蛋白酶专一性酶切位点地影响因素分析报告
蛋白酶酶切位点
蛋白酶酶切位点木瓜蛋白酶巯基蛋白酶具有广泛特异性TPCK,TLCK,抑蛋白酶醛肽α-巨球蛋白,烷化剂胃蛋白酶酸蛋白酶广泛特异性胃蛋白酶抑制素胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶在K或R之后TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白人体20种氨基酸及其英文缩写名称三字符号单字符号丙氨酸Ala A精氨酸Arg R天冬氨酸Asp D半胱氨酸Cys C谷氨酰胺Gln Q谷氨酸Glu/Gln E组氨酸His H异亮氨酸Ile I甘氨酸Gly G天冬酰胺Asn N亮氨酸Leu L赖氨酸Lys K甲硫氨酸Met M苯丙氨酸Phe F脯氨酸Pro P丝氨酸Ser S苏氨酸Thr T色氨酸Trp W酪氨酸Tyr Y缬氨酸Val V【生化】特异性蛋白酶的酶切位点胰蛋白酶arg、lys，得到以arg、lys为C末端残基的肽段。
胰凝乳蛋白酶phe、trp、tyr 等疏水aa。
胃蛋白酶phe、trp、tyr等疏水aa。
木瓜蛋白酶arg、lys。
葡萄球菌蛋白酶，磷酸缓冲液ph7.8时断裂glu、asp。
碳酸氢铵缓冲液ph7.8或醋酸铵缓冲液ph4.0时断裂glu。
梭菌蛋白酶arg，用于不溶性蛋白的长时间裂解。
CNBr断裂Met。
羟胺断裂asn—gly间的肽键。
二硫键可以用巯基化合物还原法或者过甲酸氧化法断裂.。
木瓜蛋白酶（Papain），又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。
木瓜蛋白酶是番木瓜（Carieapapaya）中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。
木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用。
木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。
至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。
酶的特异性及影响酶活性的因素
1ml
37℃ 3-5min 3-5滴
37℃ 0℃ 3-5min 3-5min KI-I（滴） 3-5滴 3-5滴
现
象
Exit
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酶的特异性及影响酶活性的因素
生 物 化 学 实 验
依次为“0℃ 后复温37℃ 、 37℃
依次为：0℃ 后复温37℃、37℃ 、0℃ 、100℃后复温37℃（沸水时间短 ） Exit
化 学 实 验
淀粉→大分子糊精-→中分子→小分子→简单分子→麦芽糖 和α-糊精 KI-I 蓝 蓝紫 褐 红 不呈色 不呈色
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酶的特异性及影响酶活性的因素
实验原理 生 物 化 学 实 验
3、 激活剂和抑制剂对酶活力的影响： 酶的活性常受某些物质的影响，有些物质能增 加酶的活性，称为酶的激活剂；另一些物质则会降 低酶的活性，称为酶的抑制剂。例如CI-为唾液淀粉 酶的特异性激活剂，Cu2+则为该酶的特异性抑制剂。 通常情况下，很少量的激活剂或抑制剂就会影响酶 的活性，但是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物 质对不同的酶所起的作用不同，如Mg2+是脱羧酶烯 醇化酶的激活剂，但是肌球蛋白ATP酶的抑制剂， 同一种酶也可因激活剂的浓度不同而作用不同，如 CI-在低浓度时是激活剂 ，达三分之一饱和度时则变 为抑制剂。
Exit
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酶的特异性及影响酶活性的因素 酶的激活与抑制
生 物 化 学 实 验
管
号
1
2
3
4
1％NaCI (ml) 1%CuSO4(ml) 1%Na2SO4(ml) H2O (ml)
稀释唾液(ml) 0.1%淀粉(ml)
蛋白酶的分类及酶切位点
蛋白酶的分类及酶切位点氨基酸0.ppt氨基酸的名称与符号alanine 丙氨酸Ala Aarginine 精氨酸Arg Rasparagine 天冬酰氨Asn Asx Naspartic acid 天冬氨酸Asp Asx Dcysteine 半胱氨酸Cys Cglutamine 谷氨酰胺Gln Glx Qglutamic acid 谷氨酸Glu Glx Eglycine 甘氨酸Gly Ghistidine 组氨酸His Hisoleucine 异亮氨酸Ile Ileucine 亮氨酸Leu Llysine 赖氨酸Lys Kmethionine 甲硫氨酸Met Mphenylalanine 苯丙氨酸Phe Fproline 脯氨酸Pro Pserine 丝氨酸Ser Sthreonine 苏氨酸Thr Ttryptophan 色氨酸Trp Wtyrosine 酪氨酸Tyr Yvaline 缬氨酸Val V血清终止胰酶消化的原理血清终止的原理其实是竞争抑制。
就是用过量的牛血清中含有的蛋白来和胰酶结合。
不给胰酶消化细胞蛋白的机会。
细胞传代时，血清为什么能终止胰酶消化？胰蛋白酶的酶切位点是肽链的Lys和Arg两个残疾的羧基端肽键，血清的加入可使酶饱和，严格上说不是竞争性抑制，因为血清蛋白不是抑制剂，还是底物！什么样的细胞不能用胰酶-EDTA消化植物细胞不能用胰酶-EDTA消化，要用纤维素酶消化。
应该是肿瘤细胞吧。
正常的细胞，貌似都需要用胰酶或者胶原酶消化。
EDTA-胰酶，只不过是在胰酶里加入了EDTA而已。
EDTA是乙二胺四乙酸，一种金属螯合剂。
一般和胰蛋白酶配合使用。
原因在于，钙，镁等金属离子会降低胰酶活力，故在使用胰酶消化液时要配合加入EDTA。
它可以螯合这些离子，消除对胰酶的抑制。
干细胞饲养层制作中，胰酶—EDTA消化成纤维细胞（MEF）时，EDTA的作用是什么？应该是胰酶分散细胞，EDTA鳌合金属离子使金属酶失活《军医进修学院学报》1992年02期加入收藏投稿正常人血浆蛋白酶解产物对胃癌细胞肺转移抑制作用的研究焦顺昌赵东海黄昌霞王洪海【摘要】：本文采用胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶联合消化方法得到正常人血浆(NHP)有限蛋白酶解产物(NHP-EP)。
蛋白酶酶切位点
蛋白酶酶切位点木瓜蛋白酶巯基蛋白酶具有广泛特异性TPCK,TLCK,抑蛋白酶醛肽α-巨球蛋白,烷化剂胃蛋白酶酸蛋白酶广泛特异性胃蛋白酶抑制素胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶在K或R之后TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白人体20种氨基酸及其英文缩写名称三字符号单字符号丙氨酸Ala A精氨酸Arg R天冬氨酸Asp D半胱氨酸Cys C谷氨酰胺Gln Q谷氨酸Glu/Gln E组氨酸His H异亮氨酸Ile I甘氨酸Gly G天冬酰胺Asn N亮氨酸Leu L赖氨酸Lys K甲硫氨酸Met M苯丙氨酸Phe F脯氨酸Pro P丝氨酸Ser S苏氨酸Thr T色氨酸Trp W酪氨酸Tyr Y缬氨酸Val V【生化】特异性蛋白酶的酶切位点胰蛋白酶ar g、lys，得到以arg、lys为C末端残基的肽段。
