纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定
纤维素酶酶活的测定方法
检测分析纤维素酶酶活的测定方法河南省科学院生物研究所 刘德海 杨玉华 安明理河南省饲料产品质量监督检验站 陈小鸽 饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用,对其质量检测显得日益重要。
纤维素酶是一种复合酶,按作用底物的能力划分为两部分,一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶,称为C1酶;另一部分是对羧甲基纤维素钠(Na-CMC)起水解作用的酶,称为C x酶。
据此,一般采用两种测定方法,一种是适用于C X酶的CMC法,另一种是适用于C1酶的滤纸法。
下面就此两种方法作一介绍。
1 C MC(羧甲基纤维素)法1.1 材料1.1.1 饲用纤维素酶 由河南省科学院生物研究所提供。
1.1.2 试剂 磷酸氢二钠、柠檬酸、羧甲基纤维素、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。
1.1.3 仪器 721型分光光度计、恒温水浴锅、PHS-2酸度计、秒表。
1.1.4 试剂配制1.1.4.1 pH5.0柠檬酸缓冲液 制取0.2mol/L 磷酸氢二钠液(称取7.16g磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中,定容至100mL)和0.1mol/L的柠檬酸液(称取2.1g柠檬酸溶解于蒸馏水中,定容至100 mL),取磷酸氢二钠液24.3mL、柠檬酸液25.7mL 混匀,用精密酸度计测至pH值为5.0。
1.1.4.2 羧甲基纤维素溶液 准确称取2.0g羧甲基纤维素钠盐溶于200mL水中,沸水浴中加热至溶化,过滤,取滤液100mL,加柠檬酸缓冲液20 mL、蒸馏水40mL,混匀,贮存于冰箱中备用。
1.1.4.3 3,5-二硝基水杨酸显色液 准确称取6.3g3,5-二硝基水杨酸置于2mol/L氢氧化钠262mL溶液中,然后加酒石酸钾钠的热溶液(182.0g酒石酸钾钠溶于500mL水中),再加5.0 g苯酚和5.0g亚硫酸钠,搅拌至溶解,冷却后定容至1000mL,贮于棕色瓶中置冰箱中备用。
1.1.4.4 0.1%标准葡萄糖溶液 准确称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖250.000mg,溶于蒸馏水中,定容至250mL。
纤维素酶活力测定方法
纤维素酶活力测定方法纤维素酶活力测定方法很多，主要原因是纤维素酶种类繁多、来源很广，不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大，其次纤维素酶作用的底物比较复杂，反应产物不同，致使纤维素酶活力的测定方法复杂而不统一。
近年来随着多种交叉学科的快速发展，生物化学、分子生物学以及基因工程等相关领域的研究，促进了更多更新的纤维素酶活测定以及动力学研究方法的出现。
纤维素酶酶活测定方法——传统检测方法曾报道过传统纤维素酶测定方法很多，如微晶纤维素酶活测定方法、滤纸酶活(FPA)测定方法、水杨什酶活测定方法、、染色纤维素法、滤纸崩溃法、棉线切断法、梭甲基纤维素钠盐(CMC-Na)酶活性测定方法、棉花糖法、CMC粘度降低法、荧光定糖法平板法。
纤维素酶系总的糖化能力的测定常见有三种一是通过测定荧光物质的荧光强度的大小，来计算其还原糖含量的荧光法，其主要是根据还原糖与反应液生成荧光物质。
二是滤纸酶活(FPA)测定法，纤维素酶系总的糖化能力，通过以滤纸为底物经纤维素酶水解后生成的还原糖的量表征，因为滤纸是聚合度和结晶度都居“中等”的纤维性材料。
三是滤纸崩溃法，以滤纸完全崩溃为粉末状所需的时间来表征纤维素酶的活力，在容器内加入缓冲液和适当稀释的酶液，放入一定尺寸的滤纸条，一定温度条件下反复振荡。
外切葡萄糖什酶活力的测定有棉花糖化法方法和微晶纤维素酶活测定方法两种。
两者均采用DNS显色法，通过计算还原糖的量来表征外切葡萄糖什酶活力，主要是利用纤维素酶降解微晶纤维素、棉。
纤维素酶中内切葡萄糖什酶对CMC-Na有降解能力，因此内切葡萄糖什酶活力的表征主要为CMC-Na酶活性测定方法。
用标准葡萄糖溶液作标准曲线，通过DNS 法显色，针对内切葡萄糖什酶与CMC-Na降解生成的葡萄糖等还原糖，以每分钟生成相当于1 I} mol的葡萄糖所需酶量定义为一个酶活性单位，使用分光光度计测其吸光度。
B一葡萄糖什酶活性的测定常用方法有三种:一是将它们衍生为无荧光的底物，因为伞形酮(7一羚基香豆素)与4一甲基伞形酮具有强烈荧光的特点，使用荧光法进行测定;二是Banish和Swiain法，它以水杨什作底物，使释放出来的水杨醇显色(或DNS显色)，酶解产物用4一氨基安替比林作显色剂，再用分光光度法比色测定;三是以对一硝基苯一I}一葡萄糖什为底物进行酶解，底物水解后释放出的配基对硝基苯酚可直接在100}120nm波长范围内测定。
[知识]两种常用纤维素酶活力测定方法---滤纸酶活-CMC酶活
![[知识]两种常用纤维素酶活力测定方法---滤纸酶活-CMC酶活](https://img.taocdn.com/s3/m/42357e4776232f60ddccda38376baf1ffc4fe322.png)
检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(FPA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(FPA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6cm)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴lOmin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmin后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlOOO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
