流感疫苗生产及研究进展

既可作用于病毒含 氨基的核苷酸碱基 （如A,G,U），又可 作用病毒壳蛋白。
用。
1）病原体蛋白的抗原性严重破坏， 可能有病原体存活； 2）灭活时间长； 3）易受温度、pH、浓度、是否存在 有机物、病原体的种类和含氮量等 因素影响； 4）残留的游离甲醛，注入机体后， 会产生制激性反应。
一种杂环类化 合物(C3H4O2)， 沸点155℃，常 温下是无色粘 稠状液体，对 病毒具有很强
每 1ml中各型流感病毒血凝素含 量应为配制量的80%～120%
≤50ug/ml ≤100ng/ml ≤350ug/ml,不高于血凝素总含 量的3.5倍 ≤20EU/ml ≤50ng/剂
符合规定 符合规定
研发与展望
• 目前广泛应用流感疫苗 • 季节性四价流感疫苗 • 细胞基质流感疫苗 • 喷鼻减毒活疫苗 • 基因工程流感疫苗 • 病毒样颗粒、病毒载体及DNA流感疫苗 • 通用流感疫苗
销售
每年世界卫 生组织根据 上一年流感 病毒流行情 况预测下一 年度流感病 毒流行株并 向各生产企 业发布
从WHO合作 实验室获得 病毒疫苗株， 并将病毒在 鸡胚内培养， 制备毒种
将病毒接种 到鸡胚内培 养，收获尿 囊液，经纯 化、灭活、 裂解后制备 成疫苗
2月份 9月份
3-4月份 10-11月份
5-9月份 12-次年4月
近年获批上市的新型流感疫苗
疫苗种类 商品名
厂家
批准地 批准时间
佐剂疫苗 Fluad®
Novartis 欧洲 1997
• 充实一下新型流感疫苗表 皮内注射 Intanza®/
疫苗
IDflu®
Sanofi Pasteur
欧洲
2009
高剂量疫 苗
Fluzone®
Sanofi Pasteur
美国
2009
Influvac® TC
灭活疫苗种类和生产工艺
灭活疫苗种类
第一代
全病毒
价格较低，但副反应较高，部分人群不适宜接种，已逐 渐淘汰
第二代 裂解 接种效果好，临床副反应较少，适合各年龄段人群接种
第三代 亚单位 有效抗原含量高，更安全，价格较高
全病毒疫苗
裂解疫苗
亚单位疫苗
生产工艺
WHO发布毒株
生产企业获得 和培育毒株
疫苗生产
作用于病原体DNA或 RNA，改变病毒核酸 结构达到灭活目的， 而不直接作用于蛋 白。
1）不破坏病毒的血凝素抗原, 保持 病毒良好的免疫原性； 2）灭活时间短； 3）其水解产物对机体无害，接种反 应轻。
的灭活作用。
常用的裂解剂
Triton X-100
简要介绍
聚乙二醇辛基苯基醚,是一种非离 子型表面活性剂（或称去污剂）
9月-次年2月份 5月-9月
生产周期5-6个月
生产工艺
单价原液制备
毒种和病毒尿囊液制备
毒种MOI 接种量
温湿度 培养时间
通风
颜色 量
温度 时间
选胚
接种
培养
收获
纯化
裂解
质量控制
产品名称 主代种子
工作种子
检定项目 无菌检查 血凝滴度 支原体检查
鉴别试验
病毒滴度 外源性禽白血病病毒检测
– 人流感病毒 Human influenza
– 禽流感病毒 (非H5) Avian (Non-H5)
N Engl J Med 10.1056/nejmoa0903810
流感的实验室诊断
流感疫苗
流感已成为全球患病人数最多的一 类疾病。接种流感疫苗是目前预防和控制 流感最经济、最有效的手段，已被广泛采 用，并证明有效率达到 70％以上。
流感疫苗生产及研究进展
内容
1 病毒性灭活疫苗概述 2 流感和流感病毒 3 流感疫苗生产工艺
4 流感疫苗研发
病毒性灭活疫苗概述
• 定义及分类
病毒接种和培养
培养基质
流感疫苗：鸡胚
出血热及森脑疫 苗：原代地鼠肾 细胞
采用物理或化 学的方式将病 毒灭活
灭活方法： 加热 灭活剂（福 尔马林等）
其他的生 产步骤 纯化：纯化全病 毒疫苗
Solvay Pharmaceu
ticals Inc
荷兰
2001
Optaflu® Novartis 欧洲 2007
细胞培养 Flucelvax® 疫苗 Celtura®
机溶剂敏感。
流感病毒的变异
原因：
方式：
–流感病毒结构特点 ➢ –天然宿主的广泛存
在
–密切接触
抗原漂移（Antigenic drift） --小变异，同一亚型 --基因点突变所致 --引起流行
➢抗原转换（Antigenic shift）
--大变异
--基因片段交换
--引起大流行
抗原漂移（Antigenic Drift）
流感的流行特点
• 是在短期内突然发生，迅速蔓延，造成不同程度的流行， 包括世界大流行，局部暴发流行及散发。
• 具有一定的季节性：温、寒带地区常在冬、春季节流行， 但热带和亚热带地区任何季节都可以流行。
• 流感病毒传播迅速、流行广泛、抗原易变异，人群的特异 性免疫状况不稳定。
• 发人病群率为死高年亡迈，率体并弱伴升或有高带一超有定过慢的一性死定疾亡病率的患。正者最常。高临每的界次为水流青感少平流年行，后高在危
机理
它能溶解脂质，以增加 抗体对细胞膜的通透性。
Triton N-101
聚乙二醇(壬基苯基)醚,是一种非 溶解脂质 离子型表面活性剂（或称去污剂）
CTAB
十六烷基三甲基溴化铵,阳离子表 面活性剂，是一种阳离子去污剂
与非离子及两性离子表 面活性剂有良好的配位 性，对多种油脂具较好 的乳化作用, 有轻微脱 脂作用.
