pMal c X大肠杆菌表达载体说明
大肠杆菌表达系统
大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。
表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。
大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。
大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。
据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。
与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。
常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。
该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。
大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。
宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。
其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。
PinPoint Xa-1大肠杆菌表达载体说明
PinPoint Xa-1编号 载体名称北京华越洋生物VECT4860 PinPoint X a-‐1PinPoint X a-‐1载体基本信息载体名称: PinPoint X a-‐1质粒类型: 大肠杆菌表达载体；蛋白纯化表达水平: 高启动子: Tac克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 3331 b p5' 测序引物及序列: PinPoint-‐F: c gtgacgcggtgcagggcg3' 测序引物及序列: SP6: A TTTAGGTGACACTATAG载体标签: N-‐Biotin，N-‐Factor X a载体抗性: 氨苄备注: 主要用于生物素标记蛋白生产和纯化。
稳定性: 瞬表达组成型: 组成型病毒/非病毒: 非病毒PinPoint X a-‐1载体质粒图谱和多克隆位点信息PinPoint X a-‐1载体简介PinPoint X a 蛋白纯化系统用来生产和纯化在体内连接了生物素的融合蛋白质。
在一个载体上，将编码需要纯化蛋白质的DNA序列克隆在载体上的一个编码体内添加生物素的短肽序列的下游。
连接生物素的融合蛋白在大肠杆菌内生成，然后用SoftLink软释放抗生物素蛋白树脂亲和纯化。
这个树脂是专利技术，可将蛋白质以非变性形式洗脱出来。
PinPoint载体的特点是含有编码内源蛋白酶因子Xa(发音为Ten a)的蛋白水解位点，使得纯化标签可从天然蛋白上分离。
载体还带有方便得多克隆区域，便于构建融合蛋白。
系统的几个载体含有所有可能的有义读码框，还含有连接着生物素的树脂、一个纯化柱以及生物素，PinPoint Xa对照载体含有氯素酶转乙酰基酶（CAT）基因，作为监控蛋白表达、纯化和加工条件的手段。
在这个系统中，每升培养物一般产生1-‐5 m g蛋白。
PinPoint X a-‐1特点胞内添加生物素标签：用于纯化融合蛋白；得到的许多蛋白质是可溶的。
pBad gIII C大肠杆菌表达载体说明
pBad/gIII C编号 名称北京华越洋VECT-‐430 pBad/gIII CpBadgIII C载体基本信息载体名称: pBad/gIII C， pBadgIII C, p BadgIIIC. p Bad/gIIIC 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达载体表达水平: 高启动子: araBad克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 4149 b p5' 测序引物及序列: pBAD-‐F: A TGCCATAGCATTTTTATCC3' 测序引物及序列: pBAD-‐R: g atttaatctgtatcagg载体标签: N-‐GIII s ignal, C-‐His, C-‐Myc载体抗性: 氨苄备注: -‐-‐稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 诱导表达病毒/非病毒: 非病毒pBadgIII C载体质粒图谱和多克隆位点信息pBadgIII C载体简介pBAD/gIII载体质粒是衍生于pBR322载体。
载体设计用来在大肠杆菌中进行可调节分泌性表达和纯化重组目的蛋白。
使用基因III信号序列来定位重组蛋白，使其分泌到大肠杆菌周质腔中。
使用大肠杆菌araBAD启动子（pBAD）增强了大肠杆菌重组蛋白可溶性表达的水平。
载体上的调节蛋白AraC能够调控pBad启动子。
pBadgIII C载体序列 AAGAAACCAATTGTCCATATTGCATCAGACATTGCCGTCACTGCGTCTTTTACTGGCTCTTCTCGCTAACCA AACCGGTAACCCCGCTTATTAAAAGCATTCTGTAACAAAGCGGGACCAAAGCCATGACAAAAACGCGTAACA AAAGTGTCTATAATCACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAG CATTTTTATCCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATACC CGTTTTTTGGGCTAACAGGAGGAATTAACCATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGTGGTGCCGTTC TATAGCCATAGCACCATGGCGGCCGCTCGAGATCTGCAGCTGGTACCATATGGGAATTCGAAGCTTTCTAGA ACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTAAAC GGTCTCCAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGA AGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCA GAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCA AATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCT GAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACG CCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACA AACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATG CTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGT TTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAG CAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTT ACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTA CTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGC CTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCA ATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGAC TGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGAT AAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGT ATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGT GCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTT CATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAG TTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGC GTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCA ACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAG TTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCT GCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGG TCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTA CAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGG GTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTT CGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGC AACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCT GATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGC AGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATT TCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGC TATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTT GTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCAC CGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCAGATCAATTCGCGCGCGAAGGCGAAGCGGCATGCATAATGTGCCT GTCAAATGGACGAAGCAGGGATTCTGCAAACCCTATGCTACTCCGTCAAGCCGTCAATTGTCTGATTCGTTA CCAATTATGACAACTTGACGGCTACATCATTCACTTTTTCTTCACAACCGGCACGGAACTCGCTCGGGCTGG CCCCGGTGCATTTTTTAAATACCCGCGAGAAATAGAGTTGATCGTCAAAACCAACATTGCGACCGACGGTGG CGATAGGCATCCGGGTGGTGCTCAAAAGCAGCTTCGCCTGGCTGATACGTTGGTCCTCGCGCCAGCTTAAGA CGCTAATCCCTAACTGCTGGCGGAAAAGATGTGACAGACGCGACGGCGACAAGCAAACATGCTGTGCGACGC TGGCGATATCAAAATTGCTGTCTGCCAGGTGATCGCTGATGTACTGACAAGCCTCGCGTACCCGATTATCCA TCGGTGGATGGAGCGACTCGTTAATCGCTTCCATGCGCCGCAGTAACAATTGCTCAAGCAGATTTATCGCCA GCAGCTCCGAATAGCGCCCTTCCCCTTGCCCGGCGTTAATGATTTGCCCAAACAGGTCGCTGAAATGCGGCT GGTGCGCTTCATCCGGGCGAAAGAACCCCGTATTGGCAAATATTGACGGCCAGTTAAGCCATTCATGCCAGT AGGCGCGCGGACGAAAGTAAACCCACTGGTGATACCATTCGCGAGCCTCCGGATGACGACCGTAGTGATGAA TCTCTCCTGGCGGGAACAGCAAAATATCACCCGGTCGGCAAACAAATTCTCGTCCCTGATTTTTCACCACCC CCTGACCGCGAATGGTGAGATTGAGAATATAACCTTTCATTCCCAGCGGTCGGTCGATAAAAAAATCGAGAT AACCGTTGGCCTCAATCGGCGTTAAACCCGCCACCAGATGGGCATTAAACGAGTATCCCGGCAGCAGGGGAT CATTTTGCGCTTCAGCCATACTTTTCATACTCCCGCCATTCAGAG其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-‐52b(+) pAmCyan pDsRed-‐Express2 pBV220 pCold-‐GST pColdS-‐SUMO pCold T F pCold I V pCold I II pCold I IpCold I pE-‐SUMO pCold-‐ProS2 pBAD102/D-‐TOPO pBAD202/D-‐TOPO pACYC184 pBAD/Thio-‐TOPO pBad/Myc-‐His C pBad/Myc-‐His B pBad/Myc-‐His A pBad/His C pBad/His B pBad/His A pBAD-‐TOPO pET-‐23b(+) pET-‐23a(+)pET-‐23c(+) pET-‐23(+) pET-‐12b(+) pET-‐12c(+)pET-‐12a(+) pET-‐11b(+) pET-‐11a(+) pET-‐11c(+) pBad24 pQE-‐82L pQE-‐81L pQE-‐80LpQE-‐32 pQE-‐9 pQE-‐16 pQE-‐31pQE-‐60 pQE-‐70 pQE-‐40 pET-‐51b(+)pET-‐50b(+) pET-‐49b(+) pET-‐48b(+) pET-‐47b(+)pET-‐26b(+) pET-‐32a(+) pET-‐21b(+) pET-‐22b(+)pET-‐14b pET-‐16b pET-‐15b pET-‐19bpET-‐20b(+) pET-‐21d(+) pET-‐21c(+) pET-‐21b(+)pET-‐21a(+) pET-‐24a(+) pET-‐24d(+) pET-‐25b(+)pET-‐27b(+) pET-‐28a(+) pET-‐30a(+) pET-‐42a(+)pET-‐43.1c(+) pET-‐43.1b(+) pET-‐43.1a(+) pET-‐44a(+)pET-‐44c(+) pET-‐46 E K/LIC pET-‐37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-‐His pET302/NT-‐His pRSET-‐CFP pRSET-‐EmGFP pRSET-‐BFP pGFPuvpET300/NT-‐DEST pET301/CT-‐DEST pGEM-‐T pBad43pGEX-‐4T-‐3 pGEX-‐5X-‐2 pBlueScript S K(+) pG-‐Tf2pG-‐KJE8 pGro7 pET-‐SUMO pSE380pET-‐17b pET102/D-‐TOPO pCDFDuet-‐1 pMAL-‐p5xpTf16 pET-‐28c(+) pBluescript I I S K(+) pET-‐30b(+) pSUMO pProEX H Tc pProEX H Tb pProEX H Ta pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript I I K S(-‐) pTYB12pMAL-‐p5e pACYCDuet-‐1 pEGM-‐11ZF(+) pEGM-‐7ZF(+) PinPoint X a-‐3 PinPoint X a-‐2 PinPoint X a-‐1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-‐5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII ApET-‐5a(+) pMal-‐p4X pMal-‐p2G pkk223-‐3pkk232-‐8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-‐c5x pMal-‐p2E pMal-‐p2X pET-‐44 E K/LIC pET-‐43.1 E K/LIC pET-‐41 E K/LIC pMal-‐c4X pTrcHis BpET-‐31b(+) pET-‐3b(+) pET-‐41a(+) pGEX-‐3XpGEX-‐4T-‐2 pETDuet-‐1 pGEX-‐4T-‐1 pTrc99apET-‐28b(+) pET-‐His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-‐6xHN-‐GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-‐KGpGEX-‐2T pRSFDuet-‐1 pCOLADuet-‐1 pTrcHis C pTrcHis A pET-‐41b(+) pET-‐42b(+) pET-‐3a(+) pGEX-‐6P-‐3 pGEX-‐6P-‐2 pGEX-‐6P-‐1 pGEX-‐5X-‐3 pGEX-‐5X-‐1 pGEX-‐2TK pRSET A pMal-‐c2G pMal-‐c2E pMal-‐c2X pRSET C pQE-‐30pET-‐45b(+) pET-‐44b(+) pET-‐42c(+) pET-‐41c(+) pET-‐40b(+) pET-‐33b(+) pET-‐39b(+) pET-‐32 E K/LIC pET-‐32 X a/LIC pET-‐32c(+) pET-‐32b(+) pET-‐30 X a/LIC pET-‐30 E K/LIC pET-‐30c(+) pET-‐29c(+) pET-‐29b(+) pET-‐29a(+) pET-‐24c(+) pET-‐24b(+) pET-‐24(+) pET-‐23d(+) pET-‐11d(+) pBad33。
大肠杆菌表达系统课件
T7 表达系统
T7 噬菌体基因 1 编码的 T7 RNA 聚合酶选择性的激活 T7 噬菌体启 动子的转录。
T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合 酶快 5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌 RNA聚合酶有效转
录的序列。
在细胞中存在 T7 RNA聚合酶和 T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆
在野生型 l 噬菌体中， PL 、 PR 启动子转录与否决定了 l 噬菌体进入
裂解循环还是溶源循环。
你现在学习的是第17页，课件共86页
PL 和 PR 表达系统
转录调控的机理
由 l 噬菌体 PE 启动子控制的 cI 基因的产物是 PL 、 PR 启动子转录的
阻遏物。cI 基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与 噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI
这种方式可以使本底转录降到 很低的水平，尤其适用于表达
对大肠杆菌宿主有毒性的重组
蛋白质。
E.Coli （CE6）
T7 启动子
目的基因
热诱导
T7 RNA 聚合酶
PL 启动子 cI857
