Westernblot基本操作步骤

W e s t e r n b l o t基本操作步骤

一、细胞蛋白的提取

弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。

二、BCA法测蛋白浓度操作步骤

将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。

完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。

据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。

将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。

加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。

各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。

测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。

三、Western blot基本操作步骤

1、溶液配制：

①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L；

②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L；

③TBST缓冲液

1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。

TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L

TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。

④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解）

2、样品准备与加样

①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。

②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子；

③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。

3、电泳

将电泳装置与电源连接。调节电压为100-200V，电泳50min，直至溴酚兰接近分离胶的底部，然后关闭电源并撤去连接的导线。

拆除电泳装置：先倒掉电泳缓冲液，连同槽一起将凝胶夹层取出，小心的撬起凝胶外层塑料板，使凝胶暴露出来，切去浓缩胶以及无蛋白样品的凝胶部分（将胶留在短的一面塑料板上）。

4、转膜（湿转）

①将转膜液（1× Transfer Buffer）放于大饭盒内，泡4片海绵，剪4片滤纸、1片PVDF 膜，PVDF膜于甲醇中活化30s，取出置于转膜液中；

②按照2层海绵+2层滤纸+胶+膜+2层滤纸+5层海绵（填满）的顺序组装转膜装置，注意组装此装置时一定要保证滤纸、膜、凝胶精确对齐并不留气泡；

③将组装好的装置放入电转槽，合上盖子，电转槽置于冰浴，接通电源，调节电压为15V，时间为16~18h（或恒流300mA, 3h）。显示红灯亮后，按下Start后，开始转膜。转膜方向为蛋白从负极（黑色）转向正极（红色）。

5、免疫印迹反应及化学发光检测

转膜完毕后，根据目的蛋白分子量将膜剪成不同的条带，用封闭液（5% BSA）室温封闭2h。弃封闭液，加入用新的封闭液稀释的一抗（可回收），室温2h或4℃过夜。用TBST清洗 3 次，10min/次。

二抗（可回收）室温孵育1小时，室温1xTBST 洗涤3次，每次约10 min。

此步开始避光操作：将膜浸入化学发光底物工作液（A液：B液=1:1，终体积0.5-1ml 即可）中，显色2分钟，放入BIO-RAD凝胶成像系统中显影。

内参分子量：β-actin：42 kDa

GAPDH：36 kDa

Tubulin: 51kDa