裂解：裂解疫苗
成品
纯化全病毒疫苗： 冻干人用狂犬病 疫苗
出血热、森脑 ----含氢氧化铝 佐剂
狂犬疫苗：Vero 细胞
亚单位：亚单位 疫苗
裂解：流感病毒 裂解疫苗
灭活疫苗：称死疫苗，是指利用加热或甲醛等理化方法将人工大量培养 的完整的病原微生物杀死，使其丧失感染性和毒性而保持免疫原性，并 结合相应的佐剂而制成的疫苗。
疫苗效果影响因素
目前广泛应用的流感疫苗
接种疫苗是当今预防和控制流感发生和流行最 有效的手段。目前，使用的流感疫苗是三价的，包括 两种甲型（H1N1，H3N2）和一种乙型(B)流感病毒抗 原成分，应用最广泛的有：
灭活：Inactivated influenza vaccine（IIV）：6月以上 减毒：Live attenuated influenza vaccines（IAIV）：2-49岁
每1ml中各型流感病毒血凝素 含量应为配制量的80%～120%
≤150ug/ml
成品检测指标
成品检定项目 鉴别实验 外观 装量 pH值
血凝素含量
游离甲醛含量 卵清蛋白含量
总蛋白含量
细菌内毒素 抗生素残留量
无菌检查 异常毒性检查
长春公司规程标准
抗原性与推荐的病毒株相一致
微乳白色液体，无异味 应不低于标示量 6.8～7.8
中间品
病毒收获液
病毒浓缩液 病毒纯化液
病毒裂解 纯化液
病毒灭活 纯化液
中间产品质量控制
检定项目 微生物限度
沙门氏菌 血凝滴度 细菌内毒素 蛋白含量 蛋白含量 细菌内毒素 蛋白含量
蛋白含量
细菌内毒素 灭活验证实验
微生物限度
长春公司企业注册标准 <105CFU/ml 阴性 ≥1:160 <10EU/ml ≤3.5mg/ml ≤10mg/ml <160EU/ml ≥2.0mg/ml
血凝和血凝抑制试验
• 某些病毒能够与人或动物的红细胞发生凝 集，这称之为红细胞凝集反应（HA）。这 种凝集反应被加入的特异性血清所抑制， 即为红细胞凝集抑制试验（HI）。
血凝和血凝抑制试验
血凝素含量检测（单扩）
标准直线
半成品质量控制
半成品检定项目 无菌检查 血凝素含量
裂解剂残留量
长春公司企业注册标准 符合规定
当前主要应用的疫苗种类
目前，使用的流感疫苗是三价的，包括两种甲 型（H1N1，H3N2）和一种乙型(B)流感病毒抗原成分， 应用最广泛的有：
灭活：Inactivated influenza vaccine（IIV）：6月以上 减毒：Live attenuated influenza vaccines（IAIV）：2-49岁
长春公司的病毒性灭活疫苗
工艺流程 名称
冻干人用狂犬 病疫苗
病毒培养
基质：Vero细 胞培养 方式：生物反 应器
病毒纯化 病毒裂解 病毒灭活
超滤浓缩；
柱层析
无
（分子筛）
灭活剂：β丙内酯
半成品配 制及分包
装
冻干
双价肾综合征 出血热疫苗 森林脑炎灭活 疫苗
基质：原代地 鼠肾细胞 方式：转瓶
超滤浓缩；
柱层析
外源性禽腺病毒检测 无菌检查 血凝滴度 支原体检查
鉴别试验
病毒滴度
药典标准 无菌生长 不低于1：320 符合规定 采用交叉血凝抑制法， P/N不低于8 不低于6.5Lg EID50/ml 阴性 阴性 无菌生长 不低于1：320 符合规定
采用交叉血凝抑制法， P/N不低于8
不低于6.5Lg EID50/ml
≥0.5mg/ml
＜0.2EU/ugHA 符合规定 <10CFU/ml
单价病毒原液质量控制
单价病毒原液 检定项目
鉴别实验 血凝素含量 蛋白含量 无菌检查
病毒裂解 效果检查
长春公司企业 注册标准
抗原性与推荐的病毒株相一致 ≥90ug/ml
