冰冻切片的免疫荧光
免疫荧光法—冰冻切片
免疫荧光法—冰冻切片
免疫荧光－冰冻切片间接法
免疫荧光法实验——冰冻切片
间接法
【标本】正常肝、肝癌标本冰冻切片
【抗体和试剂】
（1）荧光标记抗体：兔抗人LAPTM-4B-N端（胞浆内）一抗；羊抗兔IgG-TRITC二抗；小鼠抗人integrin α6 McAb；小鼠抗人EGFR多抗
（小鼠抗人EGFR单抗）；羊抗鼠IgG-FITC二抗（工作浓度为1:30）；
（2）0.01mol/L pH7.4 PBS
（3）2%BSA：用于配制一抗及封闭非特异性结合位点（可用正常羊血清封闭非特异性结合位点）
（4）缓冲甘油封片：1份0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液与9份甘油混合
0.2mol/L PB：X ml 0.2mol/L Na2HPO4 + Y ml 0.2mol/L NaH2PO4
pH8.0 X=94.7ml; Y=5.3ml
【染色步骤】
1．冰冻切片室温丙酮（冷丙酮）固定10min，PBS洗5min×3；
2．2％BSA37?C封闭60min或4?C过夜；
3．置切片于湿盒内，分别滴加一抗37?C 30min；
4．PBS洗5min×3；
5．分别滴加二抗37?C 30min；
6．PBS洗5min×3；
7．若染核；用1μg/ml Hoechst33342染色10min；PBS洗5min×3；
8．缓冲甘油封片；
9．荧光显微镜下观察或-20℃避光保存；。
免疫荧光法—冰冻切片
免疫荧光－冰冻切片间接法
免疫荧光法实验——冰冻切片
间接法
【标本】正常肝、肝癌标本冰冻切片
【抗体和试剂】
（1）荧光标记抗体：兔抗人LAPTM-4B-N端（胞浆内）一抗；羊抗兔IgG-TRITC二抗；小鼠抗人integrin α6 McAb；小鼠抗人EGFR多抗
（小鼠抗人EGFR单抗）；羊抗鼠IgG-FITC二抗（工作浓度为1:30）；
（2）0.01mol/L pH7.4 PBS
（3）2%BSA：用于配制一抗及封闭非特异性结合位点（可用正常羊血清封闭非特异性结合位点）
（4）缓冲甘油封片：1份0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液与9份甘油混合
0.2mol/L PB：X ml 0.2mol/L Na2HPO4 + Y ml 0.2mol/L NaH2PO4
pH8.0 X=94.7ml; Y=5.3ml
【染色步骤】
1．冰冻切片室温丙酮（冷丙酮）固定10min，PBS洗5min×3；
2．2％BSA37︒C封闭60min或4︒C过夜；
3．置切片于湿盒内，分别滴加一抗37︒C 30min；
4．PBS洗5min×3；
5．分别滴加二抗37︒C 30min；
6．PBS洗5min×3；
7．若染核；用1μg/ml Hoechst33342染色10min；PBS洗5min×3；
8．缓冲甘油封片；
9．荧光显微镜下观察或-20℃避光保存；。
冰冻切片免疫荧光直接一抗操作流程
冰冻切片免疫荧光直接一抗操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor.I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!冰冻切片免疫荧光直接一抗操作流程详解在生物医学研究中，冰冻切片免疫荧光技术是一种常用的方法，它能帮助我们观察和分析细胞或组织中的特定蛋白质。
冰冻切片免疫荧光染色步骤
冰冻切片免疫荧光染色步骤
冰冻切片免疫荧光染色步骤：
(1)冰冻切片取出，室
温放置使其干燥后，用冷丙酮于4C固定10分钟。
( 2)切片用
0.01MPBS清洗后加入
1.2%双氧水作用30 分钟，以除去非特异染色。
( 3)
0.01M PBS清洗，3次X1分钟。
( 4)
0.3%Triton X-100作用30 分钟。
(5)加入以抗体稀释液(含1%BSA勺
0.01M PBS，pH
7.4)稀释至工作浓度的一抗，4C过夜。
( 6)
0.01M PBS清洗，3次X1分钟。
(7)加入荧光抗体TRITC-lgG( 1: 100)或FITC-lgG( 1: 100),室温孵育2 小时。
( 8)
0.01M PBS清洗，3次X1分钟。
( 9)缓冲甘油封片，荧光xx 下观察。
对照组:
采用空白对照:
除用
0.01MK PBS代替一抗外，其余程序与实验组相同载玻片处理步骤：（1 ）硫酸浸泡过夜。
（2）自来水冲洗干净后双蒸水冲洗3 遍。
（3）晾干后在
0.1%明胶中快速浸泡后取出。
室温晾干或37 C烤干备用。
冰冻切片免疫荧光染色及HE染色流程
冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例)（1）冰冻切片室温晾干15分钟；（2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）；（4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5）PBS洗3次，每次10分钟；（6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37℃孵育1小时；（7）PBS洗3次，每次15分钟；（8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照；（9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。