T7 RNA 聚合酶基因
你现在学习的是第25页，课件共86页
T7 表达系统
转录调控的机理 双质粒系统 一个质粒带有 T7 RNA 聚合酶 基因，另一个质粒带有 T7 启 动子和目的基因
你现在学习的是第11页，课件共86页
lac、tac 启动子对宿主菌的要求
为了使以 Lac、Tac 表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一
种能产生过量的 LacI 阻遏蛋白的 lacI 基因的突变体 lacIq 被应用于表 达系统。 大肠杆菌 JM109 等菌株的基因型均为 lacIq ，常被选用为 Lac、Tac 表达系统的宿主菌。
大肠杆菌表达系统课件
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3
使用表达优化后的载体，提高表达效率
改进方案提出与实施效果评估
01
02
03
优化培养条件和诱导策 略
调整诱导剂浓度、诱导 时间和温度等参数
使用分阶段诱导策略， 降低蛋白表达速度，促
进正确折叠
改进方案提出与实施效果评估
01
引入伴侣蛋白和辅助因子
02
共表达伴侣蛋白，促进蛋白正确折叠和组装
03
添加辅助因子，提高蛋白稳定性和溶解度
大肠杆菌表达系统实例分析
成功案例展示及经验分享
案例一：高效表达目 标蛋白
优化诱导条件和培养 参数
选择强启动子和合适 载体
成功案例展示及经验分享
目标蛋白表达量高，纯度高 案例二：实现复杂蛋白表达
利用伴侣蛋白和辅助因子
成功案例展示及经验分享
调整诱导时间和温度 成功表达具有生物活性的复杂蛋白
失败案例剖析及原因探讨
学Hale Waihona Puke 实践操作指点实验前准备指点学生熟悉实验器材、 试剂和操作方法，确保实 验顺利进行。
实践操作注意事项
强调实验过程中的安全、 卫生和规范操作，避免误 操作导致实验失败或影响 实验结果。
数据记录与分析
指点学生记录实验数据， 学会分析和解读实验结果 ，培养科学思维和实验技 能。
问题解答与互动讨论
实验原理解答
优化培养温度和时间
降低培养温度、延长培养时间有助于蛋白正确折叠。
改进纯化流程提高效率
选择合适纯化方法
根据蛋白性质选择亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方 法组合使用。
优化纯化条件
调整洗脱液成分、pH值及盐浓度等条件，提高纯化效果。
pMal-c2x质粒图谱及多克隆位点分析
pMalc2x载体基本信息出品公司: NEB载体名称: pMal-c2X, pMalc2X, pMal c2X质粒类型: 大肠杆菌(Escherichia coli)蛋白表达载体表达水平: 高启动子: Tac克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 6646 bp5' 测序引物及序列: MalE引物: 5'-GGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC-3'; MBP-F: 5'-gatgaagccctgaaagacgcgcag-3'3' 测序引物及序列: pBad-R: 5'-gatttaatctgtatcagg-3';M13-F: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'载体标签: N-MBP, N-Factor Xa载体抗性: Ampicillin 氨苄备注: 融合表达麦芽糖结合蛋白MBP，蛋白定位于细胞周质。
产品目录号: E8000S稳定性: 瞬时表达Transient组成型: 诱导表达病毒/非病毒: 非病毒pMalc2x载体质粒图谱和多克隆位点信息pMalc2x载体简介pMalc2x载体序列LOCUS pMAL-c2X 6646 bp DNA circular SYN DEFINITION pMAL-c2XACCESSIONKEYWORDSSOURCEORGANISM other sequences; artificial sequences; vectors.COMMENT This file is created by Vector NTI/COMMENT VNTAUTHORNAME||FEATURES Location/Qualifierssource 1..6646/organism="pMAL-c2X"/mol_type="other DNA"misc_feature 72..1163/label="lacI"CDS 204..1163/label="ORF frame 3"promoter 1407..1435/label="tac_promoter"misc_feature 1447..1469/label="M13_pUC_rev_primer"CDS 1528..2916/label="ORF frame 1"misc_feature 2602..2625/label="MBP_F_primer"promoter complement(2736..2752)/label="M13_forward20_primer"misc_feature complement(2745..2767)/label="M13_pUC_fwd_primer"misc_feature 2745..2888/label="lacZ_a"misc_feature complement(2931..2948)/label="pBAD_rev_primer"misc_feature complement(2931..2948)/label="pTrcHis_rev_primer"terminator 2981..3138/label="rrnB_terminator"terminator 3104..3147/label="rrnB_T1_terminator"terminator 3279..3306/label="rrnB_T2_terminator"promoter 3348..3376/label="AmpR_promoter"gene 3418..4278/label="Ampicillin"/gene="Ampicillin"CDS 3418..4278/label="ORF frame 1"rep_origin complement(4510..4816)/label="f1_origin"rep_origin 4928..5547/label="pBR322_origin"misc_feature 5946..5968/label="pGEX_3_primer"misc_feature complement(5962..6153)/label="ROP"ORIGIN1 CCGACACCAT CGAATGGTGC AAAACCTTTC GCGGTATGGC ATGATAGCGC CCGGAAGAGA61 GTCAATTCAG GGTGGTGAAT GTGAAACCAG TAACGTTATA CGATGTCGCA GAGTATGCCG121 GTGTCTCTTA TCAGACCGTT TCCCGCGTGG TGAACCAGGC CAGCCACGTT TCTGCGAAAA181 CGCGGGAAAA AGTGGAAGCG GCGATGGCGG AGCTGAATTA CATTCCCAAC CGCGTGGCAC241 AACAACTGGC GGGCAAACAG TCGTTGCTGA TTGGCGTTGC CACCTCCAGT CTGGCCCTGC301 ACGCGCCGTC GCAAATTGTC GCGGCGATTA AATCTCGCGC CGATCAACTG GGTGCCAGCG361 TGGTGGTGTC GATGGTAGAA CGAAGCGGCG TCGAAGCCTG TAAAGCGGCG GTGCACAATC421 TTCTCGCGCA ACGCGTCAGT GGGCTGATCA TTAACTATCC GCTGGATGAC CAGGATGCCA481 TTGCTGTGGA AGCTGCCTGC ACTAATGTTC CGGCGTTATT TCTTGATGTC TCTGACCAGA541 CACCCATCAA CAGTATTATT 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原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
重组人白细胞介素-2的原核可溶表达
重组人白细胞介素-2的原核可溶表达李冠英;李海红;徐士勋;潘晓雨【摘要】为探索白细胞介素-2在大肠杆菌中的可溶表达及其生物学活性,利用载体pMAL-c5x将 rhIL-2与MBP融合,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导MBP-rhIL2的表达.接着用Amylose树脂将MBP-rhIL2纯化,最后利用Factor Xa蛋白酶将rhIL-2从融合蛋白中释放.结果显示:MBP-rhIL2以可溶形式表达;Factor Xa成功将rhIL-2从融合蛋白中释放出来;经生物学活性测定,其比活性为4.4×106IU/mg.%This work aims to explore the soluble expression and biological activity of interleukin-2; recombinant fusion protein MBP-rhIL2 was successfully expressed into soluble form in E.coli BL21(DE3). The purification of MBP-rhIL2 was conducted through amy-lose resin. The rhIL-2 was efficiently released by the cleavage of protease Factor Xa from the fusion protein. Bioactivity analysis showed the biological activity of purified rhIL-2 is 4.4 ×106IU/mg.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2018(035)001【总页数】4页(P107-110)【关键词】白细胞介素-2;可溶表达;蛋白纯化【作者】李冠英;李海红;徐士勋;潘晓雨【作者单位】上海华新生物高技术有限公司,上海201206;上海华新生物高技术有限公司,上海201206;上海华新生物高技术有限公司,上海201206;上海华新生物高技术有限公司,上海201206【正文语种】中文【中图分类】Q78;Q591.2;R392.1白细胞介素-2(Interleukine-2，IL-2)，是由白细胞分泌的一种糖蛋白，可介导细胞间的相互作用，在细胞的活化、增殖和分化中起调节作用[1]。
