蛋白质变性与复性共27页
蛋白质变性与复性
蛋白质相互作用与复合物分离
蛋白质变性
利用变性剂分离和纯化蛋白质复合物 中的各个组分，有助于研究蛋白质之 间的相互作用和复合物的组成。
蛋白质复性
在研究蛋白质相互作用和复合物分离 后，通过复性技术将蛋白质恢复其天 然状态，可用于进一步的功能和结构 研究。
蛋白质优化与改造
蛋白质变性
通过蛋白质变性技术可以去除非必需的氨基酸残基或引入突 变，从而优化蛋白质的稳定性、活性或选择性。
蛋白质复性
复性后的蛋白质可用于进一步的功能和结构研究，以验证优 化和改造的效果。
人工酶设计与合成
蛋白质变性
在人工酶设计与合成过程中，利用变性技术可以去除天然酶中的非必需部分，提 高酶的活性和选择性。
蛋白质复性
复性后的酶可用于催化特定化学反应，以验证人工酶的活性和效果。
生物制药与疫苗开发
蛋白质变性
医疗领域
改进蛋白质检测和诊断技术，提高疾病诊断的准 确性和效率，为患者提供更好的医疗服务。
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蛋白质变性与复性
目录
CONTENTS
• 蛋白质变性 • 蛋白质复性 • 蛋白质变性与复性的应用 • 蛋白质变性与复性的研究进展 • 蛋白质变性与复性的挑战与前景
01 蛋白质变性
定义
蛋白质变性是指蛋白质在某些物理和 化学因素作用下，其特定的空间构象 被破坏，导致理化性质发生改变，生 物学活性丧失的现象。
复性后的蛋白质溶解度增加，有利于其在溶液中的稳 定性。
Байду номын сангаас
03 蛋白质变性与复性的应用
蛋白质结构与功能关系
蛋白质变性
通过改变蛋白质的理化条件，使其空间构象发生改变，从而改变其生物学活性。 有助于研究蛋白质的结构与功能关系，深入了解蛋白质在生物体内的生理作用。
第3章(2) 蛋白质变性与复性
其他——反胶束萃取复性法
反胶束萃取复性与稀释复性相比较
提高复性率的策略
1、二硫键的形成 拥有多重二硫键的蛋白，需要更复杂的再折叠过程， 要求氧化剂和还原剂都在最佳的浓度下，以便于二硫 键的形成。 2、小分子添加物
降低蛋白聚集的策略是使用小分子添加剂，如丙酮、乙 酰、尿素、去污剂、蔗糖、短链醇、DMSO和PEG等。 最常用的是Ｌ－精氨酸、低浓度（1-2M）尿素或盐 酸胍以及去污剂（SDS）。
蛋白质复性时聚集反应的抑制
复性中最重要的是抑制复性过程的聚集反应。
最常用的是使用聚集反应的抑制剂，其原理：
• 稳定正确折叠蛋白质的天然结构， • 降低错误折叠蛋白质的稳定性， • 增加折叠复性中间体的溶解度， • 增加非折叠蛋白质的溶解度， • 减少复性中间体接触发生聚集反应。
蛋白质复性时聚集反应的抑制
第二节 蛋白质变性与 复性
Unfolding and Refolding
变性与复性
• 1931年吴宪教授提出蛋白质变性理论。 若溶液中存在变性剂（酸、碱、盐酸胍、 尿素、重金属、某些有机试剂等）能引起蛋白 质变性。 弱变性条件下，蛋白质部分变性，肽链保 持一定构型；强变性条件下，蛋白质完全变性 肽链伸展成无序随机状态。
包涵体
在E.coli细胞质内高水平表达的外源蛋白质， 尤其是来自真核生物的蛋白质聚集，会形成不溶 性、无生物活性的聚合物---包涵体。
E.coli包涵体
大肠杆菌中的胰乳酶原包含体电镜照片
包涵体
包涵体形成原因：
• 使用高计量基因和强启动子；
• 大肠杆菌细胞质环境条件，如pH、离子强度、高还原 电位，不同于外源蛋白质正确折叠为最终构象条件；
亲合色谱复性
分子伴侣亲合色谱，又称为“折叠色谱”。 为变性蛋白质提供一个中空环状的疏水腔，当 变性蛋白质进入空腔后，可部分避免或完全消 除变性蛋白质分子间的聚集作用，使蛋白质在 疏水环境中进行“结合-释放-再结合”的循环 过程，直到恢复其天然的构象状态。
变性蛋白的复性PPT课件
06 结论
变性蛋白复性的研究意义和价值
生物医学应用
变性蛋白的复性研究有助于理解蛋白质结构和功能的关系，对于疾病诊断和治疗具有重 要意义。例如，某些蛋白质的异常折叠与阿尔茨海默症、帕金森症等神经退行性疾病的 发生密切相关。通过变性蛋白的复性，可以深入探究这些疾病的发病机制，为药物研发
和治疗方法提供新的思路。
复性机理的深入研究
