抗体不足的溶液颜色由红变蓝,而加入蛋白量达到或超过时的溶液则保持不变。标记蛋白量即为最低稳定胶体金溶液不变色的蛋白量的基础上再加20%

。本试验的抗体量在15μg/m L时溶液则保持不变,所以本实验最佳标记蛋白量为18μg/m L。

2.3　GIC A试纸条的初步检测　将C L标准溶液滴加45滴在样品垫上,静置5～10min后观察NC膜的显色情况。阴性结果分别在控制线(C)位置和检测线(T)位置呈现2条红色条带(图12A),阳性结果只在控制线(C)位置呈现1条红色条带(图12B)。

图1　阴性(12A)和阳性(12B)结果图

2.4　试纸条检测限的确定　试纸条检测C L标准溶液浓度在5.0ng/m L及以上时,检测线位置无红色条带出现,结果为阳性;而C L标准溶液浓度分别为0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,

3.0,3.5,

4.0,4.5m ol/L 时,在检测线位置上有明显的红色条带出现,结果视