大肠杆菌蛋白表达策略表达系统与表达载体
大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点,是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。
因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。
本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。
大肠杆菌表达系统的选择与构建表达载体的选择根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA等和另外一类就是广泛使用的IPTG 诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。
根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。
融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。
常用的用于亲和纯化融合标签包括Poly-Arg，Poly-His,Strep-TagⅡ，S-tag，MBP等。
其中His-Tag和GST-Tag 是目前使用最多的。
His Tag大多数是连续的六个His融合于目标蛋白的N端或C端，通过His与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。
His标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。
目前常使用的表达载体主要是由Novagen提供的pET系列和Qiagen公司提供的pQE系列。
除了His标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。
它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。
此外，与His相比，GST很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。
蛋白质的原核生物表达与纯化实验大纲
实验一：EV71病毒非结构基因（2b）的克隆一．实验目的通过本实验使学生掌握外源基因克隆的原理和方法二．实验原理基因克隆技术包括把来自不同生物的基因与具有自主复制能力的载体DNA在体外进行人工连接，构建成新的含目的基因的重组载体，然后将其导入受体生物中去进行表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
三．实验用品１. 材料：EV71病毒基因组序列载体pMAL-c2x （Amp抗性）大肠杆菌DH5a２. 器材：离心机、DNA电泳仪、微波炉、试管、摇床、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、培养皿等、三角瓶、天平３. 试剂与药品：氨苄青霉素、碱性裂解液、电泳缓冲液、Rnase A、Taq DNA聚合酶、T4DNA 连接酶、1kb 分子量DNA Marker 、内切酶BamHI和SalI、DNA 片段胶回收试剂盒、X-gal 贮液、 IPTG 贮液、T ris 碱、Na2EDTA、NaCl、CaCl2 、甘油、葡萄糖、酵母提取物、胰蛋白胨、分析纯无水乙醇、95%医用酒精、琼脂糖四．方法与步骤（一）缓冲液及培养基配制1.质粒提取试剂：溶液I：葡萄糖 50m mol/L,Tris-HCl(pH 8.0) 25m mol/L,EDTA(pH8.0) 10mmol/L于6.895×104Pa灭菌15 min，4℃保存。
溶液II：NaOH 0.2 mol/L，SDS 1%。
SDS（10%，200ml）：20 g SDS，慢慢转移到约150ml水的烧杯中，磁力搅拌至溶解，用水定容至200 ml。
溶液III:（0.5M，pH5.2，KAC）,用冰醋酸调pHTE缓冲液：1ml Tris-HCl(1M pH8.0),0.2ml EDTA(0.5M pH8.0),加灭菌水至100ml。
2. LB液体培养基（perliter）:胰蛋白胨10g酵母膏5g pH 7.0NaCl 5g(二).步骤1．碱裂解法抽提质粒实验原理：在 pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的染色体 DNA 变性分开，而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。
大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用
大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是常用的表达宿主。
利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而产生大量目标蛋白。
本文将介绍大肠杆菌表达载体的构建方法及其应用。
一、大肠杆菌表达载体的构建方法1. 选择适合的表达载体：常见的大肠杆菌表达载体包括pET系列、pBAD系列和pGEX系列等。
选择适合的表达载体主要考虑载体的复制起源、选择标记、表达调控元件和蛋白纯化标记等因素。
2. 克隆目标基因：将目标基因通过PCR扩增得到目标基因片段，然后利用限制性内切酶切割载体和目标基因片段，将目标基因片段插入载体中。
3. 进行质粒转化：将构建好的重组质粒导入大肠杆菌中。
可以通过化学法、电穿孔法或热冲击法等方法将质粒导入大肠杆菌中。
4. 筛选与鉴定：经过转化后，利用选择性培养基筛选出含有目标基因的重组大肠杆菌。
通过PCR、限制性酶切和测序等方法对重组菌株进行鉴定，确认目标基因已经成功插入载体。
二、大肠杆菌表达载体的应用1. 蛋白表达：利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而大量产生目标蛋白。
这对于研究蛋白的结构、功能及其在生物学过程中的作用具有重要意义。
2. 蛋白纯化：大肠杆菌表达载体常含有蛋白纯化标记，如His标签、GST标签等。
通过这些标记，可以方便地对目标蛋白进行纯化和检测，为后续研究提供了便利。
3. 蛋白互作研究：大肠杆菌表达载体可以用于蛋白互作研究。
通过将目标蛋白与其他蛋白共同表达，可以研究它们之间的相互作用关系，揭示生物学过程中的分子机制。
4. 疫苗研究：大肠杆菌表达载体可以用于疫苗研究。
将目标抗原基因导入大肠杆菌中进行表达，可以获得大量的抗原蛋白，从而用于疫苗的开发和研究。
5. 酶工程：大肠杆菌表达载体可以用于酶工程研究。
通过将目标酶基因导入大肠杆菌中表达，可以进行酶的产量优化、酶的工艺改造等研究，提高酶的生产效率和稳定性。
大肠杆菌表达载体
pGEX-1T—凝血酶
pGEX-2T---凝血酶
pGEX-3T---X因子
位相载体
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分泌型融合表达载体----pEZZ18
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分泌型表达载体----pINIII-ompA1
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四、表达产物的纯化
1 、包涵体 (inclusion body) 的纯化：许多情况下表达产物 在细胞内形成不溶的颗粒状包涵体，可通过机械法、冻融 法、超声波处理等破碎细胞，离心收集包涵体，洗涤去除 杂蛋白，用盐酸胍、尿素和 SDS 溶解包涵体，再通过一定 的法使蛋白质折叠。 有的经上法得到后仍然有活性，有的蛋白一旦形成包涵体后 就没有活性了，但可作为抗原。 2、可溶性蛋白的纯化：表达的蛋白可以细胞内解物的上清部分用于 纯化目标蛋白，甚至可直接作为粗酶液进行生化反应。
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3 、内含肽表达载体：如 NEB 公司的 Impact-Twin 系 统，将目的蛋白放在两个可自裂解的内含肽 (intein)中间，在得到融合蛋白以后不通过蛋白 酶消解、只需要调节pH值等条件就将标签蛋白切 除。 4 、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙， 可避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠， 或去除N-端甲硫氨酸，以维护活性。 信号肽(signal peptide) 有碱性磷酸酶信号肽、蛋 白质 A 信号肽（如 Amersham 公司的 pEZZ18 系统）。
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2 ） 植 物 Ac-Ds 转 座 子 双 因 子 插 入 突 变 ： 玉 米 Ac (activator) 因子是一个转座子，含有完整的转 座酶， Ds (dissociation) 是 Ac 缺失转座酶基因 的缺失体，但具两端的反向重复序列。
MBP-mCTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达