`注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。
附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）：（1）pH7.4 0.01MPBS：配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g0.1MPBS配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O5.9g+NaCl 17g定容至2000ml,高压，pH7.2-7.4（2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存（3）封闭液：10％NGS－0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存（4）抗体稀释液：1％BSA－0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存一、操作方法及步骤：①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。
②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。
冰冻切片 免疫荧光组化
冰冻切片免疫荧光组化
冰冻切片和免疫荧光组化技术是生命科学中广泛应用的技术。
以
下是两种技术的简介：
1. 冰冻切片技术：冰冻切片是把组织或细胞快速冻结并切成薄
片的技术。
不同于石蜡包埋技术，冰冻切片不需要前期的化学处理和
固定，具有样品保留完整活性、切片速度快、质量高等优点。
冰冻切
片广泛应用于免疫荧光组化、原位杂交、基因组学等技术中。
2. 免疫荧光组化技术：免疫荧光组化技术是一种利用特异性抗
体对目标分子进行标记和检测的技术。
该技术在机体免疫学、病毒学、肿瘤学和神经科学等领域广泛应用，可用于检测病毒、肿瘤标志物、
蛋白质表达、分子相互作用等。
通过将免疫球蛋白标记荧光染料或酶
标记物质后，通过显微镜或荧光显微镜观察样品上的染色，并进行分析。
该技术具有灵敏、特异、可视化等优点，已成为生命科学研究中
必不可少的技术之一。
冰冻切片免疫荧光直接染色操作流程
冰冻切片免疫荧光直接染色操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!冰冻切片免疫荧光直接染色操作流程一、准备工作阶段在进行冰冻切片免疫荧光直接染色之前，需要做好以下准备工作：1. 准备标本：首先，需要准备好需要进行染色的标本组织切片，并确保切片的完整性和干燥度。
冰冻切片免疫荧光实验步骤
冰冻切片免疫荧光实验步骤1. 前言嘿，朋友们！今天我们来聊聊一个科学实验的酷炫玩法——冰冻切片免疫荧光实验。
你可能会想，这听起来有点高深，其实没那么复杂，咱们用轻松的方式来搞定它！这个实验就像是给细胞穿上五光十色的衣服，让它们在显微镜下闪闪发光。
是不是听起来有点像魔法？不过，魔法背后可是需要一系列精细的步骤哦，接下来就让我们一起踏上这趟科学之旅吧！2. 材料准备2.1 器材首先，咱们得准备好一些“武器”。
你需要的工具有：冷冻切片机、显微镜、抗体、荧光染料、冰块、以及小瓶子。
别担心，这些东西在实验室里一般都能找到。
好比去超市购物，准备齐全才能大干一场嘛！2.2 样本收集然后，咱们得搞定样本。
可以用小动物的组织，比如小鼠的肝脏或脑组织，当然也可以是细胞培养。
像选菜一样，找个健康的样本，才能做出美味的实验结果。
记得小心翼翼哦，样本可是你实验的“主角”！3. 冰冻切片3.1 制作切片接下来就是最重要的环节了！将收集到的样本放进冷冻机，设置好温度，通常是在20°C到80°C之间，具体要看你使用的试剂。
等样本冰冻得像冰棍一样，取出来，用冷冻切片机将它切成薄薄的片，厚度大约在510微米之间。
要知道，切片越薄，观察的时候越清晰，就像看电影的时候画面越高清，效果自然越棒！3.2 贴片固定切好的薄片就像鲜花一样，需要“小心翼翼”地处理。
将切片放到载玻片上，记得用一些固定液，比如丙酮或者甲醇，给它们来个“定妆”！这样能让你的切片在后续步骤中更加稳固。
让我们给这些切片点个赞，做得不错哦！4. 免疫染色4.1 抗体孵育好了，接下来的步骤就像给细胞化妆一样。
把固定好的切片放进抗体溶液里，让它们充分“泡澡”。
通常来说，先用一抗（即特异性抗体）孵育，时间可以在1小时到过夜之间，视情况而定。
这个时候，你可以想象细胞们正开心地吸收着抗体，准备好接下来的“盛宴”！4.2 荧光染料待一抗充分结合后，咱们再来一剂“荧光染料”！同样把切片浸泡在二抗（荧光标记抗体）里，接着再静置一会儿。
冰冻切片 免疫荧光组化
冰冻切片免疫荧光组化都是生物医学研究中常用的技术。
冰冻切片是将组织样本冻结后，使用切片机将其切成薄片，用于病理学研究、免疫组化等方面。
冰冻切片是一种快速、简便的技术，适用于病理诊断，可以用于分析组织、细胞和细胞器的结构和功能。
免疫荧光组化是一种检测特定抗原或抗体在组织中分布情况的技术。
它利用荧光染料与抗原或抗体的结合来检测它们在组织中的位置。
这种技术可以用于研究细胞的分子结构和功能，诊断疾病，以及监测治疗的效果等。
在实际应用中，冰冻切片和免疫荧光组化常常结合使用。