目前对变性蛋白复性的机理仍不完全清楚，需要进一步深入研究。例如，研究不同变性条件对蛋白质 结构的影响、蛋白质复性过程中的动力学行为等，有助于深入理解变性蛋白的复性机理，为复性方法 的改进提供理论支持。
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详细描述
在酸性或碱性环境中，变性蛋白的复性效果较差。而在中性pH值条件下，变性 蛋白的复性效果最佳。这是因为蛋白质在等电点附近的pH值下，其分子间的静 电作用力最小，有利于蛋白质分子的重新折叠和复性。
离子强度
总结词
离子强度对变性蛋白的复性具有重要影响。
详细描述
在低离子强度下，蛋白质分子间的电荷相互作用较强，容易形成聚集物，不利于 复性。而在高离子强度下，蛋白质分子间的电荷相互作用被屏蔽，蛋白质分子更 容易展开和复性。因此，选择适当的离子强度是变性蛋白复性的关键。
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contents
目录
• 引言 • 变性蛋白的形成 • 变性蛋白的复性方法 • 变性蛋白复性的影响因素 • 变性蛋白复性的应用 • 结论
01 引言
目的和背景
介绍变性蛋白复性的研究意义
蛋白质变性后，其结构和功能受到严重影响，导致许多生物 过程紊乱。因此，研究变性蛋白的复性具有重要意义。
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蛋白质变性与复性
5、有机溶剂的影响 有机溶剂的影响
有机溶剂可以影响静电力，氢键和疏水作用， 有机溶剂可以影响静电力，氢键和疏水作用，导 致蛋白质的构象变化，螺旋度增加。 致蛋白质的构象变化，螺旋度增加。 极性有机溶剂破坏蛋白质的氢键 极性有机溶剂破坏蛋白质的氢键 极性有机溶剂破坏蛋白质疏水作用 非极性有机溶剂破坏蛋白质疏水作用
（五）变性蛋白质经过的构象
1、经过盐酸胍变性的蛋白质,肽链完全伸展; 经过盐酸胍变性的蛋白质,肽链完全伸展; 2、经过酸、碱以及热变性的蛋白质，肽链不 经过酸、碱以及热变性的蛋白质， 完全伸展，还保留一部分紧密的构象； 完全伸展，还保留一部分紧密的构象； 3、由高浓度有机熔剂（脂肪醇，氯乙醇等） 由高浓度有机熔剂（脂肪醇，氯乙醇等） 变性的蛋白质，螺旋增加， 变性的蛋白质，螺旋增加，不存在疏水键
二、变性蛋白质的复性
（一）可逆变性和不可逆变性 一 不可逆变性： 不可逆变性： 除去变性因素后, 除去变性因素后,蛋白质构象不能由变性态 恢复到天然态的称不可逆变性。 恢复到天然态的称不可逆变性。
可逆变性
除去变性因素后,在适当的条件下, 除去变性因素后,在适当的条件下,该变性蛋白尚能 恢复其天然构象和生物学活性， 恢复其天然构象和生物学活性，这一现象称为可逆 变性又称蛋白质的复性(renaturation) 变性又称蛋白质的复性( 蛋白质的复性
（三）蛋白质变性的鉴定方法
观察蛋白质的溶解性是否下降、凝集、 1、观察蛋白质的溶解性是否下降、凝集、 变性 ？ 沉淀
以天然蛋白质作对照， 2、以天然蛋白质作对照，测定蛋白质物理性质的变化 旋光法和圆二色性、紫外差示光谱、 旋光法和圆二色性、紫外差示光谱、 粘度法、 粘度法、电泳法
3、测定蛋白质化学性质的变化 侧链基团与专一试剂的反应性, 侧链基团与专一试剂的反应性,蛋白酶对蛋 白质的水解速度 4、沉淀测定蛋白质（酶）的比活性 沉淀测定蛋白质（ 5、测定蛋白质的抗原性是否改变，抗体能否 测定蛋白质的抗原性是否改变， 与抗原专一性结合
第3章(2) 蛋白质变性与复性
各种色谱复性方法的比较
• 凝胶过滤色谱(SEC)复性法：复性分离过程中， 变性蛋白质分子逐渐变小，柱负荷小，产物 浓度低，复性分离时间长，效率较低。
• 离子交换色谱(IEC)复性法：柱负荷大，分离 效果尚好，最常用的变性剂盐酸胍在柱保留， 影响柱容量，且往往与蛋白质一起洗脱，使 盐酸胍的使用受到限制。
缺点：过程缓慢，耗时间长，效率低。
对某些蛋白质复性率高于稀释复性法。
色谱复性法
在色谱过程中实现复性，称为色谱复性法。优点是：
• 色谱固定相对变性蛋白质吸附能力低，甚至完全消除 提高复性质量和活性收率。
达到复性与纯化同时进行的目的。 • 便于回收变性剂，有利于降低废水处理成本。 方法：凝胶过滤色谱(GFC)、离子交换色谱(IEC)、 亲合色谱(AFC).
包涵体的溶解
包涵体的溶解需要打断蛋白质分子内和分子间