MBP-mCTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达尚丽平;李武峰【摘要】To construct the prokaryotic expression vector of pMal-C2G-mCTCF and induce the express~f fusion protein,DNA fragments encoding the mouse CTCF were generated by PCR using the plasmid pMXs-3Flag-mCTCF as a template,PCR products were digested with the restriction enzyme EcoR Ⅰ and SalⅠ and cloned into pMal-C2G expression vector.The plasmids were sequenced to confirm that there were no point mutations in the coding sequences.The constructed plasmids were transformed into E.coli BL21 to induce the expression of MBP-mCTCF fusion protein.The fusion protein was analyzed by SDS-PAGE and Coomassie blue staining.The prokaryotic expression plasmids pMal-C2G-mCTCF were successfully constructed,which were testified by bacterial PCR,gene sequence and double restriction enzyme digestion analysis.We also got the suitable conditions for inducing fusion protein expression.The optimized induction condition was 37 ℃ with 10 × 10-4 mol/L IPTG for 6 hours to induce higher amount of MBP-mCTCF fusion protein.%为了构建鼠的CTCF与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白的原核表达载体,并进行原核诱导表达及鉴定,以pMXs-3Flag-mCTCF为模板,PCR扩增得到mCTCF序列,目的基因片段EcoR Ⅰ,SalⅠ双酶切后连接到同样双酶切的pMal-C2G载体上,测序鉴定.将测序正确的质粒转化到E.coli BL21中,用IPTG诱导融合蛋白的表达,用SDS-PAGE分离检测蛋白表达效果.经菌液PCR、测序鉴定、双酶切鉴定证明,得到的重组质粒pMal-C2G-mCTCF构建成功,且成功诱导出了MBP-mCTCF融合蛋白,最佳诱导条件为:10×10-4 mol/L IPTG浓度在37℃诱导6h.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2017(045)005【总页数】4页(P677-679,688)【关键词】CTCF;质粒构建;原核诱导表达【作者】尚丽平;李武峰【作者单位】山西农业大学生命科学学院,山西太谷030801;山西农业大学生命科学学院,山西太谷030801【正文语种】中文【中图分类】Q51CCCTC-结合因子（CTCF）是一种在生物体内广泛表达并在进化上高度保守的蛋白，鼠的CTCF全长736个氨基酸，包括N-末端（氨基端）、C-末端（羧基端）和锌指结构域（CTCF-ZFs）[1]。
大肠杆菌表达系统使用指导
• 如果希望表达的多肽的分子量小于10 kDa, 一定要进行融合表达
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让表达产物可溶化
• 采用MBD融合 • 采用GST融合 • 采用CBD融合 • 采用thioredoxin融合 • 采用Origami等宿主菌 • 降低菌体培养的速度
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3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及 测序。
4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化 。
（三）融合蛋白技术的关键
• 在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的接头序 列( Linker )，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定 性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结 构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免 疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。
• 超滤透析法: 比较省缓冲液, 处理量大; 但费时, 要控制好蛋白质浓度
• 凝胶过滤法: 快速, 可重复性高, 不会产生 沉淀, 操作复杂一点
• 亲和层析复性法, 水相二相法, etc 第21页/共24页
经常碰到的问题
• 表达量不够高； • 包含体在8M尿素中不能溶解； • 重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小； • 带His-tag重组蛋白不吸附到Ni-chelating树脂上； • Ni-chelating分离纯化的效果不好； • GST融合蛋白不吸附到glutathione-Sepharose上； • 包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀； • Ni-chelating错用DTT后发生黑色沉淀该怎么办？ • 贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？ • 某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高
pMAL-C2
pMAL-C2
载体大小：6700 bp。
载体宿主：大肠杆菌（E.coli）细菌抗性：氨苄（Ampicillin）。
测序引物：M13通用引物系列。
载体简介：质粒载体pMAL-C2X是一种高效原核表达载体。
其含有麦芽糖结合蛋白（Maltose BindingProteinase，MBP）的大肠杆菌malE基因。
利用"tac"强启动子和malE转录起始信号，目的基因插入大肠杆菌malE基因下游，表达产物为目的基因与MBP的融合蛋白。
利用麦芽糖与MBP的特异性结合的特点，采用亲合层析的方法分离和纯化融合蛋白。
载体的malE基因与LacZα基因融合，在malE基因与LacZα基因之间有多个限制性酶切位点，可以插入目的基因片段，目的基因的插入导致β-半乳糖苷酶α片段失活，当重组质粒转化α互补的宿主菌如E.ColiTB1后，在X-gal平板上可用蓝白试验筛选阳性克隆。
载体上还携带Laclq 基因，编码Lac抑制因子，加入诱导物IPTG时可高效表达。
用大肠杆菌(Escherichia coli)表达诺如病毒P粒子
用大肠杆菌(Escherichia coli)表达诺如病毒P粒子宋维;李善爽;杨桂华;赵凌侠【摘要】为了研制番茄口服疫苗,按番茄偏爱密码子设计合成了编码诺如病毒(Norovirus,NVs)VA387毒株P粒子(P particles)基因PGENE(1039 bp),并在该基因5′端添加了编码His-tag(6×His)的DNA序列.将构建的原核表达载体pMAL-c2-PGENE导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3 free),用1 mmol/L的IPTG(Isopropyl β-D-l-thiogalactopyranoside)诱导P粒子在BL21(E.coli)中表达.依据SDS-PAGE胶检测结果,对诱导温度(37℃)和时间(6 h)进行了优化,用Western blot技术证实了重组P粒子特异性和免疫活性,为研制番茄口服NVs(VA387)亚基疫苗-P粒子做了必要的准备.%In order to develop edible vaccines via tomato expression system, the gene coding the VA387 Norovirus P particle (designate PGENE)(1 039 bp)was designed and synthesized according to tomato codon usage bias, and DNA sequence of the coded 6 × His-tag was fused into the upstream of the PGENE for purification.Prokaryotic expression vector of the pMAL-c2-PGENE was constructed, and introduced into BL21 (Escherichia coli).The recombinant P particle protein was successfully expressed in BL21 (E.coli)by 1 mmol/L IPTG (Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside) induction.Based on the results of SDS-PAGE assay, the optimized induction conditions including temperature (37 ℃) and time (6 h) was established.The identity of P particle and immunocompetence were confirmed by Western blot.This research will provide indispensable preparation to develop eatable subunit vaccines through the tomato fruit expression systems.【期刊名称】《上海交通大学学报（农业科学版）》【年(卷),期】2011(029)002【总页数】6页(P37-42)【关键词】诺如病毒;P粒子;原核表达系统;亚基疫苗【作者】宋维;李善爽;杨桂华;赵凌侠【作者单位】上海交通大学农业与生物学院,植物生物技术研究中心,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,植物生物技术研究中心,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,植物生物技术研究中心,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,植物生物技术研究中心,上海200240【正文语种】中文【中图分类】Q78;R378.2+1诺如病毒(Norovirus,NVs)是人类非细菌性急性胃、肠炎主要病原;全年均可爆发,冬季属于高发期;可以感染各年龄段人群,特别是婴幼儿、老年人和免疫系统缺陷病人属于易感人群。