首先，使用冰冻切片制备细胞或组织切片，然后通过免疫荧光染色技术检测特定抗原或抗体在切片中的分布情况，从而获得更详细的细胞或组织结构信息。
冰冻切片免疫荧光染色及HE染色标准流程
冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例)（1）冰冻切片室温晾干15分钟；（2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以清除OCT；（3）用含10％正常山羊血清旳PBS室温封闭切片1 小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）；（4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5） PBS洗3次，每次10分钟；（6）加入罗丹明标记旳羊抗小鼠旳IgG二抗(1:50; Sigma 公司)，37℃孵育1小时；（7） PBS洗3次，每次15分钟；（8）封片后，荧光显微镜观测成果并拍照；（9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。
`注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后旳洗涤过程中注意避光附注1：如目旳分子为胞内分子，多种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。
附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）：（1）pH7.4 0.01MPBS：配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g0.1MPBS 配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O5.9g+NaCl 17g 定容至ml, 高压，pH7.2-7.4（2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存（3）封闭液：10％NGS－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存（4）抗体稀释液：1％BSA－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存一、操作措施及环节：①取材，未能固定旳组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最佳为24×24×2mm。
②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。
冰冻切片免疫荧光间接法实验
实验报告3.因为相同种属的一抗具有相同的同种型抗原表位，因此一种与一抗不同种属的二抗可以结合多种一抗。
间接法荧光标记一方面节省标记成本，提高通用性；另一方面提高灵敏性，使信号更强。
但容易出现非特异染色，所以要用用与二抗同种的正常血清或白蛋白与组织孵育，封闭非特异位点。
4.注意：1）一抗和二抗是不同种属来源的抗体。
2）标记二抗与一抗必须是同一类（通常用的是抗人IgG）分、均匀，同时降低非特异结合或吸附）。
3）反应后用PBS洗3次，每次5分钟。
4）在冰浴中预先用0.1MPBS 配制荧光标记二抗。
5）切片甩干，擦去多余PBS。
滴加适量的二抗，盖好湿盒。
于37℃恒温培养箱孵育2小时。
注意加二抗过程及孵育过程中避光。
6）为更好显示细胞结构，一般用蓝色DAPI衬染，以确定所检测抗原的位置。
DAPI分装后，一般用锡纸包裹避光，-20℃保存，用时提前取出解冻。
7）在二抗孵育结束前8分钟，取出湿盒，滴加荧光染料DAPI，吹吸混匀，盖好湿盒。
于37℃继续孵育8分钟。
注意实验过程中避光。
8）二抗孵育结束后取出切片置于染缸中，0.01M pH7.4PBS浸泡。
9）置于37℃摇床中摇洗三次，每次15分钟。
摇床转速一般每分钟100转，摇洗过程注意避光。
4.封片1）免疫荧光技术常用封片剂：缓冲甘油封片剂。
2）将浸洗好的切片甩干，擦去多余水分。
滴加甘油封片剂，轻轻盖上盖玻片，防止出现气泡。
待干燥后在盖玻片周围涂指甲油封边5.镜下观察立即用荧光显微镜观察。
注意：一般标本在高压汞灯下照射超过3分钟，就有荧光减弱现象。
经荧光染色的标本最好在当天观察，随时间延长，荧光强度会逐渐下降。
冰冻切片的免疫荧光
免疫荧光通用操作规程冰冻切片的免疫荧光1, 动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4C过夜后，OCT包埋。
-20C保存3月，-80C长期保存。
请勿保存于液氮。
2, 冰冻切片机切片至少10um,空气干燥2分钟后，-20C储存3, 切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA固定15分钟，或-20 C丙酮固定15分钟置通风橱2小时4, 1XPBS清洗玻片，3X5min从此请保持玻片湿润5, 有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。
