大肠菌群检验操作规程
大肠菌群平板计数法检验流程
大肠菌群平板计数法检验流程
朋友！今天咱来唠唠这大肠菌群平板计数法的检验流程。
先说准备工作哈，这可重要啦！得把那些培养皿、移液器啥的都准备好。
我跟你说，我刚开始学的时候，就老忘这忘那的，被师傅好一顿骂！
然后呢，就是取样。
这取样可得小心，千万别弄撒了，不然又得重来，那可烦死个人！我记得有一次，我手一抖，样本撒了一地，唉，当时我那个心呐，哇凉哇凉的。
接下来就是接种啦！这一步可得仔细，就跟绣花似的。
我记得好像是用移液器吸取一定量的样品，加到培养皿里。
不过也可能记错喽，嘿你可得自己多注意。
培养的时候，你就等着吧。
这期间你可别着急，着急也没用。
我以前就老着急，总想着快点出结果，结果啥也没弄好。
等培养好了，就开始计数啦！这时候你得瞪大眼睛，一个一个数清楚。
要是数错了，那可就白忙活了。
哦，对了！之前说的取样，一定要保证无菌操作，不然结果就不准啦！这可是关键中的关键。
我跟你讲，这检验流程啊，就得多练。
我刚开始也是笨手笨脚的，现在不也熟练了嘛！
要是你在操作过程中遇到啥问题，别慌，慢慢琢磨，或者来问我也行。
我这又扯远啦，反正按照这步骤来，多练几次，你肯定能掌握！怎么样，朋友，加油干吧！。
大肠菌群的测定方法操作规程
文件制修订记录1、培养基和试剂月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤，煌绿乳糖胆盐肉汤，结晶紫中性红胆盐琼脂，无菌生理盐水。
2、操作步骤2.1样品的稀释：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
用1 mL 无菌吸管吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL 生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1 次，换用1支1 mL 无菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。
2.2选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。
同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
2.3及时将15 mL～20 mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平板表层。
翻转平板，置于36℃±1℃培养24h～48 h。
3、平板菌落数的选择选取菌落数在15 CFU～150 CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm或更大。
4、证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36℃±1℃培养48h，观察产气情况。
凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
5、大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以4.4中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。
大肠菌群测试片检测操作流程
大肠菌群测试片操作流程1.样品的前处理(建议使用蔬菜瓜果、河水及大肠菌群标准菌作为样品)（1）蔬菜瓜果：称取25g样品切成1cm左右的碎片，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min制成1:10的样品匀液。
（2）河水：以无菌吸管吸取25mL河水置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
（3）大肠菌群标准菌：挑取平板上大肠菌群标准菌的单菌落，于盛有5mL LB 液体培养基的试管中，37℃培养过夜，以此作为菌原液。
用1mL无菌吸管或微量移液器吸1mL菌原液于盛有9mL的稀释液的无菌试管中，制成1:10的样品匀液。
2.样本稀释倍数用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL的稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸管尖端不要触及稀释液面），振荡试管或换用一只无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
按此操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释液必要时用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCl）调节pH至7.0~7.2。
（1）蔬菜样品的稀释倍数：取100、10-1两个稀释度进行接种验证(可根据实际情况记性调整)。
（2）河水样品的稀释倍数：取10-1、10-2两个稀释度进行接种验证(可根据实际情况记性调整)。
（3）大肠菌群标准菌原液的稀释倍数：取10-7、10-8两个进行接种验证(可根据实际情况记性调整)。
（4）自来水的稀释倍数：直接取自来水接种进行验证。
3.接种一般食品选1～2个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品（如饮用纯水和矿泉水等）可直接吸取原液进行检测。