W：为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。
N：为酶液稀释总倍数。
T：为反应时间。
M：为样品的体积。
4、葡萄糖标准曲线绘制方法标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。
纤维素酶酶活测定可编辑全文
纤维素酶酶活测定纤维素酶活测定方法一、原理纤维素酶能将纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，具有还原性末端的纤维二糖糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应。
反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。
酶活定义纤维素酶活力单位是指55℃、pH5.0的条件下，以每分钟催化羧甲基纤维素钠水解生成1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。
二、实验试剂羧甲基纤维素钠（聚合度1700-2000），内切纤维素酶（苏柯汉）50mmol NaAC-HAC、DNS试剂三、实验仪器容量瓶（1000ml ×2、500 ml×3、100 ml ×4、50ml×4 ml）、移液器、烧杯（500ml×3、50ml×3）、具塞试管、电热套、水浴锅、分光光度计、pH计、电子天平四、标准曲线的绘制五、酶活测定由于苏柯汉给定的pH范围为4.8-5.2，故选用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液测定纤维素酶酶活。
1、样品的制备CMC-Na溶液的制备：用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液配置0.5%的CMC-Na （羧甲基纤维素钠）溶液，准确称量CMC-Na0.05g，精确至0.001g，溶于蒸馏水中，45℃水浴锅中搅拌溶解，冷却后定容至100ml。
纤维素酶液的制备：准确称取纤维素酶，精确到0.001g。
用50mmol NaAC-HAC pH5.0的缓冲液配置成适当的浓度10000倍，保证吸光度在0.2-0.6之间。
2、DNS法测酶活：取1.8ml 0.5% CMC-Na的溶液于25ml 具塞刻度试管中，55℃预热10min左右，加入0.2ml 适当稀释的酶液，于55℃水浴锅中保温30min后，然后加2ml DNS，混匀，沸水浴5min，冷却至室温，定容到25ml。
混匀测OD540nm。
纤维素酶活力的测定
纤维素酶液中各种酶的作用方式图
2.2 纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原
糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成 红棕色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一 定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利 用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。
3.器材和试剂
3.1器材：
水浴锅、 分光光度计、 记时器、 比色管（4支+6支）、 移液管（5支）、 吸耳球
3.2试剂（公用）： 如下
1 ） D N S试剂
称取3 , 5 一 二硝基水杨酸( 1 0 10 . 1 ) g，置于约6 0 0 m L水中，逐渐 加入氢氧化钠l o g ，在5 0 ℃水浴中( 磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸 甲钠2 0 0 g 、苯酚( 重蒸) 2 g 和无水亚硫酸钠5 g ，待全部溶解并澄清后， 冷却至室温，用水定容至 I O O O m L ，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于 暗处放置7 d 后使用。
性回归系数应在0 . 9 9 9ห้องสมุดไป่ตู้0以上时方可使用( 否则须重做) 。
4 . 2 样 品的测定
4 . 2 . 1 待测酶液的制备 称取酶样1 g , 精确至0 . 1 m g ( 或吸取液体酶样1 mL ， 精
确至0 . 0 1 m L ) ， 用水（柠檬酸缓冲液，0.05 mol/LpH4.8） 溶解100ml(100倍），之后分别做200倍、400倍、600倍、800 倍稀释， 磁力搅拌混匀， 准确稀释定容 放置1 0 m i n ， 待测。 4 . 2 . 2 滤纸条的准备
有最大光吸收，由此，可根据测得的吸光值与葡萄糖浓度的关
系来计算纤维素酶的活力（FPA）。
两种常用纤维素酶活力测定方法滤纸酶活-CMC酶活