为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压•微波修复•高压修复•隔水加热•电炉加热）… 关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液… 选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0, B液EDTA-Na缓冲液PH8.0, C液枸盐酸缓冲液PH4.5）6, 室温圭寸闭1小时封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS （细胞因子，无需圭封闭的蛋白7, 一抗4C过夜请用圭寸闭液稀释一抗8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min9, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （dyelight ）in 封闭液，避光室温1小时10, Wash,1XPBS, 3x5mi n11, DAPI 染核5min ,12, DDW Rinse13, 抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜14, 干片后4C保存石蜡切片的免疫荧光1, 动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤），制成石蜡包块2, 组织学染色切片厚度2um,免疫荧光染色切片厚度至少6um,切片复水：58 °C 20mi n-xyle ne 2x10mi n-100%EtoH2x10mi n95%EtoH2x10mi n-70%EtoH10mi n-, DDW5mi n4, Rinse玻片IxPBS,从此请保持玻片湿润5, 抗原修复过夜。
冰冻切片的免疫荧光
免疫荧光通用操作规程冰冻切片的免疫荧光1, 动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4C过夜后，OCT 包埋。
-20C保存3月，-80C长期保存。
请勿保存于液氮。
2, 冰冻切片机切片至少10um,空气干燥2分钟后，-20C储存3，切片从-20 取出后，在通风橱放10-30 分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20 C 丙酮固定15分钟置通风橱2小时4, 1XPBS 清洗玻片, 3X5min 从此请保持玻片湿润5, 有时,抗原修复3 小时会得到更好的结果。
为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压•微波修复•高压修复•隔水加热•电炉加热）… 关注修复的温度 ,时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间）,抗原修复液必须遵循自然降温规律, 使用足量的抗原修复液… 选择不同PH 值的修复液（A 液枸盐酸缓冲液PH6.0, B 液EDTA-Na缓冲液PH8.0, C液枸盐酸缓冲液PH4.5）6, 室温封闭1 小时封闭液：5%BSA+1 0%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in IxPBS （细胞因子,无需封闭的蛋白7, 一抗4C过夜请用封闭液稀释一抗8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min9, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （dyelight ）in 封闭液，避光室温1 小时10, Wash,1XPBS, 3x5min11, DAPI 染核5min，12，DDW Rinse13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜14,干片后4C保存石蜡切片的免疫荧光1 ，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤），制成石蜡包块2,组织学染色切片厚度2um,免疫荧光染色切片厚度至少6um,切片复水：58 °C 20mi n-xylene 2x10min-100%EtoH2x10min95%EtoH2x10min-70%EtoH10min-, DDW5min4, Rinse 玻片1xPBS, 从此请保持玻片湿润5，抗原修复过夜。
冰冻切片免疫荧光染色流程
冰冻切片免疫荧光染色流程
一、准备液体和器材：
1. 表面活性剂：TBS-T，Triton X-100，PBS，Ethanol，DMSO；
2. 染色液：PBS，Trizma-HCL，和4％PFA；
3.小刀：刀片用于切片，可以用来将切片切割为更小的片段；
4.水槽：若可用多个水室，可以将液体装入不同的水室，流程操作更便捷；
5.酶标仪：一般是用来进行荧光染色的，也可以用来进行基因分析。
二、准备样品：
1.将样品置于-80℃冰箱内，并将其在冰上进行切片；
2.将切片放置于室温，进行解冻，解冻时间需要20分钟至30分钟，静置时间应该在2小时左右；
三、免疫荧光染色：
1. 将冰冻切片浸入表面活性剂（TBS-T，Triton X-100，PBS，Ethanol，DMSO）中，使样品有足够的湿润；
2.接着将样品放入PBS，4％PFA溶液中；
3.将样品放入染色液中，依次洗涤，3次洗涤时间应该为30分钟；
4.将染色液置于酶标仪中，开始荧光染色；
5.酶标仪操作结束后，将样品取出，然后放入椰子油中水解，用来溶解染料分子；