将大肠菌群测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管吸取1mL样品匀液垂直加入到测试片中央，用手轻轻将上层盖下，使检测样品液覆盖整个检测圈（应尽量避免产生气泡），静置1min使培养基凝固，最后用手轻轻将上层盖下。
公共场所茶具微生物检验方法大肠菌群测定操作规程
1、目的依据GB/T18204.3—2000公共场所茶具微生物检验方法大肠菌群测定，熟练掌握此规程，保证检验结果的准确性。
2、适用范围本标准规定了公共场所内公用茶具大肠菌群的测定方法。
3、责任使操作者熟悉本规程，并在具体样品检验中严格遵照操作，确保检测结果准确性。
4、内容：4.1定义：大肠菌群指一群在37℃、24h培养能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌痒的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价被检物的卫生质量。
4.2 仪器：高压蒸汽灭菌器。
干热灭菌箱。
培养箱：36℃±1℃。
冰箱。
电炉。
天平。
灭菌平皿：直径9cm。
灭菌刻度吸管：1mL,10mL。
灭菌棉拭子。
灭菌剪刀。
PH计或精密PH试纸。
4.3 培养基和试剂：4.3.1乳糖胆盐发酵培养液4.3.1.1成分：蛋白胨20g猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g乳糖10g0.04%溴甲酚紫水溶液25ml蒸馏水1000ml4.3.1.2制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于蒸馏水中，调pH值至7.4，加溴甲酚紫溶液，混匀，分装到带有倒管的试管中，每管10ml，在115℃高压灭菌15分钟。
（注：双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍）4.3.2伊红美兰琼脂4.3.2.1成分：蛋白胨10g乳糖10g磷酸氢二钾2g琼脂17g2.0%伊红水溶液20ml0.65%美蓝溶液10ml蒸馏水1000ml4.3.2.2制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，调pH值至7.1，分装到烧瓶内。
121℃高压灭菌15分钟备用，临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50～55℃，加入伊红和美篮溶液，摇匀，倾注平板。
4.3.3乳糖发酵管4.3.3.1成分：蛋白胨20g乳糖10g0.04%溴甲酚紫水溶液25ml蒸馏水1000ml4.3.3.2制法：将蛋白胨和乳糖溶于水中，调pH值至7.4，加入指示剂，分装到带有倒管的试管中，每管3ml，在115℃高压灭菌15分钟。
大肠菌群检验方法及操作方法
大肠菌群检验方法及操作方法1、什么是大肠菌群：指一群需氧及兼性厌氧，在37℃能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。
2、大肠菌群的组成：大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。
3、大肠菌群的测定意义◆粪便污染的指标菌：大肠菌群或粪大肠菌群◆以大肠菌群作为粪便指标菌原因：1)在粪便中数量最大；2)在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；3)检测方法简便容易。
◆大肠菌群的测定意义：1)判断食品中否受到粪便污染。
2)有利于控制肠道传染病的发生和流行。
3)有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。
4、大肠菌群的生物学特性1 形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。
2 发酵乳糖产酸产气3 培养特性：在EMB琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；4 在麦康凯琼脂上的典型菌落：呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。
5、大肠菌群检验方法及操作方法◆国家标准：◆三步法：乳糖胆盐发酵试验→分离培养→证实试验(乳糖发酵试验)◆行业标准：◆两步法：推测试验→证实试验表1 大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落特征MPN法简介Most Probable Number Method最大可能数•对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。
•MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。
6、粪大肠菌群的检验•粪大肠菌群：系一群需氧及兼性厌氧，在44.5℃培养24h内能发酵乳糖产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
•于LST中36℃培养48h内产气，并于EC内培养44℃24h产气的一群细菌；在胰蛋白胨肉汤中于44.5℃，24h 内产生吲哚的耐热大肠菌群。
检验方法：7、检验注意事项1）从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
大肠菌群检测操作规范培训
大肠菌群检测操作规范培训一、引言大肠菌群是指肠道内的一类细菌，包括大肠埃希菌、变形杆菌、埃斯特菌、摩根氏菌等，是人体健康的重要指标之一。