检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(F PA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1mi n催化纤维素生成lu g葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(F PA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液l ml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6c m)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴l Omin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmi n后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlO OO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
纤维素酶的CMC酶活测定条件的研究
网络出版时间：2012-11-06 14:59网络出版地址：/kcms/detail/11.1759.TS.20121106.1459.006.html纤维素酶的CMC酶活测定条件的研究孙盈田永强赵丽坤(兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃兰州730070)摘要：本实验研究和分析了CMC酶活性测定法的实验条件。
通过单因素实验对酶促反应时间、酶促反应温度、pH、测定波长、底物浓度、粗酶液和底物添加量六个影响因素进行了研究。
最后结合正交实验、方差分析和多重比较,确定了纤维素酶活力测定的最佳条件组合。
结果表明，在pH6.2、粗酶液和底物添加量各为2mL的情况下，影响纤维素酶活力测定的主次因素依次为酶促反应时间、酶促反应温度、测定波长和底物浓度。
纤维素酶活力测定的最佳条件为：在酶促反应温度为40℃，pH6.2，底物浓度为10g/L，粗酶液和底物添加量各为2mL，酶促反应时间30min，测定波长为520nm。
关键词：纤维素酶，酶活力测定，条件Study on The Optimum Conditions of Determination of Cellulase ActivitySun Ying Tian Yongqiang Zhao Likun(School of Chemical and Biological Engineering, Lanzhou Jiaotong University，Lanzhou 730070,China)Abstract: The experimental conditions of CMC enzyme activity assay were researched. Six influencing factors:enzymatic reaction time, reaction-temperature, pH, detective wavelength, substrate concentration, crude enzymeand substrate addition were studied by a single factor test. Finally, orthogonal experiment, variance analysis andmultiple comparisons were married together, and the optimum conditions of determination of CMC enzymeactivity were determined. The results showed that, when the volume of crude enzyme and substrate were 2mL andpH6.2, the primary and secondary factors which affected cellulase activity were enzymatic reaction time, reactiontemperature, enzymatic determination of wavelength and substrate concentration. Experiments showed that: theenzymatic reaction temperature 40℃, pH6.2, substrate concentration 10g/L, the volume of crude enzyme andsubstrate were 2mL, enzymatic reaction time 30min, and the detective wavelength at 520nm were the optimumconditions for the determination.Key words: Cellulase; the determination of enzyme activity; condition中国分类号：TS207.3 文献标识码：A纤维素是地球上最古老、最丰富的天然高分子，也是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，是取之不尽用之不竭、人类最宝贵的天然可再生资源，占植物界碳含量的50%以上[1]。
粗饲料中纤维素、半纤维素酶解测定方法的研究与评价的开题报告
粗饲料中纤维素、半纤维素酶解测定方法的研究与评价的
开题报告
一、选题背景
纤维素和半纤维素是植物体中最主要的成分之一，是植物细胞壁的重要组成部分。
粗饲料中的纤维素和半纤维素对于反刍动物的消化有着至关重要的作用，在家畜的饲
养过程中起着非常重要的作用。
尤其对于草食动物而言，其在消化过程中微生物必须
首先将纤维素和半纤维素水解为双糖和单糖，这也是其生长和发展的前提条件。
因此，能够准确测定粗饲料中的纤维素和半纤维素含量，对于家畜饲养和养殖行业具有重要
的实际意义。
二、研究目的
本论文主要研究和评价粗饲料中纤维素、半纤维素酶解测定方法的准确性和可靠性，为家畜饲养和养殖行业提供可靠的检测方法和数据支持。
三、研究内容
1. 纤维素、半纤维素的含义和作用；
2. 纤维素、半纤维素酶解测定方法的种类和优缺点；