胰凝乳蛋白酶phe、trp、tyr 等疏水aa。
胃蛋白酶ph e、trp、tyr等疏水aa。
木瓜蛋白酶a rg、lys。
葡萄球菌蛋白酶，磷酸缓冲液p h7.8时断裂gl u、asp。
碳酸氢铵缓冲液ph7.8或醋酸铵缓冲液ph4.0时断裂gl u。
梭菌蛋白酶a rg，用于不溶性蛋白的长时间裂解。
CNBr断裂Met。
羟胺断裂as n—gly间的肽键。
二硫键可以用巯基化合物还原法或者过甲酸氧化法断裂.。
木瓜蛋白酶（Papain），又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。
木瓜蛋白酶是番木瓜（Cariea papay a）中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。
木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用。
木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。
酶专一性及活性影响因素探讨
酶的专一性及酶促反应速率影响探讨一． 实验目的1) 通过实训测出各种因素是如何对酶活性进行影响的。
2) 找到唾液淀粉酶各种单因素影响的最佳条件。
二． 实验原理酶与一般催化剂的区别是具有高度专一性。
支队某一种或一类底物具有催化作用。
对其他底物没有催化作用。
淀粉在唾液淀粉酶的作用下水解，经过一系列被称为糊精的中间产物最后生成麦芽糖。
碘液可指示淀粉的水解程度。
淀粉→蓝色糊精→红色糊精→无色糊精→麦芽糖淀粉酶只对淀粉起作用，而不能水解蔗糖。
淀粉、蔗糖、与糊精无还原性，或还原性很弱，对班氏试剂呈阴性反应；麦芽糖、葡萄糖、果糖是还原糖，与班氏试剂共热后生成红棕色Cu 2O 2沉淀。
本次实验内容通过比较淀粉酶在不同PH 、温度、以及有无抑制剂或激活剂时水解淀粉的差异，说明这些环境因素与酶活性的关系。
三． 试剂与器材1. 试剂2%蔗糖溶液、1%淀粉溶液、班氏试剂（由CuSO 4配制）、碘液、磷酸缓冲液 2. 材料唾液淀粉酶。
先用蒸馏水漱口，再含10ml 左右，轻轻咀嚼2min 后吐出到收集杯里，既得唾液淀粉酶溶液。
3. 仪器恒温水浴（37℃）、沸水浴（100℃）、冰浴（0℃），试管数只，移液管数只，白瓷板，胶头滴管。
四． 操作步骤1.2.隔1min用胶头滴管从2号试管取一滴，滴入白瓷板槽内，然后加一滴碘液，若呈无色或淡黄色，则可以停止反应；若呈蓝色，说明2号试管淀粉没有水解完全，继续反应，知道取出的反应液与碘液反应呈无色或淡黄色。
3.4.五．结果与分析针对每个实验现象进行说明，说明为什么是这个现象，如果做的实验现象和理论有差别，说明，为什么你做的是这个现象，说明你自己在操作时，错在什么地方。
蛋白酶专一性酶切位点的影响因素分析汇总
蛋白酶专一性酶切位点的影响因素分析摘要：生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽。
酶法水解蛋白质广泛用于制备生物活性肽，但酶解法存在目标肽得率低、副产物过多的缺点。
蛋白酶和蛋白质的选择是关键步骤，局部构象、三维结构、实验条件以及其它偶然因素也会影响蛋白水解酶的酶切效果。
本文综述了温度、pH值、温度和pH值共同作用、金属离子对酶切位点的影响，旨在为研究酶切规律、制备高得率活性肽提供理论基础。
关键词：生物活性肽；蛋白酶；水解条件；酶切位点Influencing Factors Analysis of Protease Specific CleavageSitesAbstract:Bioactive peptides are fragments with specific amino acid sequences that exert a positive physiological influence on the body. Many reported Bioactive peptides are produced by enzymatic hydrolysis,but there are disadvantages of by-product and low yield.The choice of protease and protein source is a key step,and many factors such as local conformation,tertiary structure, experimental conditions and causal interference can influence the protease hydyolysis.This article presents the influencing fators,temperature,pH values,temperature combined pH values and metal ions included,to provide theoretical basis for enzymatic law analysis and higher yield bioactive peptides production.Key words:bioactive peptides;protease;hydrolysis conditions;protease cleavage sites1.前言生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽，是氨基酸以不同组成和排列方式构成的不同肽类的总称（氨基酸数目一般小于100）。
蛋白酶酶切位点
蛋白酶酶切位点蛋白酶的分类及作用位点蛋白酶分类作用位点已知抑制物,,氨基肽酶金属蛋白酶带有自由氨基的L-氨基酸氨基末端,22双吡啶,1,1()-菲咯啉不分解由X-Pro、D或Q组成的肽键菠萝蛋白酶巯基蛋白酶无特异性α2巨球蛋白,TPCK,TLCK,烷化羧肽酶A 锌金属蛋白酶带有自由氨基酸的L-氨基酸羧基端,EDTA,EGTA不能分解R、P或羟脯氨酸羧肽酶B 锌金属蛋白酶 K- Lys,R- Arg羧基端 EDTA,EGTA,碱性氨基酸羧肽酶Y 丝氨酸羧肽酶氨基酸羧基端 PMSF组织蛋白酶C 琉基蛋白酶氨基端双肽,可通过K,R或P氨基醋酸碘, 甲醛端作为第二或第三个氨基酸封闭胰凝乳蛋白酶丝氨酸蛋白酶在F- Phe,T- Thr或Y- Tyr之后抑肽酶,PMSF,TPCK,α-巨球蛋白胶原酶金属蛋白酶在P-X-G-P肽链中X之后EDTA,EGTA,还原剂,但无血清存在2+dispase 金属蛋白酶无特异性 EDTA,EGTA,Hg,重金属内肽酶Arg-C 丝氨酸蛋白酶在R- Arg之后α巨球蛋白,TLCK 内肽酶Asp-N 金属蛋白酶在D- Asp和C-Cys半胱氨酸之前EDTA,α菲咯啉内肽酶Glu-C 丝氨酸蛋白酶在E- Glu/Gln 或D- Asp之后α巨球蛋白,TLCK 内肽酶Lys-C 丝氨酸蛋白酶在K- Lys之后TLCK,抑肽酶,抑蛋白酶醛肽肠激酶丝氨酸蛋白酶在D-D-D-D-K-肽链中K之后Xa因子丝氨酸蛋白酶在R- Arg之后 