的共价键（二硫键）、离子键、疏水作用及静电作
用等，使多肽链伸展。
包涵体的溶解需要强的变性剂，如尿素、盐酸
胍或硫氰酸盐，或表面活性剂，如SDS、十六烷基三 甲基铵氯化物、肌氨酸、正十二烷基肌氨酸钠等； 对于含半胱氨酸的蛋白质，还需加入还原剂，如 巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫基赤藓糖醇、
以金属离子为配体的亲合色谱复性法以金属离子为配体的亲合色谱复性法如以如以nini为亲合配体可与末端标记有组为亲合配体可与末端标记有组氨酸的蛋白质分子有特异的亲合作用而这种氨酸的蛋白质分子有特异的亲合作用而这种作用又不受强变性剂的影响可用于重组蛋白作用又不受强变性剂的影响可用于重组蛋白质的复性
第二节 蛋白质变性与 复性
• ②机械破碎——膜分离除可溶性蛋白——变 性剂溶解包含体——除变性剂复性；
• 路线②应用膜分离技术，用微孔膜除去可溶 性蛋白质，但细胞碎片和包含体一起被膜挡 住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常 常导致可溶性蛋白质的滞留。优点：封闭式 操作，不污染环境也不受环境污染，能量消 耗也比离心法少。
蛋白的变性和复性
蛋白的变性和复性变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。
蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的.蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制.变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。
变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。
引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。
化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。
不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。
蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：（一）生物活性丧失蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。
生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。
有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。
（二）某些理化性质的改变蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。
（三）生物化学性质的改变蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。
蛋白质变性与复性
3、变性剂的影响
尿素、盐酸胍， 甲基乙酰胺、 尿素、盐酸胍，N-甲基乙酰胺、甲基胺等 蛋白质构象破坏（肽链伸展） 蛋白质构象破坏（肽链伸展） 蛋白质寡聚体解离成亚基(巯基乙醇) 蛋白质寡聚体解离成亚基(巯基乙醇) 有些蛋白质还发生凝集和沉淀 变性机制：破坏氢键？？？ 变性机制：破坏氢键？？？ 用途？ 用途？
牛胰核糖核酸酶的变性与复性 （rancreatic ribonuclease)
不少蛋白质的变性之所以不可逆, 不少蛋白质的变性之所以不可逆,主要是所需 条件复杂. 条件复杂. 折叠所需的辅因子 解离与缔合条件的掌握 巯基的保护
(二)蛋白质变性和复性的动力学模型 二 蛋白质变性和复性的动力学模型
二态模型:天然态和变性态,之间有一个阀值, 二态模型:天然态和变性态,之间有一个阀值, 可逆体系, 可逆体系,存在平衡
（五）变性蛋白质经过的构象
1、经过盐酸胍变性的蛋白质,肽链完全伸展; 经过盐酸胍变性的蛋白质,肽链完全伸展; 2、经过酸、碱以及热变性的蛋白质，肽链不 经过酸、碱以及热变性的蛋白质， 完全伸展，还保留一部分紧密的构象； 完全伸展，还保留一部分紧密的构象； 3、由高浓度有机熔剂（脂肪醇，氯乙醇等） 由高浓度有机熔剂（脂肪醇，氯乙醇等） 变性的蛋白质，螺旋增加， 变性的蛋白质，螺旋增加，不存在疏水键