不高于血凝素含量的4.0倍 符合规定
病毒颗粒应裂解完全。每次更换 流感病毒毒株后生产的前三批单 价病毒液须进行该项检查。
颗粒
NA
NA活性；水解细胞多糖受体，协助新生病毒颗
粒从被感染宿主细胞表面游离下来，促使子代病
毒释放
M1、M2 病毒基质膜蛋白，有保护作 用；质子通道作用
NS1、NS2 非结构蛋白，抑制宿主细胞蛋白合成或参与
vRNA合成
流感病毒的理化特性 ➢ 流感病毒对热敏感，通常56℃30min被灭活，但有
些毒株56℃90min被灭活。 ➢ 最适PH为7.0-8.0 ➢ 可被紫外线灭活 ➢ 因其为带囊膜的病毒，故对乙醚、氯仿、丙酮等有
• RNA5 1565
• RNA6 1413
• RNA7 1027 • RNA8 890
PB2
RNA转录酶；识别和结合来源于宿主细胞的帽子
PB1
RNA转录酶主要成分；启动转录和RNA合成延伸
PA
具有解旋酶话性
HA
结合靶细胞受体，诱导病毒与靶细胞融合诱导中
和抗体，凝集红细胞
NP
与基因组RNA结合，参与形成核糖核蛋白（RNP）
人群中总要造成不同程度的超额死亡。
• 流感患者和隐性感染者是流感的主要传染源。从潜伏期末 到发病的急性期（约7天）都有传染性。
流感病毒形态结构
流感病毒形态结构
流感病毒电镜照片
流感病毒的超细微结构照片
甲型流感病毒基因组各节段的大小与功能
节段 长度（bp）编码蛋白
主要功能
• RNAI 2341 • RNA2 2320 • RNA3 2233 • RNA4 1778
无
（分子筛）
灭活剂：甲醛 含铝佐剂
流感病毒裂解 疫苗
基质：鸡胚 方式：孵化间
超滤浓缩； 裂解剂： 蔗糖密度 Triton 灭活剂：甲醛 无硫柳汞 区带离心 X-100
两种灭活剂的比较
甲醛
β丙内 酯
简要介绍
灭活机理
优缺点
甲醛，化学式
HCHO，称蚁醛。 无色气体，有 特殊的刺激气 味，对人眼、 鼻等有刺激作
RNA
Hemagglutinin Neuraminidase Antibodies Sialic acid
HA 和/或 NA 基因的点的变异 频繁发生 A 型和B型发生
抗原转换（Antigenic shift)
人类和动物毒株的RNA发生交换 (HA 和/或NA基因的全球性变异),导致新的 亚型出现 少见但后果严重 只在 A型出现
H1N1
H91999 H5 1997
1996
2002 2002
1995
2005
抗原漂移所引起的历史上的流感流行
PB1
HA
PB1
百度文库
NA
NA
甲型H1N1流感病毒
• 4种不同来源的基因 4 different genes:
– 北美猪流感病毒 North America swine
– 欧亚猪流感病毒 Asia/Europe swine
流感的流行情况
H1N1
H1N1
H2N2
H3N2
H1N1
1918
1940
1960
1980
2000
2020
1918
Spanish Influenza
H1N1
1957
Asian Influenza
H2N2
1968
Hong Kong Influenza H3N2
H7 1980 1975
1985
2009
Novel Influenza
流感和流感病毒
• 流行性感冒（Influenza）即流感，是由甲（A）、 乙（B）、丙（C）三型流感病毒分别引起的急性呼 吸道传染病。常造成不同程度的流行，对人类的健 康造成巨大的威胁。
流感
50 40 30 20 10
0 儿童 成人
发病率 范围
慢性病恶化、 继发感染、 其它……
- 痛苦不堪 - 缺课或缺勤 - 就医 - 使用抗生素 - 住院 - 死亡