PMSF,APMS,大豆胰蛋白酶抑制物无花果蛋白酶琉基蛋白酶无特异性TPCK,TLCK,α-巨球蛋白激肽释放酶丝氨酸蛋白酶在一些R- Arg之后抑肽酶,抑蛋白酶醛肽木瓜蛋白酶巯基蛋白酶长期孵育时具有广泛特异性arg、lys TPCK,TLCK,抑蛋白酶醛肽α—、gly、L-Citrulline 巨球蛋白,烷化剂胃蛋白酶酸蛋白酶广泛特异性phe、trp、tyr等疏水aa 胃蛋白酶抑制素纤溶酶丝氨酸蛋白酶在K- Lys或R- Arg之后 PMSF,TLCK,抑肽酶,α-巨球蛋白链霉蛋白酶混合型无特异性 B,M,完整药片蛋白酶K 丝氨酸蛋白酶广泛特异性 PMSF,PefablocSc 枯草杆菌蛋白酶丝氨酸蛋白酶无特异性PMSF,α巨球蛋白,苯甲脒热溶素锌金属蛋白酶在非极性残基之前 EDTA凝血酶丝氨酸蛋白酶在K- Lys之后 TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白,苯甲脒胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶在K- Lys或R -Arg之后arg、lys TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白蛋白酶分类作用位点已知抑制物木瓜蛋白酶巯基蛋白酶具有广泛特异性 TPCK,TLCK,抑蛋白酶醛肽α-巨球蛋白,烷化剂胃蛋白酶酸蛋白酶广泛特异性胃蛋白酶抑制素胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶在K或R之后 TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白人体20种氨基酸及其英文缩写1名称三字符号单字符号丙氨酸 Ala A精氨酸 Arg R天冬氨酸 Asp D半胱氨酸 Cys C谷氨酰胺 Gln Q谷氨酸 Glu/Gln E组氨酸 His H异亮氨酸 Ile I甘氨酸 Gly G天冬酰胺 Asn N亮氨酸 Leu L赖氨酸 Lys K甲硫氨酸 Met M苯丙氨酸 Phe F脯氨酸 Pro P丝氨酸 Ser S苏氨酸 Thr T色氨酸 Trp W酪氨酸 Tyr Y缬氨酸 Val V【生化】特异性蛋白酶的酶切位点胰蛋白酶arg、lys,得到以arg、lys为C末端残基的肽段。
酶的特异性(专一性)及影响酶活性的因素
酶的特异性（专一性）及影响酶活性的因素酶的特异性（专一性）及影响酶活性的因素实验目的1. 掌握检查酶特异性的方法和原理。
2. 了解温度对酶活性的影响。
3. 了解激活剂、抑制剂对酶活力的影响。
实验原理1. 酶的专一性酶是生物体中一种具有催化功能的特殊蛋白质（传统酶的概念），也常称为生物催化剂。
它与一般催化剂的最主要区别就是具有高度的特异性，即专一性。
根据各种酶对底物的选择程度不同，可分为绝对专一性、相对专一性、立体异构专一性，。
例如唾液淀粉酶属于相对专一性酶，它只能随机作用于淀粉链内部的a——1，4糖苷键，使其分子迅速断裂成较短的链，称为糊精，糊精分子量递减，淀粉——大分子糊精——中分子糊精——小分子糊精——简单分子糊精——麦芽糖和a——糊精（含a——1，6糖苷键的短链聚糖，平均分子量为8个残基）。
由于淀粉酶催化所形成的产物都是还原糖，故可用灵敏度较高的Benedict试剂检测和观察。
2.温度对酶促反应速度的影响酶的催化作用受温度的影响很大，与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度，通常温度每升高10℃，反应速度加快一倍左右。
另一方面酶是一种蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。
因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度反而逐渐下降，以至完全停止反应。
反应速度达到最大值时的温度称为酶作用的最适温度。
大多数动物酶的最适温度为37—40℃，植物酶的最适温度为50—60℃。
但一种酶的最适温度不是完全固定的，它与作用的时间称短有关，反应时间增长时，最适温度向数值较低的方向移动。
最适温度不是酶的特征性物理常数。
酶对温度的稳定性与其存在形式有关。
大多数酶在干燥的固体状态与比较稳定，能在室温下保存数月至一年，溶液中的酶，易被微生物污染，常难长期保存，在高温的情况与，如100℃即可失活。
低温降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。
3. 激活剂和抑制剂对酶活力的影响酶的活性常受某些物质的影响，有些物质能增加酶的活性，称为酶的激活剂；另一些物质则会降低酶的活性，称为酶的抑制剂。
酶的专一性实验报告
酶的专一性实验报告一、实验目的本实验旨在探究酶的专一性，即一种酶只能催化一种或一类化学反应的特性。
通过实验，观察酶对不同底物的作用情况，验证酶的专一性原理，并加深对酶的催化作用的理解。
二、实验原理酶是生物体内具有催化作用的蛋白质或 RNA 分子。
它们能够降低化学反应的活化能，从而加速反应的进行。
酶的专一性是指酶对底物具有严格的选择性，只作用于特定的底物，产生特定的产物。
本实验选用唾液淀粉酶作为研究对象，以淀粉和蔗糖为底物。
唾液淀粉酶能够催化淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，但不能催化蔗糖的水解。
通过检测反应产物的生成，可以判断酶的专一性。
三、实验材料与仪器1、材料新鲜唾液质量分数为 2%的淀粉溶液质量分数为 2%的蔗糖溶液斐林试剂（甲液：质量浓度为 01g/mL 的 NaOH 溶液；乙液：质量浓度为 005g/mL 的 CuSO4 溶液）热水浴装置2、仪器试管滴管量筒烧杯四、实验步骤1、制备唾液淀粉酶溶液漱口后，含一口清水，在口腔内保持 1-2 分钟，然后将唾液吐入小烧杯中备用。
2、分组与设置对照实验取 3 支洁净的试管，编号为 1、2、3。
向 1 号试管中加入 2mL 淀粉溶液，向 2 号试管中加入 2mL 蔗糖溶液，向 3 号试管中加入 1mL 淀粉溶液和 1mL 蔗糖溶液。
3、加入唾液淀粉酶溶液向 1 号和 2 号试管中分别加入 2mL 唾液淀粉酶溶液，轻轻振荡，使其混合均匀。
向 3 号试管中加入 2mL 唾液淀粉酶溶液，轻轻振荡。
4、反应一段时间将 3 支试管置于 37℃的温水浴中，保温 15 分钟。
5、检测反应产物取出试管，分别向 1、2、3 号试管中加入 2mL 斐林试剂，轻轻振荡，使其混合均匀。
将 3 支试管放入热水浴中加热 2-3 分钟，观察溶液颜色的变化。
五、实验结果与分析1、实验结果1 号试管中出现砖红色沉淀，说明淀粉被唾液淀粉酶水解产生了还原性糖（麦芽糖和葡萄糖）。
2 号试管中未出现砖红色沉淀，说明蔗糖未被唾液淀粉酶水解，没有产生还原性糖。
酶的专一性和影响酶作用的因素20130408
（二）温度对酶活性的影响
【操作步骤】
试管号 0.5%淀粉溶液(滴) pH6.8缓冲液(滴) 0.3%NaCI溶液(滴) 浴温5分钟 稀唾液（滴） 浴温5分钟
取试管3支，标号，按下表所列的次序操作：
1 10 3 3 100 ℃ 3 100 ℃
（一）酶作用的特异性
【操作步骤】