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pMal-c2X编号 名称北京华越洋VECT-‐570 pMal-‐c2XpMalc2x载体基本信息载体名称: pMal-‐c2X, p Malc2X, p Mal c2X 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达载体表达水平: 高启动子: Tac克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 6646 b p5' 测序引物及序列: MalE引物: 5'-‐GGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC-‐3'; MBP-‐F: 5'-‐gatgaagccctgaaagacgcgcag-‐3'3' 测序引物及序列: pBad-‐R: 5'-‐gatttaatctgtatcagg-‐3';M13-‐F: 5'-‐TGTAAAACGACGGCCAGT-‐3'载体标签: N-‐MBP, N-‐Factor X a载体抗性: Ampicillin 氨苄备注: 融合表达麦芽糖结合蛋白MBP，蛋白定位于细胞周质。
稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 诱导表达病毒/非病毒: 非病毒pMalc2x载体质粒图谱和多克隆位点信息pMalc2x载体简介pMAL™系统是一种高效的蛋白融合表达及纯化系统。
pMAL载体含有编码麦芽糖结合蛋白（Maltose B inding P rotein, M BP）的大肠杆菌malE基因，其下游的多克隆位点便于目的基因插入，表达N端带有MBP的融合蛋白。
通过"tac"强启动子和malE翻译起始信号使克隆基因获得高效表达，并进一步利用MBP对麦芽糖的亲和性达到用Amylose柱对融合蛋白的一步亲和纯化。
The s ystem u ses t he p MAL v ectors w hich a re d esigned s o t hat i nsertion i nterrupts a l acZα gene allowing a blue-‐to-‐white screen for inserts on X-‐gal (5). pMAL-‐c2 series has an exact deletion of the malE signal sequence, resulting in cytoplasmic expression of the fusion protein. pMAL-‐p2 series contains the normal malE signal sequence, which directs the fusion protein through the cytoplasmic m embrane. p MAL-‐p2 f usion p roteins c apable o f b eing e xported c an b e p urified f rom the p eriplasm. B etween t he m alE s equence a nd t he p olylinker t here i s a s pacer s equence c oding for 10 a sparagine r esidues. T his s pacer i nsulates M BP f rom t he p rotein o f i nterest, i ncreasing t he chances that a particular fusion will bind tightly to the amylose resin. The vectors also include a sequence c oding f or t he r ecognition s ite o f a s pecific p rotease. T his a llows t he p rotein o f i nterest to be cleaved from MBP after purification, without adding any vector-‐derived residues to the protein (6). For this purpose, the polylinker includes a restriction site superimposed on the sequence coding for the site of the specific protease. This is where the gene of interest is inserted. An EcoR I site in the same reading frame as that of λgt11 and a number of other useful sites are present directly downstream. The vectors also include the M13 origin of DNA replication which allows the production of single-‐stranded DNA for sequencing and mutagenesis by i nfecting w ith M13KO7 h elper p hage.pMalc2x载体序列ORIGIN1 CCGACACCAT CGAATGGTGC AAAACCTTTC GCGGTATGGC ATGATAGCGC CCGGAAGAGA 61 GTCAATTCAG GGTGGTGAAT GTGAAACCAG TAACGTTATA CGATGTCGCA GAGTATGCCG 121 GTGTCTCTTA TCAGACCGTT TCCCGCGTGG TGAACCAGGC CAGCCACGTT TCTGCGAAAA 181 CGCGGGAAAA AGTGGAAGCG GCGATGGCGG AGCTGAATTA CATTCCCAAC CGCGTGGCAC 241 AACAACTGGC GGGCAAACAG TCGTTGCTGA TTGGCGTTGC CACCTCCAGT CTGGCCCTGC 301 ACGCGCCGTC GCAAATTGTC GCGGCGATTA AATCTCGCGC CGATCAACTG GGTGCCAGCG 361 TGGTGGTGTC GATGGTAGAA CGAAGCGGCG TCGAAGCCTG TAAAGCGGCG GTGCACAATC 421 TTCTCGCGCA ACGCGTCAGT GGGCTGATCA TTAACTATCC GCTGGATGAC CAGGATGCCA 481 TTGCTGTGGA AGCTGCCTGC ACTAATGTTC CGGCGTTATT TCTTGATGTC TCTGACCAGA 541 CACCCATCAA CAGTATTATT TTCTCCCATG AAGACGGTAC GCGACTGGGC GTGGAGCATC 601 TGGTCGCATT GGGTCACCAG CAAATCGCGC TGTTAGCGGG CCCATTAAGT TCTGTCTCGG 661 CGCGTCTGCG TCTGGCTGGC TGGCATAAAT ATCTCACTCG CAATCAAATT CAGCCGATAG 721 CGGAACGGGA AGGCGACTGG AGTGCCATGT CCGGTTTTCA ACAAACCATG CAAATGCTGA 781 ATGAGGGCAT CGTTCCCACT GCGATGCTGG TTGCCAACGA TCAGATGGCG CTGGGCGCAA 841 TGCGCGCCAT TACCGAGTCC GGGCTGCGCG TTGGTGCGGA TATCTCGGTA GTGGGATACG 901 ACGATACCGA AGACAGCTCA TGTTATATCC CGCCGTTAAC CACCATCAAA CAGGATTTTC 961 GCCTGCTGGG GCAAACCAGC GTGGACCGCT TGCTGCAACT CTCTCAGGGC CAGGCGGTGA 1021 AGGGCAATCA GCTGTTGCCC GTCTCACTGG TGAAAAGAAA AACCACCCTG GCGCCCAATA1081 CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA CGACAGGTTT 1141 CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG TAAGTTAGCT CACTCATTAG 1201 GCACAATTCT CATGTTTGAC AGCTTATCAT CGACTGCACG GTGCACCAAT GCTTCTGGCG 1261 TCAGGCAGCC