6.最后，将样品放入可见光荧光镜下观察，观察免疫荧光染色的结果。
四、数据分析：
1.用酶标仪进行荧光染色实验时，结果会生成图像文件；。
冰冻切片免疫荧光染色流程
冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例)（1）冰冻切片室温晾干15分钟；（2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）；（4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5）PBS洗3次，每次10分钟；（6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37℃孵育1小时；（7）PBS洗3次，每次15分钟；（8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照；（9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。
注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。
附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）：（1）pH7.40.01MPBS：配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl7.65g0.1MPBS配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O5.9g+NaCl 17g定容至2000ml,高压，pH 7.2-7.4（2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.40.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存（3）封闭液：10％NGS－0.3%TrixtonX100－pH7.40.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存（4）抗体稀释液：1％BSA－0.3%TrixtonX100－pH7.40.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存。
冰冻切片免疫荧光取材
冰冻切片免疫荧光取材2.1.5 免疫荧光技术检测PTEN 蛋白表达。
2.1.5.1 标本制备1) 取材：对照组和模型组分别随机选取15 只大鼠于0d、1d、3d、7d、14d时相点进行免疫荧光技术检测，每个时相点3 只，麻醉后（水合氯醛3.5%，1ml/100 克，腹腔注射)，先用生理盐水灌注（生理盐水的量不能少于250ml，最好300ml 以上），将血液冲净后用4%多聚甲醛灌注，0.1g/mol 磷酸缓冲液配制的4 C 4%多聚甲醛（PH=7.4）约250ml 灌注至肢体僵硬，待充分固定后断头取脑组织，组织厚度约为3~5mm。
灌注一定要充分，肝脏变硬呈瓷白色为最佳；2)固定：4℃4%多聚甲醛固定24h。
3)灌流固定好的脑组织不需后固定可直接脱水；脱水：用30%蔗糖（4%多聚甲醛配置）固定脱水10~24h，换新液继续脱水，组织沉底后即可包埋；4)包埋：包埋器（本实验采用奶片盒或大片剂含片盒替代包埋器）内先放入少量OCT，将组织块放入（放组织时动作要慢，轻轻下压，小心组织移位和产生气泡），放好后继续加入OCT 至全部包裹组织为止，将标注的纸条放于包埋块周边，以明确分组及定位大脑的前后切面位置。
将包埋好的组织块直接放入-80℃冰箱冷冻，冻好后用锡纸包好-80℃保存备用；5)切片：切片前先将恒冷箱切片机调至-20℃预冷20min，同时将组织从-80℃冰箱内取出，置于恒冷箱切片机内30min，将组织块用OCT 粘贴在托物台固定，冠状面连续切片，然后进行切片。
6)贴片染色标本切片厚度为15~20um，漂片染色（蛋白表达量低的采用）切片厚度为30~40um。
选用多聚赖氨酸预处理的载玻片进行贴片，贴片时玻片应从一侧贴附切片，如果不平可用小毛笔蘸少许纯水轻轻抚平。
7)将贴好的切片置于37℃温箱烤1h，烤干后即可进行染色或装入切片盒密封-80℃保存备用。
2.1.5.2 免疫荧光染色步骤1) 取出冰冻切片，室温放置30min，PBS 洗10min×3 次；2) 0.4%Triton-100 浸泡10min（1000ml PBS+4ml Triton-100）；3) PBS 洗10min×3 次；4) 抗原修复（高压锅限压阀冒气后计时1.5min，冷水降压，自然冷却）；5) PBS 洗10min×3 次；用组化笔在距离组织2mm 处划圈；6) 5%驴血清（与二抗源性相同）封闭1h；7) 一抗：甩去多余血清，不洗。
肾 活 检 冰 冻 切 片 免 疫 荧 光 染 色
肾活检冰冻切片免疫荧光染色
（直接法）
一．试剂
1.冷冻包埋剂OCT
2.荧光抗体：IgG-FITC,IgA-FITC,IgM-FITC,C3-FITC,C4-FITC,C1q-FITC，
Fg-FITC。
均用抗体稀释液进行1：100稀释。
二．取材
1.准备冷冻头（标号并预先包埋少量OCT）、纱布（生理盐水浸湿）、冰块
2.活检标本取出后，立即放入装有纱布的Tip管中，置冰块上送回实验室