试管号 0.5%淀粉溶液(滴) 0.3%NaCI溶液(滴) 0.5%蔗糖溶液(滴) 稀唾液（滴） 蔗糖酶溶液（滴） 蒸馏水（滴） 1 16 3 16 取试管6支，标号，按下表所列的次序操作：
2 16 3 16 -
3 16 3 16
4 16 16 -
5
6
16 16 -
（一）酶作用的特异性
【操作步骤】
（2）制备蔗糖酶溶液。
取活性干酵母1.0g，置于研钵中，加少 量蒸馏水及石英砂研磨提取约5min，再 加蒸馏水至总体积约为20ml，过滤，取 滤液备用。
15
5
5
15
5
15 5
15 5
15 5
15 5
各管混匀后，同时置于37～40℃水浴中保温5分钟，加1滴碘 记录观察结果
（三）pH、激活剂、抑制剂 对酶活性的影响
1
2
3
4
5
6
7
（三）pH、激活剂、抑制剂 对酶活性的影响
1
2
3
4
5
6
7
思考题
1.什么是酶的特异性？本实验如何验证了酶的特异性？ 2.若将淀粉酶和蔗糖酶煮沸1min，其实验结果会发生什么 样的变化？ 3.唾液淀粉酶的最适温度是多少? 4.低温对酶有什么影响? 5.在第二个实验中，为什么以第3管作碘反应，观察颜色？有 何意义？ 6.在第二个实验中，为什么要作CuSO4、Na2SO4的对照实 验？
蛋白酶酶切位点
蛋白酶酶切位点木瓜蛋白酶疏基蛋白酶具有广泛特异性TPCKJLCK,抑矍白酶醛肽6巨球蛋白,烷化剂胃蛋白酶酸蛋白酶广泛特异性胃矍白酶抑制素胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶在K或R之后TLCXPMSF■抑蛋白酶醛肽抑肽酶Q巨球蛋白名称 三字符号单字符号Ala A Arg RGlu/GIn E His H lie I Gly G Asn NLeu L Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Vai胰蛋白酶lys,得到以mg 、lys 为C 末端残基的肽段。
胰凝乳蛋白酶phe 、trp. tyr 等疏水OQ 。
胃蛋白酶phe 、trp 、tyr 等疏水QQ 。
木瓜蛋白酶arg s lys o 葡萄球菌堂白 酶，磷酸缓冲液Ph7.8时断裂glu 、aspo 碳酸氢钱缓冲液ph7.8或醋酸钱缓冲液ph4.0 时断裂glu 。
梭菌蛋白酶org,用于不溶性蛋白的长时间裂解。
CNBr 断裂Met 。
羟胺断 裂asn —gly 间的肽键。
二硫键可以用铳基化合物还原法或者过甲酸氧化法断裂・。
o 木瓜蛋白酶是番木瓜(Carieapapaya)中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存 在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰冨。
木瓜蛋白酶的活性 中心含半胱氨酸，属于蔬基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因 此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用。
木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，分子量为23406,由一种单肽链组成，含有212个氨基酸 残基。
至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His 159和 Aspl5&另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键，旦都不在活性部位。
纯木瓜蛋白酶制品 可含有：(1)木瓜蛋白酶，分子S 21000,约占可溶性蛋白质的10%; (2)木瓜凝乳蛋 白酶，分子量26000,约占可溶性愛白质的45%; (3)溶菌酶,分子fi 25000,约占可溶 性蛋白质的20%;及纤维素酶等不同的酶。
酶的专一性名词解释生物化学
酶的专一性名词解释生物化学酶的专一性在生物化学中是指酶对于底物的选择性。
酶是一类蛋白质，在许多生物化学反应中起到了关键作用。
酶通过特定的结构和功能来催化化学反应，但它们并不对所有的底物都具有相同的催化能力。
酶的专一性是由酶的结构和亲合性所决定的。
在生物化学反应中，酶通过与底物结合形成酶底物复合物来催化反应。
然而，不同的酶对于底物的结构有不同的偏好。
这是因为酶的活性部位具有特定的结构和氨基酸残基组成，只有与底物相匹配的结构才能与活性部位结合。
酶的专一性在生物体内起到了至关重要的作用。
生物体内有许多不同的底物需要被催化，但每种底物都有自己的特定的酶来完成催化反应。
这种专一性保证了生物体内化学反应的准确性和高效性。
如果没有酶的专一性，不同的反应可能会相互干扰或竞争，导致生物化学反应的混乱。
酶的专一性可以体现在两个方面：底物选择性和催化反应选择性。
底物选择性是指酶对于特定底物的亲合性和结合能力。
酶只能与特定底物结合形成酶底物复合物，其他底物则不能被酶催化。
这种底物选择性是由酶活性部位的结构所决定的。
酶的活性部位具有一定的空间要求和化学性质，只有与底物相匹配的结构才能与活性部位结合，从而进行催化反应。
这种底物选择性保证了酶只催化特定的底物，而不会对其他底物产生影响。
除了底物选择性，酶还具有催化反应选择性。
催化反应选择性是指酶对于特定类型的反应的亲合性和催化能力。
酶的活性部位具有特定的结构和功能，只能催化特定类型的反应。
例如，氧化还原酶可以催化氧化还原反应，水解酶可以催化水解反应，合成酶可以催化合成反应等。
每种酶都有其特定的催化反应选择性，这种选择性确保了生物体内各种化学反应的有序进行。
酶的专一性在生物体内的调控非常重要。
生物体内的酶通过调控其产生量和活性来实现对底物的选择性。
在细胞内，酶的合成和活性会受到多种因素的调节，例如基因表达、环境因子和调控蛋白等。
通过调控酶的产生量和活性，生物体可以调节化学反应的速率和方向，从而适应不同的生理需求。
蛋白酶的分类及酶切位点
蛋白酶的分类及酶切位点氨基酸0.ppt氨基酸的名称与符号alanine 丙氨酸Ala Aarginine 精氨酸Arg Rasparagine 天冬酰氨Asn Asx Naspartic acid 天冬氨酸Asp Asx Dcysteine 半胱氨酸Cys Cglutamine 谷氨酰胺Gln Glx Qglutamic acid 谷氨酸Glu Glx Eglycine 甘氨酸Gly Ghistidine 组氨酸His Hisoleucine 异亮氨酸Ile Ileucine 亮氨酸Leu Llysine 赖氨酸Lys Kmethionine 甲硫氨酸Met Mphenylalanine 苯丙氨酸Phe Fproline 脯氨酸Pro Pserine 丝氨酸Ser Sthreonine 苏氨酸Thr Ttryptophan 色氨酸Trp Wtyrosine 酪氨酸Tyr Yvaline 缬氨酸Val V血清终止胰酶消化的原理血清终止的原理其实是竞争抑制。
就是用过量的牛血清中含有的蛋白来和胰酶结合。
不给胰酶消化细胞蛋白的机会。
细胞传代时，血清为什么能终止胰酶消化？胰蛋白酶的酶切位点是肽链的Lys和Arg两个残疾的羧基端肽键，血清的加入可使酶饱和，严格上说不是竞争性抑制，因为血清蛋白不是抑制剂，还是底物！什么样的细胞不能用胰酶-EDTA消化植物细胞不能用胰酶-EDTA消化，要用纤维素酶消化。