大肠菌群检测是一种常见的临床检验项目，可以用于判断肠道菌群的平衡状况，对于排查肠道疾病、调节肠道菌群平衡等具有重要的临床意义。
本文旨在对大肠菌群检测相关的操作规范进行培训，以确保检测结果的准确性和可靠性。
二、前期准备1. 实验室环境准备：（1）实验室应当保持清洁整洁，操作台面应当有足够的空间进行操作。
（2）实验室空气应当流通良好，保持适宜的温度和湿度。
（3）实验室内应当配备必要的实验仪器和设备，如PCR仪、离心机、冰箱、显微镜等。
（4）实验室内应当配备必要的耗材和试剂，如离心管、移液器、试剂盒等。
2. 人员准备：（1）参与大肠菌群检测的工作人员应当接受相关的培训，了解操作规范和实验流程。
（2）工作人员应当穿着符合卫生要求的工作服和手套，避免交叉感染。
三、操作规范培训1. 样本采集：（1）样本采集应当在临床医生指导下进行，严格按照采集标本的要求进行操作。
（2）采集的样本应当尽快送交实验室进行检测，避免样本长时间保存导致细菌数量的改变。
2. 样本处理：（1）收到样本后，应当立即进行处理，避免样本受到外界污染。
（2）样本应当在无菌条件下进行离心、抽提DNA等处理工作，避免外来细菌的干扰。
3. PCR扩增：（1）PCR扩增是大肠菌群检测的关键步骤，应当严格按照PCR扩增试剂盒说明书进行操作。
（2）PCR扩增反应体系应当准确配制，避免试剂用量不足或过量导致扩增失败或者非特异性扩增。
4. 扩增产物检测：（1）扩增产物检测应当使用准确的方法，如琼脂糖凝胶电泳或者实时荧光定量PCR。
（2）扩增产物的检测结果应当与正对照和负对照比较，确保结果的准确性。
5. 数据分析：（1）检测结果应当由专门的人员进行数据分析，避免结果的误解和错误解读。
（2）对于阳性结果的样本，应当进行多次重复检测以确认结果的可靠性。
大肠菌群检测操作规范培训
详细描述
采样时，应选取有代表性的样品，如选取多个部位、多种类 型的食物进行采样。同时，采样工具应清洁无菌，避免交叉 污染。
试剂污染或失效
总结词
试剂是进行大肠菌群检测的必要物质，其质量和有效性对检测结果有很大影响。
详细描述
试剂应存放在阴凉、干燥、避光的地方，并在规定的有效期内使用。使用前应检 查试剂是否过期或变质。
确保检测设备齐全、功能 正常，校准合格证在有效 期内。
设备清洗
使用无菌棉球或纱布蘸取 75%乙醇或无水乙醇，擦 拭设备表面和内部，干燥 后进行下一步操作。
设备校准
根据设备说明书进行校准 ，确保检测结果的准确性 。
试剂配制与储存
试剂清单
列出所需试剂的名称、规格和数量，并核对试剂 的有效期。
配制方法
按照试剂说明书进行配制，注意配制环境和卫生 条件。
需根据菌落形态、革兰氏染色和生化反应等指标综合判断，以确定是否存在大肠菌 群。
在进行菌落计数时，需遵循无菌操作原则，并对各个稀释度的平板进行计数，以计 算出每克或每毫升样品中的大肠菌群数。
结果报告内容与格式
报告中需包含样品名称、来源、 检测日期、检测方法等信息。
应提供每个稀释度平板上的菌落 数及计算得出的大肠菌群数。
根据检测结果，给出样品是否符 合国家或行业标准的判定结论。
结果审核与确认
对检测结果进行审核，确保数 据的准确性和可靠性。
如发现异常数据或疑问，需要 进行复检或重新实验以确认结 果。
审核无误后，由检测人员签署 报告，并报送相关部门或客户 。
06
CATALOGUE
常见问题与解决方案
微生物限度检查标准操作规程
微生物限度检查标准操作规程《微生物限度检查标准操作规程》一、目的微生物限度检查是药品、食品、化妆品等产品质量的重要指标之一，其目的是为了保障产品的安全性和稳定性。
本标准操作规程旨在规范微生物限度检查的操作流程，确保检查结果的准确性和可靠性。
二、范围本标准操作规程适用于药品、食品、化妆品等产品的微生物限度检查，包括大肠菌群、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母菌等微生物指标的检查。
三、检查设备和试剂1. 培养基：根据不同的微生物指标选择适当的培养基，如大肠培养基、Mannitol盐琼脂、Sabouraud葡萄糖琼脂等。
2. 培养皿：使用符合规定的试验培养皿。
3. 培养箱：保证培养条件的恒温培养箱。
4. 其他常用实验用具：包括无菌采样容器、吸管、移液器、无菌培养皿等。
四、操作流程1. 样品采集：从产品中采集适量样品，保持无菌状态。
2. 制备稀释液：根据样品的特性，选择适当的稀释液将样品进行适当稀释。
3. 接种培养：将稀释后的样品接种在适当的培养基上，并在符合条件的培养箱中进行培养。
4. 观察和统计：观察培养皿中微生物的生长情况，统计出微生物的数量。
5. 结果判定：根据标准规定的微生物限度标准，判断检测结果是否符合规定。
五、质量控制1. 实验员必须进行严格的无菌操作训练，并使用正确的个人防护用具。
2. 培养基的质量必须符合规定，避免培养基带有细菌污染。
3. 检查设备必须经过定期的检查和校准，保持正常的工作状态。
4. 标本的采集、处理、保存和运送必须符合规定，避免外界的污染和干扰。
六、结果报告根据检测结果和规定的限度标准，出具检测报告，标明产品的微生物限度是否符合规定，以及具体的检测结果数据。
七、总结微生物限度检查是产品质量检验的重要环节，严格按照标准操作规程进行操作，可以保证检测结果的准确性和可靠性。
实验员在操作过程中也需严格遵守规程，做好个人防护措施，确保实验室的安全和卫生。
大肠杆菌检测步骤
餐饮具用大肠菌群测试片
采样:
（1）随机抽取消毒后准备使用的各类食具（碗、盘、杯等），取样量可根据大、中、小不同饮食行业每次采样6件～10件，每件贴纸片两张，每张纸片面积25cm²
（5cmX5cm）。
（2）用无菌生理盐水湿润大肠菌群检测用纸片后，立即贴于食具内侧表面，30s后取下，置于无菌塑料袋内.
