扶桑花中槲皮素含量的HPLC法测定

扶桑花中槲皮素含量的HPLC法测定
【分类号】：r284.2
【摘要】目的建立扶桑花中槲皮素的含量测定方法。

方法采用hplc法，色谱柱为dikma platisil ods柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇0.5%磷酸水溶液（体积比30∶70），流速1.0 ml·min-1，柱温 30 ℃，检测波长360 nm。

结果槲皮素进样量在0.041 6～0.416 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率为98.95%，rsd为1.09%（n=6）。

结论该方法操作简便、快速、准确，可用于扶桑花药材的质量控制。

【关键词】扶桑花；槲皮素；高效液相色谱法
扶桑花（flos hibisci rosaesinensis）为锦葵科植物朱槿（hibiscus rosasinensis l.）的花，原产于我国，现广泛栽培于热带、亚热带地区，是我国及印度、斯里兰卡等国家和地区常用的民间药。

据本草记载，扶桑花主治肺热咳嗽、咯血、鼻衄、崩漏、白带、痢疾、赤白浊、痈肿毒疮等症[1]。

近年来，印度、巴基斯坦等国家对扶桑花抗生育（抑制排卵和着床、抑制精子生成）、抗肿瘤、抗痉挛、促生发、保护心脏、降血压、降血糖、降血脂[2～5]等活性进行了广泛研究，揭示了扶桑花极其重要的开发价值。

我国对扶桑花的药学研究和临床应用较少，其丰富的资源亟需开发。

目前，我国扶桑花仅有地方质量标准，且仅对药材的基源和性状进行鉴别，尚无药效成分含量测定等方面鉴别的报道。

扶桑花含有多种黄酮类化合物，其中，槲皮素及其糖苷具有抗氧化、抗肿瘤、
抗流感、抗衰老、抗血栓、降血压、护心等作用，是扶桑花的主要药效成分之一，主要以槲皮素3二葡萄糖甙、槲皮素3，7二葡萄糖甙等形式存在。

槲皮素的含量测定主要采用高效液相色谱法，但因槲皮素的存在形式不同而测定的色谱条件各异。

本文对扶桑花中槲皮素的提取及hplc测定方法进行分析，为完善扶桑花药材质量标准、扩大其临床应用奠定基础。

1 仪器与试药
仪器：上海天美lc2000型高效液相色谱系统（lc2030紫外检测器、t2000p色谱工作站）；德国赛多利斯bp211d精密电子天平。

试药：槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所，批号100081200406，供含量测定用）。

扶桑花采自广州、中山、惠州等地，经广东药学院中药鉴定学教研室刘基柱老师鉴定为锦葵科木槿属植物扶桑的花。

样品批次见表1，色谱条件分析采用批次2。

提取用试剂均为分析纯，色谱分析用甲醇、磷酸为色谱纯，水为超纯水。

表1 扶桑花样品批次
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为dikma platisil ods色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇0.5%磷酸水溶液（体积比30∶70），流速1.0 ml·min-1，检测波长360 nm，柱温30 ℃，进样量20 μl。

理论板数按槲皮素计算大于5 000，分离度大于1.5。

色谱图见图1。

2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇制成104 μg·ml-1的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备将扶桑花药材阴干，粉碎，过3号筛，取粉末约1 g，精密称定，加甲醇50 ml，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加20%盐酸15 ml溶解，加热回流1 h，迅速冷却，用石油醚萃取3次，每次15 ml，合并水相，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至25 ml，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

图1 对照品（a）和供试品（b）的高效液相色谱图
figure 1 hplc chromatograms of standard （a） and sample （b）2.3 线性关系考察分别精密吸取标准品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 ml，置10 ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

精密吸取20 μl，按“2.1”项下条件进样。

以峰面积为纵坐标（y），进样量（μg）为横坐标（x）绘制标准曲线，得回归方程：y=40969 x-1090.3，r=0.999 8。

结果表明，槲皮素进样量在0.041 6～0.416 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验精密吸取对照品溶液20 μl，连续进样5次，结果槲皮素峰面积的rsd为0.86%，表明仪器的精密度良好。

2.5 稳定性试验精密吸取供试品溶液20 μl，分别于0、2、4、6、8、12 h进样分析。

结果槲皮素峰面积的rsd为1.58%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验精密称取同一批样品，按“2.2.2”项下方法平
行制备供试品溶液5份，测定槲皮素含量，求得rsd为1.29%，重复性良好。

2.7 加样回收率试验取扶桑花粉末约0.25 g，精密称定，分别加入一定量的槲皮素对照品，按“2.2.2”项下方法处理并测定槲皮素含量，平均回收率为98.95%，rsd为1.09%，见表2。

2.8 样品测定取不同批次的样品，按“2.2.2”项下方法提取槲皮素，精密吸取供试品溶液20 μl，注入高效液相色谱仪，记录槲皮素的峰面积，采用外标法计算含量。

结果见表3。

表2 加样回收率试验结果表3 扶桑花中槲皮素的含量测定（n=3）
3 讨论
3.1 本实验曾考察了不同质量分数（10%、20%、30%）的盐酸，在不同温度（80、90、100 ℃）下，水解不同的时间（0.5、1、1.5 h）的效果，结果表明用20%的盐酸，于90 ℃水解1 h，所得槲皮素提取率最高。

3.2 色谱条件考察了甲醇水、甲醇0.1%磷酸水溶液、甲醇0.5%磷酸水溶液等流动相的分离效果，发现流动相中加入磷酸可提高分离度，改善峰形、避免拖尾，以甲醇0.5%磷酸水溶液为流动相时分离效果最好。

3.3 本文建立的hplc测定扶桑花槲皮素含量的方法具有简便、高效、重复性高等特点，可用于扶桑花药材的质量控制。

【参考文献】 [1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中药本草（第五册）[m].上海：上海科学技术出版社，1999： 351-352.
[2] nadkarni k m.indian materia medica[m]. 3rd ed. bombay：popular prakashan， 2007. [3]dela f，hibiscus h.tradition and modernity[j]. phytotherapie， 2006， 4（3）： 136-144. [4] venkatesh s，thilagavathi j，shyam s d.antidiabetic activity of flowers of hibiscus rosasinensis[j]. fitoterapia，2008，79（2）：79-81. [5] 广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准[m].南宁：广西科学技术出版社， 1992：57，212-214.
[6] 李萍.高效液相色谱法测定黄毛儿草中槲皮素的含量[j].广东药学院学报， 2006， 22（1）： 57-58.。