ATCGGAAGCT GTGGTATGGC TGTGCAGGTC GTAAATCACT GCATAATTCG 1321 TGTCGCTCAA GGCGCACTCC CGTTCTGGAT AATGTTTTTT GCGCCGACAT CATAACGGTT 1381 CTGGCAAATA TTCTGAAATG AGCTGTTGAC AATTAATCAT CGGCTCGTAT AATGTGTGGA 1441 ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACAGGA AACAGCCAGT CCGTTTAGGT GTTTTCACGA 1501 GCACTTCACC AACAAGGACC ATAGCATATG AAAATCGAAG AAGGTAAACT GGTAATCTGG 1561 ATTAACGGCG ATAAAGGCTA TAACGGTCTC GCTGAAGTCG GTAAGAAATT CGAGAAAGAT 1621 ACCGGAATTA AAGTCACCGT TGAGCATCCG GATAAACTGG AAGAGAAATT CCCACAGGTT 1681 GCGGCAACTG GCGATGGCCC TGACATTATC TTCTGGGCAC ACGACCGCTT TGGTGGCTAC 1741 GCTCAATCTG GCCTGTTGGC TGAAATCACC CCGGACAAAG CGTTCCAGGA CAAGCTGTAT 1801 CCGTTTACCT GGGATGCCGT ACGTTACAAC GGCAAGCTGA TTGCTTACCC GATCGCTGTT 1861 GAAGCGTTAT CGCTGATTTA TAACAAAGAT CTGCTGCCGA ACCCGCCAAA AACCTGGGAA 1921 GAGATCCCGG CGCTGGATAA AGAACTGAAA GCGAAAGGTA AGAGCGCGCT GATGTTCAAC 1981 CTGCAAGAAC CGTACTTCAC CTGGCCGCTG ATTGCTGCTG ACGGGGGTTA TGCGTTCAAG 2041 TATGAAAACG GCAAGTACGA CATTAAAGAC GTGGGCGTGG ATAACGCTGG CGCGAAAGCG 2101 GGTCTGACCT TCCTGGTTGA CCTGATTAAA AACAAACACA TGAATGCAGA CACCGATTAC 2161 TCCATCGCAG AAGCTGCCTT TAATAAAGGC GAAACAGCGA TGACCATCAA CGGCCCGTGG 2221 GCATGGTCCA ACATCGACAC CAGCAAAGTG AATTATGGTG TAACGGTACT GCCGACCTTC 2281 AAGGGTCAAC CATCCAAACC GTTCGTTGGC GTGCTGAGCG CAGGTATTAA CGCCGCCAGT 2341 CCGAACAAAG AGCTGGCAAA AGAGTTCCTC GAAAACTATC TGCTGACTGA TGAAGGTCTG 2401 GAAGCGGTTA ATAAAGACAA ACCGCTGGGT GCCGTAGCGC TGAAGTCTTA CGAGGAAGAG 2461 TTGGCGAAAG ATCCACGTAT TGCCGCCACT ATGGAAAACG CCCAGAAAGG TGAAATCATG 2521 CCGAACATCC CGCAGATGTC CGCTTTCTGG TATGCCGTGC GTACTGCGGT GATCAACGCC 2581 GCCAGCGGTC GTCAGACTGT CGATGAAGCC CTGAAAGACG CGCAGACTAA TTCGAGCTCG 2641 AACAACAACA ACAATAACAA TAACAACAAC CTCGGGATCG AGGGAAGGAT TTCAGAATTC 2701 GGATCCTCTA GAGTCGACCT GCAGGCAAGC TTGGCACTGG CCGTCGTTTT ACAACGTCGT 2761 GACTGGGAAA ACCCTGGCGT TACCCAACTT AATCGCCTTG CAGCACATCC CCCTTTCGCC 2821 AGCTGGCGTA ATAGCGAAGA GGCCCGCACC GATCGCCCTT CCCAACAGTT GCGCAGCCTG 2881 AATGGCGAAT GGCAGCTTGG CTGTTTTGGC GGATGAGATA AGATTTTCAG CCTGATACAG 2941 ATTAAATCAG AACGCAGAAG CGGTCTGATA AAACAGAATT TGCCTGGCGG CAGTAGCGCG 3001 GTGGTCCCAC CTGACCCCAT GCCGAACTCA GAAGTGAAAC GCCGTAGCGC CGATGGTAGT 3061 GTGGGGTCTC CCCATGCGAG AGTAGGGAAC TGCCAGGCAT CAAATAAAAC GAAAGGCTCA 3121 GTCGAAAGAC TGGGCCTTTC GTTTTATCTG TTGTTTGTCG GTGAACGCTC TCCTGAGTAG 3181 GACAAATCCG CCGGGAGCGG ATTTGAACGT TGCGAAGCAA CGGCCCGGAG GGTGGCGGGC 3241 AGGACGCCCG CCATAAACTG CCAGGCATCA AATTAAGCAG AAGGCCATCC TGACGGATGG 3301 CCTTTTTGCG TTTCTACAAA CTCTTTTTGT TTATTTTTCT AAATACATTC AAATATGTAT 3361 CCGCTCATGA GACAATAACC CTGATAAATG CTTCAATAAT ATTGAAAAAG GAAGAGTATG 3421 AGTATTCAAC ATTTCCGTGT CGCCCTTATT CCCTTTTTTG CGGCATTTTG CCTTCCTGTT 3481 TTTGCTCACC CAGAAACGCT GGTGAAAGTA AAAGATGCTG AAGATCAGTT GGGTGCACGA 3541 GTGGGTTACA TCGAACTGGA TCTCAACAGC GGTAAGATCC TTGAGAGTTT TCGCCCCGAA 3601 GAACGTTCTC CAATGATGAG CACTTTTAAA GTTCTGCTAT GTGGCGCGGT ATTATCCCGT 3661 GTTGACGCCG GGCAAGAGCA ACTCGGTCGC CGCATACACT ATTCTCAGAA TGACTTGGTT3721 GAGTACTCAC CAGTCACAGA AAAGCATCTT ACGGATGGCA TGACAGTAAG AGAATTATGC 3781 AGTGCTGCCA TAACCATGAG TGATAACACT GCGGCCAACT TACTTCTGAC AACGATCGGA 3841 GGACCGAAGG AGCTAACCGC TTTTTTGCAC AACATGGGGG ATCATGTAAC TCGCCTTGAT 3901 CGTTGGGAAC CGGAGCTGAA TGAAGCCATA CCAAACGACG AGCGTGACAC CACGATGCCT 3961 GTAGCAATGG CAACAACGTT GCGCAAACTA TTAACTGGCG AACTACTTAC TCTAGCTTCC 4021 CGGCAACAAT TAATAGACTG GATGGAGGCG GATAAAGTTG CAGGACCACT TCTGCGCTCG 4081 GCCCTTCCGG CTGGCTGGTT TATTGCTGAT AAATCTGGAG CCGGTGAGCG TGGGTCTCGC 4141 GGTATCATTG CAGCACTGGG GCCAGATGGT AAGCCCTCCC GTATCGTAGT TATCTACACG 4201 ACGGGGAGTC AGGCAACTAT GGATGAACGA AATAGACAGA TCGCTGAGAT AGGTGCCTCA 4261 CTGATTAAGC ATTGGTAACT GTCAGACCAA GTTTACTCAT ATATACTTTA GATTGATTTA 4321 CCCCGGTTGA TAATCAGAAA AGCCCCAAAA ACAGGAAGAT TGTATAAGCA AATATTTAAA 4381 TTGTAAACGT TAATATTTTG TTAAAATTCG CGTTAAATTT TTGTTAAATC AGCTCATTTT 4441 TTAACCAATA GGCCGAAATC GGCAAAATCC CTTATAAATC AAAAGAATAG ACCGAGATAG 4501 GGTTGAGTGT TGTTCCAGTT TGGAACAAGA GTCCACTATT AAAGAACGTG GACTCCAACG 4561 TCAAAGGGCG AAAAACCGTC TATCAGGGCG ATGGCCCACT ACGTGAACCA TCACCCAAAT 4621 CAAGTTTTTT GGGGTCGAGG TGCCGTAAAG CACTAAATCG GAACCCTAAA GGGAGCCCCC 4681 GATTTAGAGC TTGACGGGGA AAGCCGGCGA ACGTGGCGAG AAAGGAAGGG AAGAAAGCGA 4741 AAGGAGCGGG CGCTAGGGCG CTGGCAAGTG TAGCGGTCAC GCTGCGCGTA ACCACCACAC 4801 CCGCCGCGCT TAATGCGCCG CTACAGGGCG CGTAAAAGGA TCTAGGTGAA GATCCTTTTT 4861 GATAATCTCA TGACCAAAAT CCCTTAACGT GAGTTTTCGT TCCACTGAGC GTCAGACCCC 4921 GTAGAAAAGA TCAAAGGATC TTCTTGAGAT CCTTTTTTTC TGCGCGTAAT CTGCTGCTTG 4981 CAAACAAAAA AACCACCGCT ACCAGCGGTG GTTTGTTTGC