应该是肿瘤细胞吧。
正常的细胞，貌似都需要用胰酶或者胶原酶消化。
EDTA-胰酶，只不过是在胰酶里加入了EDTA而已。
EDTA是乙二胺四乙酸，一种金属螯合剂。
一般和胰蛋白酶配合使用。
原因在于，钙，镁等金属离子会降低胰酶活力，故在使用胰酶消化液时要配合加入EDTA。
它可以螯合这些离子，消除对胰酶的抑制。
干细胞饲养层制作中，胰酶—EDTA消化成纤维细胞（MEF）时，EDTA的作用是什么？应该是胰酶分散细胞，EDTA鳌合金属离子使金属酶失活《军医进修学院学报》1992年02期加入收藏投稿正常人血浆蛋白酶解产物对胃癌细胞肺转移抑制作用的研究焦顺昌赵东海黄昌霞王洪海【摘要】：本文采用胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶联合消化方法得到正常人血浆(NHP)有限蛋白酶解产物(NHP-EP)。
蛋白酶酶切位点
蛋白酶酶切位点蛋白酶的分类及作用位点蛋白酶分类作用位点已知抑制物,,氨基肽酶金属蛋白酶带有自由氨基的L-氨基酸氨基末端,22双吡啶,1,1()-菲咯啉不分解由X-Pro、D或Q组成的肽键菠萝蛋白酶巯基蛋白酶无特异性α2巨球蛋白,TPCK,TLCK,烷化羧肽酶A 锌金属蛋白酶带有自由氨基酸的L-氨基酸羧基端,EDTA,EGTA不能分解R、P或羟脯氨酸羧肽酶B 锌金属蛋白酶 K- Lys,R- Arg羧基端 EDTA,EGTA,碱性氨基酸羧肽酶Y 丝氨酸羧肽酶氨基酸羧基端 PMSF组织蛋白酶C 琉基蛋白酶氨基端双肽,可通过K,R或P氨基醋酸碘, 甲醛端作为第二或第三个氨基酸封闭胰凝乳蛋白酶丝氨酸蛋白酶在F- Phe,T- Thr或Y- Tyr之后抑肽酶,PMSF,TPCK,α-巨球蛋白胶原酶金属蛋白酶在P-X-G-P肽链中X之后EDTA,EGTA,还原剂,但无血清存在2+dispase 金属蛋白酶无特异性 EDTA,EGTA,Hg,重金属内肽酶Arg-C 丝氨酸蛋白酶在R- Arg之后α巨球蛋白,TLCK 内肽酶Asp-N 金属蛋白酶在D- Asp和C-Cys半胱氨酸之前EDTA,α菲咯啉内肽酶Glu-C 丝氨酸蛋白酶在E- Glu/Gln 或D- Asp之后α巨球蛋白,TLCK 内肽酶Lys-C 丝氨酸蛋白酶在K- Lys之后TLCK,抑肽酶,抑蛋白酶醛肽肠激酶丝氨酸蛋白酶在D-D-D-D-K-肽链中K之后Xa因子丝氨酸蛋白酶在R- Arg之后 PMSF,APMS,大豆胰蛋白酶抑制物无花果蛋白酶琉基蛋白酶无特异性TPCK,TLCK,α-巨球蛋白激肽释放酶丝氨酸蛋白酶在一些R- Arg之后抑肽酶,抑蛋白酶醛肽木瓜蛋白酶巯基蛋白酶长期孵育时具有广泛特异性arg、lys TPCK,TLCK,抑蛋白酶醛肽α—、gly、L-Citrulline 巨球蛋白,烷化剂胃蛋白酶酸蛋白酶广泛特异性phe、trp、tyr等疏水aa 胃蛋白酶抑制素纤溶酶丝氨酸蛋白酶在K- Lys或R- Arg之后 PMSF,TLCK,抑肽酶,α-巨球蛋白链霉蛋白酶混合型无特异性 B,M,完整药片蛋白酶K 丝氨酸蛋白酶广泛特异性 PMSF,PefablocSc 枯草杆菌蛋白酶丝氨酸蛋白酶无特异性PMSF,α巨球蛋白,苯甲脒热溶素锌金属蛋白酶在非极性残基之前 EDTA凝血酶丝氨酸蛋白酶在K- Lys之后 TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白,苯甲脒胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶在K- Lys或R -Arg之后arg、lys TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白蛋白酶分类作用位点已知抑制物木瓜蛋白酶巯基蛋白酶具有广泛特异性 TPCK,TLCK,抑蛋白酶醛肽α-巨球蛋白,烷化剂胃蛋白酶酸蛋白酶广泛特异性胃蛋白酶抑制素胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶在K或R之后 TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白人体20种氨基酸及其英文缩写1名称三字符号单字符号丙氨酸 Ala A精氨酸 Arg R天冬氨酸 Asp D半胱氨酸 Cys C谷氨酰胺 Gln Q谷氨酸 Glu/Gln E组氨酸 His H异亮氨酸 Ile I甘氨酸 Gly G天冬酰胺 Asn N亮氨酸 Leu L赖氨酸 Lys K甲硫氨酸 Met M苯丙氨酸 Phe F脯氨酸 Pro P丝氨酸 Ser S苏氨酸 Thr T色氨酸 Trp W酪氨酸 Tyr Y缬氨酸 Val V【生化】特异性蛋白酶的酶切位点胰蛋白酶arg、lys,得到以arg、lys为C末端残基的肽段。
蛋白酶酶切位点
蛋白酶酶切位点蛋白酶的分类及作用位点蛋白酶分类作用位点已知抑制物,,氨基肽酶金属蛋白酶带有自由氨基的L-氨基酸氨基末端,22双吡啶,1,1()-菲咯啉不分解由X-Pro、D或Q组成的肽键菠萝蛋白酶巯基蛋白酶无特异性α2巨球蛋白,TPCK,TLCK,烷化羧肽酶A 锌金属蛋白酶带有自由氨基酸的L-氨基酸羧基端,EDTA,EGTA不能分解R、P或羟脯氨酸羧肽酶B 锌金属蛋白酶 K- Lys,R- Arg羧基端 EDTA,EGTA,碱性氨基酸羧肽酶Y 丝氨酸羧肽酶氨基酸羧基端 PMSF组织蛋白酶C 琉基蛋白酶氨基端双肽,可通过K,R或P氨基醋酸碘, 甲醛端作为第二或第三个氨基酸封闭胰凝乳蛋白酶丝氨酸蛋白酶在F- Phe,T- Thr或Y- Tyr之后抑肽酶,PMSF,TPCK,α-巨球蛋白胶原酶金属蛋白酶在P-X-G-P肽链中X之后EDTA,EGTA,还原剂,但无血清存在2+dispase 金属蛋白酶无特异性 EDTA,EGTA,Hg,重金属内肽酶Arg-C 丝氨酸蛋白酶在R- Arg之后α巨球蛋白,TLCK 内肽酶Asp-N 金属蛋白酶在D- Asp和C-Cys半胱氨酸之前EDTA,α菲咯啉内肽酶Glu-C 丝氨酸蛋白酶在E- Glu/Gln 或D- Asp之后α巨球蛋白,TLCK 内肽酶Lys-C 丝氨酸蛋白酶在K- Lys之后TLCK,抑肽酶,抑蛋白酶醛肽肠激酶丝氨酸蛋白酶在D-D-D-D-K-肽链中K之后Xa因子丝氨酸蛋白酶在R- Arg之后 PMSF,APMS,大豆胰蛋白酶抑制物无花果蛋白酶琉基蛋白酶无特异性TPCK,TLCK,α-巨球蛋白激肽释放酶丝氨酸蛋白酶在一些R- Arg之后抑肽酶,抑蛋白酶醛肽木瓜蛋白酶巯基蛋白酶长期孵育时具有广泛特异性arg、lys TPCK,TLCK,抑蛋白酶醛肽α—、gly、L-Citrulline 巨球蛋白,烷化剂胃蛋白酶酸蛋白酶广泛特异性phe、trp、tyr等疏水aa 胃蛋白酶抑制素纤溶酶丝氨酸蛋白酶在K- Lys或R- Arg之后 PMSF,TLCK,抑肽酶,α-巨球蛋白链霉蛋白酶混合型无特异性 B,M,完整药片蛋白酶K 丝氨酸蛋白酶广泛特异性 PMSF,PefablocSc 枯草杆菌蛋白酶丝氨酸蛋白酶无特异性PMSF,α巨球蛋白,苯甲脒热溶素锌金属蛋白酶在非极性残基之前 EDTA凝血酶丝氨酸蛋白酶在K- Lys之后 TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白,苯甲脒胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶在K- Lys或R -Arg之后arg、lys TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白蛋白酶分类作用位点已知抑制物木瓜蛋白酶巯基蛋白酶具有广泛特异性 TPCK,TLCK,抑蛋白酶醛肽α-巨球蛋白,烷化剂胃蛋白酶酸蛋白酶广泛特异性胃蛋白酶抑制素胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶在K或R之后 TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白人体20种氨基酸及其英文缩写1名称三字符号单字符号丙氨酸 Ala A精氨酸 Arg R天冬氨酸 Asp D半胱氨酸 Cys C谷氨酰胺 Gln Q谷氨酸 Glu/Gln E组氨酸 His H异亮氨酸 Ile I甘氨酸 Gly G天冬酰胺 Asn N亮氨酸 Leu L赖氨酸 Lys K甲硫氨酸 Met M苯丙氨酸 Phe F脯氨酸 Pro P丝氨酸 Ser S苏氨酸 Thr T色氨酸 Trp W酪氨酸 Tyr Y缬氨酸 Val V【生化】特异性蛋白酶的酶切位点胰蛋白酶arg、lys,得到以arg、lys为C末端残基的肽段。
3c蛋白酶酶切位点
3c蛋白酶酶切位点
1. 什么是3C蛋白酶？
3C蛋白酶是一种重要的酶，属于半胱氨酸蛋白酶家族，能够特异性地水解多种蛋白质。
它在许多生物学过程中都起着重要的作用，如病毒复制、细胞凋亡、细胞周期调控等。
2. 3C蛋白酶的酶切位点有哪些？
3C蛋白酶的酶切位点为“Q-G/S-X-X-D/E”，其中Q表示谷氨酰氨基酸，G/S表示甘氨酰氨基酸或丝氨酰氨基酸，X表示任意氨基酸，D/E表示天冬氨酸或谷氨酸。
在这个位点上，3C蛋白酶能够特异性地水解蛋白质，从而发挥其生物学功能。
3. 3C蛋白酶酶切位点的应用
由于3C蛋白酶能够特异性地水解蛋白质，因此它被广泛应用于生物学研究中。
例如，在病毒复制研究中，研究人员常常使用3C蛋白酶来裂解病毒蛋白，以便研究病毒复制的机制。
此外，在蛋白质相互作用研究中，研究人员也常常使用3C蛋白酶来切割蛋白质，以便研究蛋白质相互作用的机制。
4. 3C蛋白酶酶切位点的注意事项
在使用3C蛋白酶进行酶切时，需要注意以下几点。
首先，酶切位点需要严格控制，以免对目标蛋白产生不必要的影响。
其次，酶切时间和温度也需要严格控制，以免过度水解或过度热失活。
最后，需要注意酶切产物的纯度和活性，以便后续实验的进行。
5. 结论
3C蛋白酶是一种重要的酶，在生物学研究中有着广泛的应用。
其酶切位点为“Q-G/S-X-X-D/E”，需要严格控制酶切条件和产物的纯度和活性。
酶切常见问题
限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法，个人觉得总结得很好，特转贴供本供大家分享。
酶切出现问题，先看内切酶说明书，相应试剂公司目录。
不同公司出产的内切酶，菌株来源、制备工艺、纯度活力、酶切活性优化可能不同，酶切效果也有差别。
可在上面找到酶单位定义、保存条件、酶切体系[buffer及与其它酶双切的buffer等]、酶切反应温度[有些酶是在50、55或30等温度下反应的]、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活可能因素、保护性碱基，同尾酶、同裂酶等等。
1. 酶切不开或不完全1.1 质粒问题纯度差或残留酶切抑制物最为常见。
杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、盐、乙醇等。
[重新提DNA，使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂]1.2 酶的问题：确认内切酶有效 [很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可用。
确认酶切效果不好，做标记，更换] 。
【题外话：用内切酶注意】a. 内切酶如无特殊要求，保存-20~-30度。
并非越低越好，酶通常是保存在50％甘油缓冲液中，温度过低时，酶会发生冻结（运输过程例外，由于酶需要低温运输，所以方便的情况下是使用干冰，酶会冻结，但冻结次数有限，相对是一种比较好的选择），如果是经常使用的话，酶会被反复冻融，从而降低了活性。
当然如果温度过高，呵呵，你就自己想去吧。
b. 酶在使用时应置于冰盒中取酶。
这点大家都清楚，不过多强调也没坏处。
因为实验室有些同学，酶取出后是放在冰盒上的，但有两点忽略了：拿酶的时候，手不是抓着管子上端，而握在管子的底部，相当于用手在给酶进行加热；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的时候，还是将酶拿出来。
偶尔一次没有大碍，反复如此，可能会影响酶活。
c. 酶使用完后应尽快旋紧盖子。
有时我们可以发现，即使是-20~-30度放置，酶仍然会冻结。
个人认为的可能原因是由于在配置酶切反应时，酶管的盖子在较长时间的开着，甘油会吸取空气中的水分，对于常用的大包装的酶有时就会出现冻结现象。
蛋白酶酶切位点
蛋白酶酶切位点蛋白酶的分类及作用位点蛋白酶分类作用位点已知抑制物,,氨基肽酶金属蛋白酶带有自由氨基的L-氨基酸氨基末端,22双吡啶,1,1()-菲咯啉不分解由X-Pro、D或Q组成的肽键菠萝蛋白酶巯基蛋白酶无特异性α2巨球蛋白,TPCK,TLCK,烷化羧肽酶A 锌金属蛋白酶带有自由氨基酸的L-氨基酸羧基端,EDTA,EGTA不能分解R、P或羟脯氨酸羧肽酶B 锌金属蛋白酶 K- Lys,R- Arg羧基端 EDTA,EGTA,碱性氨基酸羧肽酶Y 丝氨酸羧肽酶氨基酸羧基端 PMSF组织蛋白酶C 琉基蛋白酶氨基端双肽,可通过K,R或P氨基醋酸碘, 甲醛端作为第二或第三个氨基酸封闭胰凝乳蛋白酶丝氨酸蛋白酶在F- Phe,T- Thr或Y- Tyr之后抑肽酶,PMSF,TPCK,α-巨球蛋白胶原酶金属蛋白酶在P-X-G-P肽链中X之后EDTA,EGTA,还原剂,但无血清存在2+dispase 金属蛋白酶无特异性 EDTA,EGTA,Hg,重金属内肽酶Arg-C 丝氨酸蛋白酶在R- Arg之后α巨球蛋白,TLCK 内肽酶Asp-N 金属蛋白酶在D- Asp和C-Cys半胱氨酸之前EDTA,α菲咯啉内肽酶Glu-C 丝氨酸蛋白酶在E- Glu/Gln 或D- Asp之后α巨球蛋白,TLCK 内肽酶Lys-C 丝氨酸蛋白酶在K- Lys之后TLCK,抑肽酶,抑蛋白酶醛肽肠激酶丝氨酸蛋白酶在D-D-D-D-K-肽链中K之后Xa因子丝氨酸蛋白酶在R- Arg之后 PMSF,APMS,大豆胰蛋白酶抑制物无花果蛋白酶琉基蛋白酶无特异性TPCK,TLCK,α-巨球蛋白激肽释放酶丝氨酸蛋白酶在一些R- Arg之后抑肽酶,抑蛋白酶醛肽木瓜蛋白酶巯基蛋白酶长期孵育时具有广泛特异性arg、lys TPCK,TLCK,抑蛋白酶醛肽α—、gly、L-Citrulline 巨球蛋白,烷化剂胃蛋白酶酸蛋白酶广泛特异性phe、trp、tyr等疏水aa 胃蛋白酶抑制素纤溶酶丝氨酸蛋白酶在K- Lys或R- Arg之后 PMSF,TLCK,抑肽酶,α-巨球蛋白链霉蛋白酶混合型无特异性 B,M,完整药片蛋白酶K 丝氨酸蛋白酶广泛特异性 PMSF,PefablocSc 