（3）筷子以5只为一件样品，用灭菌1mL吸管吸取无菌生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约5cm）抹试纸片，每件样品抹拭两张，放入无菌塑料袋内。
培养：
将已采样的纸片置于37℃恒温培养箱中培养16h～18h，取出观察结果。
结果判断：
若纸片保持紫蓝色不变，或有红色斑点但斑点周围无黄晕者为大肠菌群阴性；在红色斑点周围有黄晕，或纸片变黄并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕为阳性。
国家标准规定：在50cm的纸片上（即两片纸片上），大肠菌群不得检出。
大肠菌群测试片操作流程
大肠菌群测试片检测操作流程1.样品的前处理:(建议使用蔬菜瓜果、河水及大肠菌群标准菌作为样品)（1）蔬菜瓜果：称取25g样品切成1cm左右的碎片，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min制成1:10的样品匀液。
（2）河水：以无菌吸管吸取25mL河水置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
（3）大肠杆菌标准菌：挑取平板上大肠杆菌标准菌的单菌落，于盛有5mL LB 液体培养基的试管中，37℃培养过夜，以此作为菌原液。
用1mL无菌吸管或微量移液器吸1mL菌原液于盛有9mL的稀释液的无菌试管中，制成1:10的样品匀液。
2.样本稀释倍数：用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL的稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸管尖端不要触及稀释液面），振荡试管或换用一只无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
按此操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释液需用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCl）调节pH至7.0~7.2。
（1）蔬菜样品的稀释倍数：取100、10-1两个稀释度进行接种验证(可根据实际情况而定)。
（2）河水样品的稀释倍数：取10-1、10-2两个稀释度进行接种验证(可根据实际情况而定)。
（3）大肠菌群标准菌的稀释倍数：取10-7、10-8两个进行接种验证(可根据实际情况而定)。
（4）自来水的稀释倍数：直接取自来水接种进行验证。
3.接种一般食品选1～2个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品（如饮用纯水和矿泉水等）可直接吸取原液进行检测。
将大肠菌群测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管吸取1mL样品匀液垂直加入到测试片中央，用手轻轻将上层盖下，使检测样品液覆盖整个检测圈（应尽量避免产生气泡），静置1 min使培养基凝固，最后用手轻轻将上层盖下。
食品中大肠菌群的检验
食品中大肠菌群的检验简介大肠菌群是指含有大肠菌属（Escherichia coli）和奇异变形杆菌属（Coliform bacteria）的细菌群体。
它们存在于人和动物的肠道中，也可以存在于环境中，如土壤、水体和食品中。
食品中的大肠菌群是导致食品中毒的主要病原体之一。
因此，对食品中大肠菌群的检验非常重要，以确保食品的卫生和安全。
本文将介绍食品中大肠菌群的检验方法和操作流程。
方法和步骤1. 样品采集样品采集是食品中大肠菌群检验的第一步。
根据需要检验的食品种类，选择合适的采样方法。
常见的食品样品包括水果、蔬菜、肉类和乳制品等。
采集样品时，应使用干净无菌的容器，并避免污染。
确保样品的代表性，避免极端状况下的取样，如选择已烂的水果或有明显变质的食品。
2. 样品处理样品处理是为了提取样品中的菌群以进行后续的检测。
处理过程应在无菌条件下进行，以避免外部的污染。
常见的样品处理方法包括：•加入盐水：将样品加入含有氯化钠的缓冲液中，以便菌群的释放。
•搅拌和均质：使用搅拌器或者均质器将样品搅拌均匀，以确保菌群的均匀分布。
•过滤：通过滤膜将样品过滤，以分离固体物质和悬浮物。
3. 培养基选择选择适当的培养基是进行大肠菌群检验的关键。
常用的培养基包括马铃薯葡萄糖琼脂（Plate Count Agar，PCA）、大肠杆菌选择琼脂（MacConkey Agar）、经典蓝琼脂（Eosin Methylene Blue Agar）等。
不同的培养基适用于不同目的的检验。
PCA适用于总菌群计数，MacConkey Agar适用于大肠菌群的选择性检测，Eosin Methylene Blue Agar适用于大肠杆菌的计数和鉴别。
4. 培养和孵育将样品处理后的培养基平板进行孵育。
孵育的时间和温度根据菌群的生长特性而定。
一般情况下，孵育时间为24小时，温度为37摄氏度。
培养过程中，需要注意避免交叉污染。
每个样品应使用独立的培养基平板进行孵育，且标记清楚以区分不同样品。
大肠菌群计数检验步骤
大肠菌群计数检验步骤第一法大肠菌群MPN 计数操作步骤6.1、样品的稀释6.1.1、固体和半固体样品：称取25g 样品，放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8 00or/min-10 000r/min 均质1 min-2 min ，或放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min-2 min ，制成1:10 的样品匀液。
6.1.2、液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品，置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。
6.1.3、样品匀液的pH 值应在6.5-7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸（HCI ）调节。
6.1.4、用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1ml无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
6.1.5、根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10 倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1 次，换用1 支1ml无菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。