3.组织立即置冷冻好的冷冻头上，再包埋少量OCT，恒冷切片机内制作冰冻切片（切片厚度为3um），用蒸馏水冲洗掉切片上的OCT;加稀释好的抗体，避光，湿盒内4℃过夜;蒸馏水洗2分钟×3次;荧光显微镜观察结果
三．注意事项：
1.取材后标本须快速冷冻
2.切片温度需适宜，不宜过高或过低
3. 染色过程中必须防止切片干燥，严格避光。
冰冻切片的免疫荧光
冰冻切片的免疫荧光免疫荧光通用操作规程冰冻切片的免疫荧光1，动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。
-20℃保存3月，-80℃长期保存。
请勿保存于液氮。
2，冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20℃储存3，切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时4, 1XPBS清洗玻片，3X5min 从此请保持玻片湿润5，有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。
为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5）6，室温封闭1小时封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白7，一抗4℃过夜请用封闭液稀释一抗8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（dyelight )in封闭液，避光室温1小时10, Wash,1XPBS, 3x5min11, DAPI 染核5min，12，DDW Rinse13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜14，干片后4℃保存石蜡切片的免疫荧光1，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤)，制成石蜡包块2，组织学染色切片厚度2um，免疫荧光染色切片厚度至少6um，切片复水：58℃20min-xylene 2x10min-100%EtoH2x10min95%EtoH2x10min-70%EtoH10min-，DDW5min4, Rinse 玻片1xPBS, 从此请保持玻片湿润5，抗原修复过夜。
组织冰冻切片如何进行免疫荧光
组织冰冻切片如何进行免疫荧光观察组织中目的蛋白的定位，一般可以选择冰冻切片进行免疫荧光。
冰冻切片制作时间短，操作过程简单快捷，同时获得的免疫荧光图片相对于免疫组化图更加漂亮。
冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。
用高分子材料配制成冰冻切片包埋液，将冰冻包埋液直接可直接在切片机组织卡盘上加少许包埋液，在其固化前嵌入组织块，然后再于组织周围加入少许包埋液稳定。
组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。
冰冻切片过程较简单，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态。
免疫荧光技术亦称荧光抗体技术，应用化学方法将荧光色素（主要是异硫氰酸荧光黄FITC）与抗体结合起来，即荧光抗体，这种结合荧光色素的抗体的免疫原性并不因此而发生改变。
在特定条件下用荧光抗体染标本，如果标本中存在有相应的抗原，荧光抗体便与标本中的抗原发生特异性结合，在荧光显微镜的蓝紫光或紫外光照射下，标本中的抗原抗体复合物便发出特异的荧光，荧光的出现表明被检标本中特异抗原的存在。
免疫荧光特异性强、敏感性高、速度快。
今天就为大家介绍一下冰冻切片免疫荧光染色流程。
冰冻切片免疫荧光染色流程1冰冻切片一般选择多聚赖氨酸黏附性载玻片，多聚赖氨酸处理载玻片是带强阳离子的,主要用于病理组织切片、液基细胞学涂片,作用是防止玻片掉片。
冰冻切片之后如果不即时染色，可将片子放于负八十冰箱。
再次取出后可先在室温晾干15分钟。
然后置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；2用组化油笔将待染组织圈好，目的是为了在进行后续孵育抗体时尽量缩小范围，使抗体进行有效的孵育；30.5%TritonX-100(PBS配制)室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）;用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干）封闭的目的是通过血清与非特异性位点结合,以消除非特异性染色,提高目的蛋白的准确性和降低背景；4加入一抗(1:100-1：500)，4℃孵育过夜。
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免疫荧光通用操作规程
冰冻切片的免疫荧光
1，动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。
-20℃保存3月，-80℃长期保存。
请勿保存于液氮。
2，冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20℃储存
3，切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA固定15分钟，或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时