（二）变性概念
涉及构象变化， 涉及构象变化，二硫键的断裂及侧链基团的化学修饰 吴宪： 吴宪： 天然蛋白质分子从紧密有序的结构 松散无序结构的过程。 松散无序结构的过程。 缺点： 缺点：没有与生物活性的变化联系
由于外界因素的作用， 由于外界因素的作用，使天然蛋白质分子 构象发生了异常变化，从而导致生物活性 的构象发生了异常变化，从而导致生物活性 的丧失以及物理、化学性质的异常变化 ， 的丧失以及物理、 以及物理 这种现象称为蛋白质的变性(denaturation 。 这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。
120 第十九章 蛋白质变性与复性
效价 x1000 0.1 0.2 0.5 1 2 5
8.5
9
10
5
3
3
粘稠剂对SCF复性的影响
尿素(M) 效价 x1000 0 7 0.5 8 1 8 1.5 10 2 10 2.5 9
PEG％
效价 X1000 环糊精 ％ 效价 X1000 甘油％
0.1
6
0.2
6
0.5
10
1
10
如果将还原剂和脲同时除去，并且 稀释还原的蛋白并将它于生理pH条件下 暴露在空气中，Rnase A会自发地获得 它的天然构象，恢复正确的二硫键和充 分的酶活性。实验表明正确的二硫键只 有当蛋白质折叠成它的天然构象后才能 形成。
疯牛病是由于蛋白变性引起的
一种名叫Prion（朊病毒 ）的蛋白质 （28KD）已经被证实是疯牛病以及其它相关 疾病，如羊的搔痒症以及人类的海绵状脑病的 致病介质。
2
10
5
8
0.1
8 0.1
0.2
8.5 0.2
0.5
10 0.5
1
10 1
2
9 2
5
9 5
效价 X1000
8.5
8.5
10.
10
9
9
缓冲液浓度对SCF复性的影响
浓度 mmol/ L 效价 x1000
20
50
100
200
500
1000
10
10
10
9
5
3
复性时间和温度对SCF活性的影响
复性时间 （h） 效价 x1000 24 9 48 10 72 10
加脲和 巯基乙醇
核糖核酸酶A变性，酶的三级结 构和活性完全丧失，生成含有8 个巯基的多肽链。
蛋白的变性和复性
蛋白的变性和复性变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。
蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的.蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制.变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。
变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。
引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。
化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。
不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。
蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：（一）生物活性丧失蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。
生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。
有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。
（二）某些理化性质的改变蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。
（三）生物化学性质的改变蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。