6.2、初发酵试验每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如接种量超过1ml，则用双料LST肉汤）, 36℃±1℃培养24h±Zh ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。
记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。
未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。
6.3、复发酵试验用接种环从所有48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐( BGLB）肉汤管中，36℃±1℃培养48h±2h ，观察产气情况。
大肠菌群测定的操作细则
大肠菌群测定的操作细则大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
1 设备和材料1.1 温箱：36±1℃。
1.2 冰箱:0～4℃。
1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。
1.4 天平。
1.5 显微镜。
1.6 均质器或乳钵。
1.7 平皿:直径为90mm。
1.8 试管。
1.9 吸管。
1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
1.11 玻璃珠:直径约5mm。
1.12 载玻片。
1.13 酒精灯。
1.14 试管架。
2 培养基和试剂2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。
2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。
2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。
2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。
2.6 生理盐水。
2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。
3 操作步骤3.1 检样稀释3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。
固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。
3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL 灭菌吸管。
3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。
大肠菌群测定步骤
食品大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测步骤一、培养基制备1、生理盐水氯化钠 8.5g蒸馏水 1000.0ml将氯化钠溶于蒸馏水中，搅拌均匀后用量筒量取225ml分装到各个广口瓶中，1210C高压灭菌15min，备用。
2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤称取37克放入烧杯，将各成分溶解于1000ml蒸馏水中，放电炉子上加热并搅拌均匀，分装于装有倒立发酵管的试管中，每管10ml，装完盖帽，1210C高压灭菌15min，双料培养基除蒸馏水不变外，其余成分加倍。
3、样品制备（在无菌室中进行）（1）固体或半固体样品无菌操作称取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分振摇、混匀，制成1：10的样品稀释液备用。
（2）液体样品以无菌吸管吸取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分混匀，制成1：10的样品稀释液备用。
4、样品稀释用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1ml,沿管壁缓慢注于盛有9ml 生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管混匀，制成1：100的样品匀液。
按照该操作程序，可制备1：1000，1：10000。
等10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管或吸头。
根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。
同时分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
二、大肠菌群的测定（MPN法）1、选取适宜的三个连续稀释度的样品匀液，每个稀释度均接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml。
360C+10C培养24h-48h后，观察倒管内是否有气泡产生，并记录24h和48h内产气的LST肉汤管数。
对未产气的试管，可以轻敲试管壁的方式观察是否有较细小的气泡从管底逸出，如果所有LST肉汤管均未产气，可按。
报告结果；如果LST管有产气，则按下面步骤作证实试验。
mpn计数法大肠菌群检测流程
mpn计数法大肠菌群检测流程大肠菌群检测中的MPN计数法，超有趣的哦！咱先来说说啥是大肠菌群。
大肠菌群呀，就像是一群小调皮，它们住在我们周围的环境里，像土壤呀、水呀，还有好多食物里面也可能有它们的身影呢。
那为啥要检测它们呢？因为它们要是太多了，就可能会让我们身体不舒服，比如肚子疼之类的，所以检测它们可重要啦。
那现在就进入正题，MPN计数法是咋检测大肠菌群的呢？一、样品采集。
这就像是一场寻找大肠菌群的小冒险。
如果是检测水，就得用专门干净的瓶子，在合适的地方取水样。
要是检测食物，那也得按照正确的方法取到有代表性的样品哦。
比如说要检测一块蛋糕，不能只取表面好看的那一点，得从不同的地方取一些，这样才能准确找到可能存在的大肠菌群。
二、样品稀释。
取到样品之后呢，就要开始稀释啦。
就像把一群密密麻麻的小虫子分散开一样。
把样品放到合适的溶液里，然后按照一定的比例不断地稀释。
这个过程得特别小心，要是比例弄错了，后面的检测可就不准啦。
三、接种培养。
这一步就像是给大肠菌群安排一个小房子，让它们在里面生长。
把稀释好的样品接种到专门的培养基里，这些培养基就像是给大肠菌群特制的小餐点，只有它们喜欢吃，然后放到合适的温度和环境里培养。