枯草杆菌蛋白酶丝氨酸蛋白酶无特异性PMSF,α巨球蛋白,苯甲脒热溶素锌金属蛋白酶在非极性残基之前 EDTA凝血酶丝氨酸蛋白酶在K- Lys之后 TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白,苯甲脒胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶在K- Lys或R -Arg之后arg、lys TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白蛋白酶分类作用位点已知抑制物木瓜蛋白酶巯基蛋白酶具有广泛特异性 TPCK,TLCK,抑蛋白酶醛肽α-巨球蛋白,烷化剂胃蛋白酶酸蛋白酶广泛特异性胃蛋白酶抑制素胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶在K或R之后 TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白人体20种氨基酸及其英文缩写1名称三字符号单字符号丙氨酸 Ala A精氨酸 Arg R天冬氨酸 Asp D半胱氨酸 Cys C谷氨酰胺 Gln Q谷氨酸 Glu/Gln E组氨酸 His H异亮氨酸 Ile I甘氨酸 Gly G天冬酰胺 Asn N亮氨酸 Leu L赖氨酸 Lys K甲硫氨酸 Met M苯丙氨酸 Phe F脯氨酸 Pro P丝氨酸 Ser S苏氨酸 Thr T色氨酸 Trp W酪氨酸 Tyr Y缬氨酸 Val V【生化】特异性蛋白酶的酶切位点胰蛋白酶arg、lys,得到以arg、lys为C末端残基的肽段。
13 生物化学实验--酶的专一性及影响酶活性的因素
酶的专一性及影响酶活性的因素【目的】1 ．掌握验证酶的专一性及温度、 pH 、激动剂和抑制剂对酶活性影响的实验方法。
2 ．熟悉验证酶的专一性及温度、 pH 、激动剂和抑制剂对酶活性影响的实验原理。
3 ．了解实验设计的对照原则。
【原理】唾液淀粉酶只能催化淀粉水解，最终产物为麦芽糖，而不能催化其它糖如纤维素和蔗糖等水解。
蔗糖与淀粉均无还原性，与班氏试剂呈阴性反应，而麦芽糖和蔗糖的水解产物葡萄糖和果糖皆可与班氏试剂呈阳性反应，即在一定条件下使二价铜还原为一价铜生成砖红色沉淀。
淀粉水解程度不同，遇碘呈色反应不同，因此可以通过呈色反应了解淀粉水解的程度，从而判断唾液淀粉酶活力的大小。
淀粉水解及遇碘呈色反应如下：【器材】1 ．恒温水浴2 ．电炉3 ．烧杯4 ．微量移液器5 ．试管6 ．漏斗7 ．量筒8 ．容量瓶9 ．冰浴【试剂】1 ． 1% 淀粉溶液2 ． 1% 蔗糖溶液3 ． 1% 氯化钠溶液4 ． 1% 硫酸铜溶液5 ． 1% 硫酸钠溶液6 ． 1 ∶ 10 稀释的新鲜唾液把铺适量棉花的漏斗放在小量筒上，收集过滤的唾液 2ml ，再用蒸馏水稀释唾液到 20ml 混匀备用。
7 ．班氏（ Benedict ）试剂称取柠檬酸钠 173g 及无水碳酸钠 100g 溶于 700 ml 蒸馏水中，加热促溶，冷却后慢慢倾入 17.3% 硫酸铜溶液 100ml ，边加边摇，再加蒸馏水至 1000ml ，混匀。
如混浊可过滤取滤液备用，此试剂可长期保存。
8 ． I-KI 溶液将碘 10g 及碘化钾 20g 溶于 100ml 蒸馏水中为贮存液，使用前稀释 10 倍。
9 ．不同 pH 缓冲液取 28.40g Na 2 HPO 4 溶于少量蒸馏水，移入 1 000ml 容量瓶内，稀释至刻度为 A 液；取 21.01g 柠檬酸溶于少量蒸馏水中，移入 1 000ml 容量瓶内，稀释至刻度为 B 液。
按下表分别吸取一定量的 A 液和 B 液，配置出所需的不同 pH 缓冲液。
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蛋白酶专一性酶切位点的影响因素分析摘要：生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽。
酶法水解蛋白质广泛用于制备生物活性肽，但酶解法存在目标肽得率低、副产物过多的缺点。
蛋白酶和蛋白质的选择是关键步骤，局部构象、三维结构、实验条件以及其它偶然因素也会影响蛋白水解酶的酶切效果。
本文综述了温度、pH值、温度和pH值共同作用、金属离子对酶切位点的影响，旨在为研究酶切规律、制备高得率活性肽提供理论基础。
关键词：生物活性肽；蛋白酶；水解条件；酶切位点Influencing Factors Analysis of Protease SpecificCleavage SitesAbstract:Bioactive peptides are fragments with specific amino acid sequences that exert a positive physiological influence on the body. Many reported Bioactive peptides are produced by enzymatic hydrolysis,but there are disadvantages of by-product and low yield.The choice of protease and protein source is a key step,and many factors such as local conformation,tertiary structure, experimental conditions and causal interference can influence the protease hydyolysis.This article presents the influencing fators,temperature,pH values,temperature combined pH values and metal ions included,to provide theoretical basis for enzymatic law analysis and higher yield bioactive peptides production.Key words:bioactive peptides;protease;hydrolysis conditions;protease cleavage sites1.前言生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽，是氨基酸以不同组成和排列方式构成的不同肽类的总称（氨基酸数目一般小于100）。
生物活性肽有的是天然存在的，如谷胱甘肽、催产素、加压素、舒缓激肽、部分抗菌肽等，有的生物活性肽是以非活性的状态存在于某些蛋白质中，当用特定的蛋白酶水解后被释放出来，才成为有特定生理活性的肽。
同种蛋白质经不同的蛋白酶酶解后，可以产生具有不同氨基酸序列、不同生理功能的生物活性肽，如大豆蛋白、卵清白蛋白、牛乳蛋白、酪蛋白经不同的蛋白酶酶解可以产生具有降血压、抗氧化、防病、祛病、增强人体免疫力、促消化吸收等不同生理作用的肽[1]。
由于生物活性肽在药物、保健品等领域具有广阔的应用前景，因此对生物活性肽的研究与开发具有重要意义。
2.生物活性肽的制备为了研究生物活性肽的结构与功能，开发相关药物或保健品等，需大量制备生物活性肽。