CGGATCAAGA GCTACCAACT 5041 CTTTTTCCGA AGGTAACTGG CTTCAGCAGA GCGCAGATAC CAAATACTGT CCTTCTAGTG 5101 TAGCCGTAGT TAGGCCACCA CTTCAAGAAC TCTGTAGCAC CGCCTACATA CCTCGCTCTG 5161 CTAATCCTGT TACCAGTGGC TGCTGCCAGT GGCGATAAGT CGTGTCTTAC CGGGTTGGAC 5221 TCAAGACGAT AGTTACCGGA TAAGGCGCAG CGGTCGGGCT GAACGGGGGG TTCGTGCACA 5281 CAGCCCAGCT TGGAGCGAAC GACCTACACC GAACTGAGAT ACCTACAGCG TGAGCTATGA 5341 GAAAGCGCCA CGCTTCCCGA AGGGAGAAAG GCGGACAGGT ATCCGGTAAG CGGCAGGGTC 5401 GGAACAGGAG AGCGCACGAG GGAGCTTCCA GGGGGAAACG CCTGGTATCT TTATAGTCCT 5461 GTCGGGTTTC GCCACCTCTG ACTTGAGCGT CGATTTTTGT GATGCTCGTC AGGGGGGCGG 5521 AGCCTATGGA AAAACGCCAG CAACGCGGCC TTTTTACGGT TCCTGGCCTT TTGCTGGCCT 5581 TTTGCTCACA TGTTCTTTCC TGCGTTATCC CCTGATTCTG TGGATAACCG TATTACCGCC 5641 TTTGAGTGAG CTGATACCGC TCGCCGCAGC CGAACGACCG AGCGCAGCGA GTCAGTGAGC 5701 GAGGAAGCGG AAGAGCGCCT GATGCGGTAT TTTCTCCTTA CGCATCTGTG CGGTATTTCA 5761 CACCGCATAT ATGGTGCACT CTCAGTACAA TCTGCTCTGA TGCCGCATAG TTAAGCCAGT 5821 ATACACTCCG CTATCGCTAC GTGACTGGGT CATGGCTGCG CCCCGACACC CGCCAACACC 5881 CGCTGACGCG CCCTGACGGG CTTGTCTGCT CCCGGCATCC GCTTACAGAC AAGCTGTGAC 5941 CGTCTCCGGG AGCTGCATGT GTCAGAGGTT TTCACCGTCA TCACCGAAAC GCGCGAGGCA 6001 GCTGCGGTAA AGCTCATCAG CGTGGTCGTG CAGCGATTCA CAGATGTCTG CCTGTTCATC 6061 CGCGTCCAGC TCGTTGAGTT TCTCCAGAAG CGTTAATGTC TGGCTTCTGA TAAAGCGGGC 6121 CATGTTAAGG GCGGTTTTTT CCTGTTTGGT CACTGATGCC TCCGTGTAAG GGGGATTTCT 6181 GTTCATGGGG GTAATGATAC CGATGAAACG AGAGAGGATG CTCACGATAC GGGTTACTGA 6241 TGATGAACAT GCCCGGTTAC TGGAACGTTG TGAGGGTAAA CAACTGGCGG TATGGATGCG 6301 GCGGGACCAG AGAAAAATCA CTCAGGGTCA ATGCCAGCGC TTCGTTAATA CAGATGTAGG6361 TGTTCCACAG GGTAGCCAGC AGCATCCTGC GATGCAGATC CGGAACATAA TGGTGCAGGG 6421 CGCTGACTTC CGCGTTTCCA GACTTTACGA AACACGGAAA CCGAAGACCA TTCATGTTGT 6481 TGCTCAGGTC GCAGACGTTT TGCAGCAGCA GTCGCTTCAC GTTCGCTCGC GTATCGGTGA 6541 TTCATTCTGC TAACCAGTAA GGCAACCCCG CCAGCCTAGC CGGGTCCTCA ACGACAGGAG 6601 CACGATCATG CGCACCCGTG GCCAGGACCC AACGCTGCCC GAAATT//其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-‐52b(+) pAmCyanpDsRed-‐Express2 pBV220 pCold-‐GST pColdS-‐SUMOpCold T F pCold I V pCold I II pCold I IpCold I pE-‐SUMO pCold-‐ProS2 pBAD102/D-‐TOPOpBAD202/D-‐TOPO pACYC184 pBAD/Thio-‐TOPO pBad/Myc-‐His CpBad/Myc-‐His B pBad/Myc-‐His A pBad/His C pBad/His BpBad/His A pBAD-‐TOPO pET-‐23b(+) pET-‐23a(+)pET-‐23c(+) pET-‐23(+) pET-‐12b(+) pET-‐12c(+)pET-‐12a(+) pET-‐11b(+) pET-‐11a(+) pET-‐11c(+)pBad24 pQE-‐82L pQE-‐81L pQE-‐80LpQE-‐32 pQE-‐9 pQE-‐16 pQE-‐31pQE-‐60 pQE-‐70 pQE-‐40 pET-‐51b(+)pET-‐50b(+) pET-‐49b(+) pET-‐48b(+) pET-‐47b(+)pET-‐26b(+) pET-‐32a(+) pET-‐21b(+) pET-‐22b(+)pET-‐14b pET-‐16b pET-‐15b pET-‐19bpET-‐20b(+) pET-‐21d(+) pET-‐21c(+) pET-‐21b(+)pET-‐21a(+) pET-‐24a(+) pET-‐24d(+) pET-‐25b(+)pET-‐27b(+) pET-‐28a(+) pET-‐30a(+) pET-‐42a(+)pET-‐43.1c(+) pET-‐43.1b(+) pET-‐43.1a(+) pET-‐44a(+)pET-‐44c(+) pET-‐46 E K/LIC pET-‐37b(+) pTrcHis2 CpTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-‐His pET302/NT-‐HispRSET-‐CFP pRSET-‐EmGFP pRSET-‐BFP pGFPuvpET300/NT-‐DEST pET301/CT-‐DEST pGEM-‐T pBad43pGEX-‐4T-‐3 pGEX-‐5X-‐2 pBlueScript S K(+) pG-‐Tf2pG-‐KJE8 pGro7 pET-‐SUMO pSE380pET-‐17b pET102/D-‐TOPO pCDFDuet-‐1 pMAL-‐p5xpTf16 pET-‐28c(+) pBluescript I I S K(+) pET-‐30b(+)pSUMO pProEX H Tc pProEX H Tb pProEX H TapKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript I I K S(-‐) pTYB12pMAL-‐p5e pACYCDuet-‐1 pEGM-‐11ZF(+) pEGM-‐7ZF(+)PinPoint X a-‐3 PinPoint X a-‐2 PinPoint X a-‐1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-‐5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII ApET-‐5a(+) pMal-‐p4X pMal-‐p2G pkk223-‐3pkk232-‐8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-‐c5x pMal-‐p2E pMal-‐p2X pET-‐44 E K/LIC pET-‐43.1 E K/LIC pET-‐41 E K/LIC pMal-‐c4X pTrcHis B pET-‐31b(+) pET-‐3b(+) pET-‐41a(+) pGEX-‐3X pGEX-‐4T-‐2 pETDuet-‐1 pGEX-‐4T-‐1 pTrc99a pET-‐28b(+) pET-‐His pALEX a,b,c pACYC177 pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10 pEcoli-‐6xHN-‐GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-‐KG pGEX-‐2T pRSFDuet-‐1 pCOLADuet-‐1 pTrcHis C pTrcHis A pET-‐41b(+) pET-‐42b(+) pET-‐3a(+) pGEX-‐6P-‐3 pGEX-‐6P-‐2 pGEX-‐6P-‐1 pGEX-‐5X-‐3 pGEX-‐5X-‐1 pGEX-‐2TK pRSET A pMal-‐c2G pMal-‐c2E pMal-‐c2X pRSET C pQE-‐30pET-‐45b(+) pET-‐44b(+) pET-‐42c(+) pET-‐41c(+) pET-‐40b(+) pET-‐33b(+) pET-‐39b(+) pET-‐32 E K/LIC pET-‐32 X a/LIC pET-‐32c(+) pET-‐32b(+) pET-‐30 X a/LIC pET-‐30 E K/LIC pET-‐30c(+) pET-‐29c(+) pET-‐29b(+) pET-‐29a(+) pET-‐24c(+) pET-‐24b(+) pET-‐24(+) pET-‐23d(+) pET-‐11d(+) pBad33。