这个温度可不能随便乱调哦，就像我们人在合适的温度下才舒服，大肠菌群也一样，一般是37℃左右，它们就会快快长大啦。
四、观察结果。
经过一段时间的培养，就可以去看看成果啦。
看看培养基里有没有发生一些特殊的变化，比如说有没有产气呀，有没有菌落长得很特别呀。
如果有产气的现象，那就很可能有大肠菌群在里面开派对呢。
然后根据这些现象，通过一些特殊的表格或者计算方法，就能大概算出样品里大肠菌群的数量啦。
不过在整个过程中呀，一定要特别特别细心。
每一个步骤都像是搭积木，要是有一块搭歪了，整个城堡可就不牢固啦。
而且要保持实验环境的干净整洁，就像我们自己住的小窝一样，干净了才舒服嘛。
要是不小心把别的细菌也带进去了，那可就乱套啦，就分不清哪些是大肠菌群，哪些是不请自来的小客人啦。
食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程
食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程1.目的本标准操作规程的目的是为了能够准确、快速地测定食品中大肠菌群的数量，以便于对食品的卫生状况进行评估。
2.应用范围该操作规程适用于各种食品样品，如肉、鱼、蔬菜、水果等。
3.实验器材和试剂3.1器材：(1)无纤维纸滤纸或滤膜或滤布等过滤介质。
(2)LED 灯或紫外灯。
(3)培养皿、移液器、无毒胶带和显微镜。
(4)电子天平。
(5)水槽和蒸馏水。
3.2试剂：(1)胆盐琼脂培养基。
(2)大肠埃希菌ANTISERUM(可以根据需要添加，如：O157等)。
(3)含有氯化钠、肉汤和酚红的PB(NaCl、pH值7.2±0.2、菜心草浸提液)培养基。
4.操作流程4.1样品的准备样品应当是新鲜的、无病变的，如为肉类样品则需要去除肉骨、制成均匀的细碎物；如为水果蔬菜，则需将其冲洗干净削皮去籽核、制成较小的碎片。
如果是液体样品，需要摇匀，取少量样品进行分析。
(1)将胆盐琼脂培养基先膜切成适当的大小，放置在无菌的培养皿中，静置至凝固(温度约35℃)后，置于4℃左右冷藏备用。
(2)PB培养基的制备：每升PB(NaCl、pH值7.2±0.2、菜心草浸提液)培养基中加入10克肉汤粉和0.01克酚红，用蒸馏水充分搅拌均匀，灭菌后置于4℃左右。
4.3分析程序(1)取样品约10g，加入90mLPB(NaCl、pH值7.2±0.2、菜心草浸提液)中，用搅拌器搅拌1分钟，摇匀后放置2分钟(2分钟后即是样品液体)。
(2)取上述处理好的样品液1mL，加入9mL的PBS(NaCl、pH7.2±0.2)中均匀悬浮。
去除上清后再次悬浮，充分均匀。
(3)取上述悬浮液，利用无菌的吸管分别在胆盐琼脂培养基上均匀涂布(充分在滤纸上滤过)，然后进行相应的实验测定：a.在培养皿边缘涂上大肠埃希菌ANTISERUM(注意稀释)。
b.在光照充足的环境下，在37℃下培养16-18小时。
大肠菌群mpn检验法的流程
大肠菌群mpn检验法的流程大肠菌群MPN检验法是一种用于测定水样和食品中大肠菌群浓度的方法。
其原理基于数值分析法，通过对3杯平行称量水样的不同稀释液进行培养并观察其菌落形态和数量，从而计算出大肠菌群的数量。
以下是大肠菌群MPN检验的详细流程。
步骤一：准备试管、试剂和培养基1. 选择三个或更多的试管，标记上每个试管的编号。
2. 准备9 ml 0.1％碳酸钠液，并在每个试管中加入 10 ml。
3. 在每个试管中加入 1 ml 稀释液1。
4. 在每个试管中加入 1 ml 稀释液2。
5. 在每个试管中加入 1 ml 稀释液3。
6. 在每个试管中加入 9 ml 液体培养基。
可以使用多种不同的培养基，如McConkey 培养基和E.coli/coliforms双层营养琼脂板。
步骤二：制备稀释液1. 制备初次稀释液。
将被测水样取10 ml，加入90 ml稀释液1中，充分混合得到10-1（即1/10）的初次稀释液。
2. 制备第二次稀释液。
在稀释液1中各取1 ml，加入9 ml稀释液2中，充分混合得到10-2（即1/100）的第二次稀释液。
3. 制备第三次稀释液。
在稀释液2中各取1 ml，加入9 ml稀释液3中，充分混合得到10-3（即1/1000）的第三次稀释液。
步骤三：测定大肠菌群1. 从每个试管中取10 ml水样或者是不同浓度的稀释液，加入液体培养基中。
2. 在培养基中进行培养。
大肠菌在摄氏35-37度下，48小时内可以在大部分培养基上生长。
这非常重要因为不同的培养基其菌群生长的时间和数量可能会有所不同。
3. 观察培养结果。
如果在试管中形成了典型的大肠菌落，就说明这个营养基中含有大肠菌。
如没有形成典型菌落，可能需要重新试验。
4. 根据试管中出现大肠菌的情况，使用MPN表来计算每毫升水样中的大肠菌数量。
MPN表是一种标准表格，可以用来对菌落数量进行估算。
步骤四：分析结果MPN值是指每毫升水样中大肠菌群数量的估计值。
大肠检验步骤很详细
大肠菌群检验步骤进入无菌室步骤1．进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌，时间为0。
5—1小时。
2．关灯后0•5小时后放可进入。
3．进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套实验步骤1，进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。
（酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成）2，准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。
3，直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml）4，再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml）5，再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）6，再吸取原液1ml放入盐水管中制成－1梯度的样液7，更换一根吸管，从－1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3根每根各1ml）8，再吸取－1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）9，再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允（注另作3个培养皿：空气空白，把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。
琼脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。