4, 1XPBS清洗玻片，3X5min 从此请保持玻片湿润
5，有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。
为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5）
6，室温封闭1小时
封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS 条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白
7，一抗4℃过夜
请用封闭液稀释一抗
8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min
9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（dyelight )in封闭液，避光室温1小时
10, Wash,1XPBS, 3x5min
11, DAPI 染核5min，
12，DDW Rinse
13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜
14，干片后4℃保存
石蜡切片的免疫荧光
1，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤)，制成石蜡包块
2，组织学染色切片厚度2um，免疫荧光染色切片厚度至少6um，切片复水：58℃20min-
xylene 2x10min-
100%EtoH2x10min
95%EtoH2x10min-
70%EtoH10min-，DDW5min
4, Rinse 玻片1xPBS, 从此请保持玻片湿润
5，抗原修复过夜。
为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5）
6，室温封闭1小时
封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS 条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白
7，一抗4℃过夜
请用封闭液稀释一抗，如果没有二抗种属来源的正常血清，细胞因子用1%BSA封闭，同时一定要有一个阴性对照。
8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min
9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（Dyelight )in封闭液，避光室温1小时
10, Wash,1XPBS, 3x5min
11, DDW Rinse , DAPI 染核5min，
12，DDW Rinse
13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜
14，干片后4℃保存
备注：多重荧光染色原则
A:尽量选择不同种属来源的一抗：可同时染
B:如果种属来源相同的一抗：可顺次染色，
抗原修复: O/N
第一个一抗：4℃O/N , 第二天对应二抗@RT 1hr 红光
短暂地封闭
第二个一抗：@RT 2hr，对应二抗@RT 1hr 绿光
：
DAPI
封片
备注：对照实验
A:阴性对照：组织免疫荧光必做
相同标本：只加荧光二抗:排除非特异性染色
不同样本：采用确定不含一抗对应抗原的标本验证荧光信号的特异性
B：阳性对照：采用确定含有一抗对应抗原的标本
TUNEL与免疫荧光共染时
细胞的免疫荧光
1，细胞生长贴壁到80%融合，倒掉细胞培养液
2，Rinse，用固定剂rinse一到两次
3，首选4%多聚甲醛固定15min ，0.2%TritonX-100 打孔5-10min；或者选用不同的固定方式：
甲醇（分析纯or HPLC)-20℃10min
丙酮（HPLC）-20℃10min
4%多聚甲醛+0.2%TritonX-100 10min
4%多聚甲醛+0.2%Saponins10min 细胞核核膜
4%多聚甲醛15min + -20℃甲醇5min 细胞膜
4%多聚甲醛15min + -20℃丙酮5min 细胞骨架/微管蛋白
4%多聚甲醛10min @RT+4 ℃10min+ -20℃甲醇1min 细胞膜+胞浆蛋白+细胞核
4, Wash,1xPBS,2x1min 从此请保持细胞湿润
5, 室温封闭1小时
封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS 条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in
1xPBS
6，一抗4℃过夜
请用封闭液稀释一抗
7, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min
8,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（Dyelight )in封闭液，避光室温1小时
9, Wash,1XPBS, 3x5min, DDW Rinse
10, DAPI 染核5min，
11，DDW Rinse
12，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜
13，干片后4℃保存。