目前，获得生物活性肽的主要途径有以下3种：①直接分离提取；②化学合成或重组DNA技术；③体外水解蛋白质[1]。
天然生物活性肽分布很广泛，目前已经从动物、植物、微生物及部分海洋生物中直接分离出多种生物活性肽。
天然生物活性肽通常具有高效、低毒、无污染等特点[2]。
化学合成法有固相与液相两种方式，其基本原理几乎一样。
化学合成法发展较早，也比较成熟。
重组DNA法一旦建立好系统，就可以大量地重复性生产所要的活性肽。
然而，这些制备方法存在一定的局限性。
生物活性肽在生物体内的含量一般是微量的，如谷胱甘肽、催产素等，而且目前从天然生物体中分离纯化获得活性肽的工艺还不是很完善。
化学法合成仍有许多缺点，包括①消旋化现象；②侧链官能团需要保护；③整体效率低；④使用大量的有毒溶剂，且成本高昂。
因此化学合成法多半用在实验室，或是高价肽的生产上。
重组DNA技术在基因的表达与产品回收上仍有问题，同时该法生产的活性肽种类也有限制，不能生产酰胺肽，也不适合制备短链肽[3]。
酶法水解由于反应较温和、对蛋白质营养价值破坏小、使用的试剂毒性较低、反应具有空间立体性、产物没有消旋化现象、反应位点具有方向性、无异味等优越性，在现阶段被广泛用于制备生物活性肽。
生物活性肽具有促进矿物质吸收、抑制细菌、抗高血压、抗氧化、抗疲劳、神经调节、免疫调节等生理活性，而这些功能是原蛋白质或其组成氨基酸不具备的，且许多活性肽的组成氨基酸不一定是必需氨基酸，选择合适蛋白酶水解把其有生物活性肽链片段释放出来，从而制备出具有各种各样生理功能的生物活性肽。
这就为更充分的利用蛋白质资源，特别是为那些原本认为生物效价不高的蛋白质资源提供了新的机遇[4]。
迄今，获得生物活性肽的大量研究主要集中在蛋白质水解酶和蛋白质的筛选以及酶解条件的优化上，通过改善水解工艺，进一步提高生物活性肽得率。
随着生物信息学的发展及生物活性肽研究的不断深入，越来越多的蛋白质一级结构及活性肽的氨基酸序列得到阐明，免疫学的发展使得蛋白酶的酶切位点也越来越明确，这为从原料蛋白质中寻找已知氨基酸组成序列的生物活性肽提供了基础。
研究表明，具有特定生物活性的肽具有相似的结构特征，而其活性与肽的理化性质相关。
因此，根据活性肽的氨基酸组成结构信息和不同蛋白酶的水解位点特异性可以利用计算机使用特定酶模拟定向的释放活性肽，如黎观红等（2003）利用Access数据库软件建立了一个生物活性肽数据库，利用自编程序可用来寻找蛋白质中潜在的生物活性肽从该蛋白质中释放出来的适宜的酶。
陈征松等（2007）建立了活性肽搜寻与蛋白模拟水解数据库，实现了蛋白质用单酶或者复酶的模拟水解。
Vanessa Vermeirssen等（2004）建立蛋白质数据库并进行了实验，取得初步成果。
但酶法制备活性肽过程中一个具有挑战性的问题是，在蛋白质酶切过程中，会出现漏切位点和非专一性酶切位点，最终无法保证绝对把蛋白质酶切为常规的肽段，造成许多不必要的产物生成。
这是利用蛋白酶催化合成活性肽最明显的副作用。
对于常用的酶解来说，局部构象、三维结构、实验条件、酶切位点附近的其它氨基酸以及其它偶然因素都会影响蛋白水解酶的酶切效果[5]。
因此，研究蛋白质的酶切位点的影响因素，分析蛋白质的酶切规律，对制备高纯度、高产率的目标活性肽以及进一步研究其活性与结构的关系，具有重要意义。
3.蛋白酶和蛋白质的选择蛋白酶的选择是酶法制备活性肽的关键步骤。
在酶的筛选过程中，应以原料蛋白的组成和酶的专一性为参考，也可根据目标活性肽的结构特点进行选择或通过酶工程来生产特定酶[6]。
根据水解方式不同可将目前常用蛋白酶分为以下2类[7]：（1）内切酶：作用于蛋白质分子内部肽键。
包括动物蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等；植物蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等；以及微生物来源蛋白酶，如丹麦Novo公司生产的碱性蛋白酶Alcalase、复合蛋白酶Protamex、中性蛋白酶Neutrase等。
（2）外切酶：作用于蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键，生成游离氨基酸，其中作用于氨基末端的称为氨肽酶，作用于羧基末端的称为羧肽酶。
外切酶的一个重要特性就是能够把处于肽链末端的疏水性氨基酸水解出来，降低多肽的苦味。
常见的一些蛋白酶及其作用位点见表1。
表1常见蛋白酶的作用位点种类来源最适pH 作用位点胃蛋白酶胃黏膜2~3 Phe-，Leu-胰蛋白酶胰脏7~9 Arg-，Lys-胰凝乳蛋白酶胰脏 3.7 Tyr-，Trp-，Phe-，Leu- 木瓜蛋白酶木瓜果实5~7 Arg-，Lys-，Phe-X菠萝蛋白酶菠萝果实5~7.5 Lys-，Ala-，Tyr-，Gly-碱性蛋白酶Carlsber 枯草杆菌6.5~8.5Ala-，Leu-，Val-，Tyr-，Phe-，Try-许多动物蛋白和植物蛋白都可作为的来源。
部分活性肽来自乳蛋白、酪蛋白、乳清、鸡蛋和肌肉蛋白质等动物蛋白质。
此外，海洋生物如鱼、鲑鱼、牡蛎、大型藻类、鱿鱼、海胆、虾、雪螃蟹、海马也可作为活性肽的蛋白质源。
植物蛋白质常用的包括大豆、豆类（扁豆、鹰嘴豆、豌豆和豆类）、燕麦、小麦、火麻仁、油菜和亚麻籽。
目前，选择用于制备活性肽的蛋白质应该基于2个标准[8]：（1）使用未充分利用能够进一步增值且蛋白质含量丰富的食品工业副产物；（2）含有特定氨基酸序列或特定药理氨基酸残基的蛋白质。
蛋白质的合理选择，对提高目标肽的产率至关重要。
4.酶切位点的影响因素分析4.1.温度对酶切位点的影响4.1.1.对专一性酶切位点的影响一般情况下，蛋白酶在最适温度时酶切速率最大，偏离最适温度时活性降低。
温度变化影响蛋白质的空间结构，从而影响了其对蛋白酶的亲和力。
例如温度升高时，蛋白质底物中更多的酶切位点暴露出来，酶切更容易进行。
研究发现，随着温度升高，蛋白质中更多的专一性酶切位点被水解，水解范围更广泛。
Seronei Chelulei Cheison等（2011）使用MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）分析了温度变化（25℃、37.5℃、和50℃）结合不同的碱性pH值（7.8、8.65、9.5）对胰蛋白酶水解β-乳球蛋白模式的影响[9]。
一般情况下，胰蛋白酶为肽链内切酶，水解赖氨酸或精氨酸的羧基与其它氨基酸（脯氨酸除外）形成的肽键。
结果发现，随着温度升高，更多的赖氨酸残基和精氨酸残基被水解。
在pH7.8和50℃的条件下水解10分钟之后，所有可能的专一性酶切位点都被水解。
因为脯氨酸能影响蛋白酶水解肽键，所以Lys47-Pro48未被水解。
在25℃，只有β-乳球蛋白的末端区域被酶解，然而，随着温度升高，β-乳球蛋白中心区域也开始被水解。
Blanca Hern´andez-Ledesma（2006）将牛的β-乳球蛋白A（β-Lg A）在非变性和变性加热条件下用嗜热菌蛋白酶水解，用HPLC-MS/MS确定水解过程中释放的肽段[10]。
一般情况下，嗜热菌蛋白酶水解疏水性或芳香族氨基酸的氨基端肽键，例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在37℃反应5分钟后，总共确定了水解产物中的25个肽段，这些肽段一直到更高的保温温度时才进一步水解。