盐水空白，吸1ml 生理盐水放入培养皿中，倒入营养琼脂平铺底部摇匀。
）10，把全部作好的放入培养箱中，温度36C＋－1×C，大肠24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中）11，梯度：－1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成－2梯度为1ml－1梯度样液加入9ml生理盐水配成－3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一样12，如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C，24H＋－2H 。
（接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。
所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面）13，取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复发酵管中，然后再培养36C＋－1C，24H＋＋－2H。
14，再在伊红美兰平板之字形上挑菌，放到载玻片上作镜检。
（方法见标准）15，只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下，才能断定这根管是不合格。
大肠菌群测定步骤
食品大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测步骤一、培养基制备1、生理盐水氯化钠 8.5g蒸馏水 1000.0ml将氯化钠溶于蒸馏水中，搅拌均匀后用量筒量取225ml分装到各个广口瓶中，1210C高压灭菌15min，备用。
2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤称取37克放入烧杯，将各成分溶解于1000ml蒸馏水中，放电炉子上加热并搅拌均匀，分装于装有倒立发酵管的试管中，每管10ml，装完盖帽，1210C高压灭菌15min，双料培养基除蒸馏水不变外，其余成分加倍。
3、样品制备（在无菌室中进行）（1）固体或半固体样品无菌操作称取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分振摇、混匀，制成1：10的样品稀释液备用。
（2）液体样品以无菌吸管吸取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分混匀，制成1：10的样品稀释液备用。
4、样品稀释用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1ml,沿管壁缓慢注于盛有9ml 生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管混匀，制成1：100的样品匀液。
按照该操作程序，可制备1：1000，1：10000。
等10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管或吸头。
根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。
同时分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
二、大肠菌群的测定（MPN法）1、选取适宜的三个连续稀释度的样品匀液，每个稀释度均接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml。
360C+10C培养24h-48h后，观察倒管内是否有气泡产生，并记录24h和48h内产气的LST肉汤管数。
对未产气的试管，可以轻敲试管壁的方式观察是否有较细小的气泡从管底逸出，如果所有LST肉汤管均未产气，可按。
报告结果；如果LST管有产气，则按下面步骤作证实试验。
mpn法检测大肠菌群的流程
mpn法检测大肠菌群的流程一、准备工作。
咱得先把要用的东西都准备好呢。
那都需要啥呢？有培养基呀，像月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤，这可是很关键的东西哦。
还有小试管，得准备好多好多干净的小试管呢。
再有就是移液枪啦，这就像是我们的魔法棒，能准确地吸取各种液体。
当然啦，样品也是必不可少的，如果没有样品，咱检测个啥呀，是不？在准备这些东西的时候呀，可一定要小心，就像照顾小宝贝一样，要保证它们都是干净、无菌的。
二、样品处理。
拿到样品之后，咱不能就直接检测呀。
如果是固体样品，得把它弄成液体的状态呢。
这就好比你要吃一块硬邦邦的饼干，得先把它泡软了才能咽下去一样。
一般是按照一定的比例，把固体样品加到无菌的稀释液里，然后充分地摇晃，让它均匀混合，就像调一杯美味的果汁一样，得让里面的东西都融合好。
要是液体样品呢，那就相对简单一点啦，但也得适当稀释一下，让里面的微生物数量不会太多，不然到时候都数不过来啦。
三、接种。
接下来就是接种这个大工程啦。
用移液枪把处理好的样品液，按照不同的量接种到装有月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤的小试管里。
这就像是给小试管里的培养基送进去一些小客人，也就是可能存在的大肠菌群。
这个接种量可不能马虎哦，多一点少一点都可能影响最后的结果呢。
接种的时候感觉自己就像个小小的科学家，在做着超级精密的实验。
四、培养。
接种完了，就把这些小试管放到培养箱里去啦。
这个培养箱就像是小试管们的小房子，温度和湿度都得刚刚好。
一般是在36℃左右的温度下培养24 - 48小时呢。
在这个过程中呀，小试管里就像一个小小的世界，那些大肠菌群如果存在的话，就在里面悄悄地生长、繁殖。
我们就只能在外面耐心地等着，就像等着小种子发芽一样，心里充满了期待又有点小紧张呢。
五、观察与结果判断。
等培养的时间到了，就可以把小试管拿出来观察啦。
这时候就看小试管里的肉汤有没有变化。
如果有产气的现象，就是小试管里有小气泡，那就有可能有大肠菌群在里面开派对啦。
然后呢，根据不同接种量的小试管的产气情况，去查MPN表，就像查字典一样，从表里面找到对应的大肠菌群最可能数。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
大肠菌群计数检验操作规程
一、目的
建立大肠菌群计数检验的标准操作程序，使操作过程规范化。
二、适用范围
适用于大肠菌群计数的检验操作。
三、职责
1.检验人员
严格按检验操作规程进行检验。
2.QC主管
监督检查执行情况。
四、程序
1.范围
本方法适用于大肠菌群计数（coliforms）的测定
2.术语和定义
2.1 大肠菌群：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性
无芽胞杆菌。
3. 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
3.1 恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃。
3.2冰箱：2℃～5℃。
3.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。
3.4天平：感量为0.1 g。
3.5均质器。
3.6振荡器。
3.7无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸
头。
3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。
3.9无菌培养皿：直径90 mm。
3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
3.11菌落计数器。
4.培养基和试剂
4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A中A.1。
4.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A中A.2
4.3磷酸盐缓冲液：见附录 A中 A.3。
4.4无菌生理盐水：见附录 A中 A.4。
4.5无菌 1 mol/L NaOH：见附录 A中 A.5。
4.6无菌 1 mol/L HCl：见附录 A中 A.6。
5.检验程序
大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。
图1大肠菌群MPN计数法检验程序
6.操作步骤
6.1 样品的稀释
6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。
6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
6.1.3样品匀液的pH值应在6.5～
7.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl 调
节。
6.1.4用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
6.1.5根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1 次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。
6.2初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。
未产气者为大肠菌群阴性。
6.3复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h，观察产气情况。
产气者，计为大肠菌群阳性管。
6.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告
按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表，报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂附录
A.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤
A.1.1成分
胰蛋白胨或胰酪胨20.0 g
氯化钠 5.0 g
乳糖 5.0 g
磷酸氢二钾（K2HPO4） 2.75 g
磷酸二氢钾（KH2PO4） 2.75 g
月桂基硫酸钠0.1 g
蒸馏水 1 000 mL
pH 6.8±0.2
A.1.2制法
将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH。
分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。
121 ℃高压灭菌15 min。
A.2 煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤
A.2.1 成分
蛋白胨10.0 g
乳糖10.0 g
牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液200 mL
0.1%煌绿水溶液13.3 mL
蒸馏水800 mL
pH 7.2±0.1
A.2.2 制法
将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200 mL（将20.0 g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975 mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3 mL，用蒸馏水补足到1000 mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。
121 ℃高压灭菌15 min。
A.3磷酸盐缓冲液
A.3.1成分
磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0 g
蒸馏水500 mL
pH 7.2
A.3.2制法
贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1000 mL后贮存于冰箱。
稀释液：取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1000 mL，分装于适宜容器中，121 ℃高压灭菌15 min。
A.4 无菌生理盐水
A.4.1成分
氯化钠8.5 g
蒸馏水 1 000 mL
A.4.2制法：
称取8.5ｇ氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15 min。
A.5 1mol/L NaOH
A.5.1成分
NaOH 40.0 g
蒸馏水1000 mL
A.5.2制法：
称取40 g氢氧化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min。
A.6 1mol/L HCl
A.6.1成分
HCl 90 mL
蒸馏水 1 000 mL
A.6.2制法
移取浓盐酸90 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，121℃高压灭菌15 min。