3. 粗饲料中纤维素、半纤维素含量的取样方法和试验结果；
4. 对比不同纤维素、半纤维素酶解测定方法的检测准确性和可靠性；
5. 结果分析和讨论，提出进一步研究和改进方向。
四、研究意义
1. 为粗饲料中纤维素、半纤维素酶解测定提供准确性和可靠性的科学依据，为家畜饲养和养殖行业提供数据支持；
2. 增强学生的科研能力和实践能力，提升专业素养和综合能力。
五、研究方法
1. 对不同方法进行对比实验，筛选出具有准确性和可靠性的测定方法；
2. 通过标准化测定程序，获得准确的试验数据并进行分析和处理。
六、预期结果
本论文预计能够找到一个能够准确测定粗饲料中纤维素、半纤维素含量的测定方法，并评价其准确性和可靠性。
有望提供科学依据和数据支持，为家畜饲养和养殖行业提供有益的帮助。
纤维素酶的滤纸酶活和CMC酶活的测定(2)
收稿日期:2002-03-18作者简介:张瑞萍(1964-),女,江苏南通人,副教授,硕士,从事酶在纺织品染整加工中的应用工艺及配套助剂的研究.纤维素酶的滤纸酶活和CMC 酶活的测定张瑞萍(南通工学院,江苏南通226007)摘要:采用3,5-二硝基水杨酸(D NS)为显色剂、滤纸或CMC 为底物,测定纤维素酶的滤纸酶活(FPA)和CMC 酶活(CMCA).分析确定了酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物,比较了两种底物的酶活测定方法,结果表明:纤维素酶的CMC 酶活比滤纸酶活高,酶对水溶性底物有较高的活力,吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响.关键词:纤维素酶;酶活;测定中图分类号:TS190.92+3文献标识码:C文章编号:1004-0439(2002)05-0051-03DETERMINATION OF FILTER PAPER ENZYME ACTIVITY ANDCMC ENZYME ACTIVITY OF CELLULASEZHA NG Rui_p in g(Nantong Institute of Technology,Nantong 226007,China)Abstract:With 3,5-dinitrosalic y lic acid (DNS)as develo p er and filter p a p er or CMC as the substrate,filter p ap er enz y me activit y (FPA)and CMC enz y me activit y (CMCA)of cellulase were determined.Throu g h anal y sis,w ave length for determining enzyme activity w as set as 530nm.The reference solution should be the reactant of inactivated enzyme.substrate and DNS.The determination methods for two kinds of s ubstrates were compared.The result indi cated that CMCA of cellulase is hi g her than FPA and enz y me is more active to water solable substrate.adsor p tion has g reat influence on the bondin g of active p art of cellulase with molecular chain of cellulose and the catal y sis.Key words:cellulase;enzyme activity;determination减量率=100%处理前织物干质量-处理后织物干质量处理前织物干质量近年来,酶特别是纤维素酶在纺织工业上的应用已受到纺织染整和生物工程界人士的高度关注.纤维素酶是多组分的复合物,各个组分的底物专一性不同;另外,纤维素酶作用的底物比较复杂,加上反应产物不同,致使纤维素酶活的测定方法很多,各国采用的方法亦不统一.本试验选择滤纸、CMC 为底物,其原理为利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖与显色剂反应,求出还原糖的浓度,再求出酶的活力.由不同底物测得的酶活分别称作FPA(滤纸酶活)和CMCA(CMC 酶活).本实验分析酶活测定的主要条件,比较两种底物酶活测定方法的结果,为生产中酶的利用提供了依据.1实验方法1.1化学药品、材料纤维素酶(工业品),DNS 试剂为自配,冰醋酸、醋酸钠、葡萄糖均为分析纯,滤纸(定性)、羧甲基纤维素钠(试剂级).1.2FPA 滤纸酶活和CMC 酶活的测定取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%CMC 溶液为底物,于50 恒温水解反应1h,然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min,再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值.酶活定义:1ml 酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位(u).1.3织物酶减量率的测定将酶处理前后的试样在105 烘箱中烘至恒重.印染助剂TEXTILE AUXILIARIES 第19卷第5期2002年10月Vol.19No.5Oct.20025219卷印染助剂2结果与讨论2.1显色剂的选择本试验选用3,5-二硝基水杨酸(DNS),在碱性条件下,与还原糖反应,生成有色化合物,通过分光光度计进行比色测定,确定低分子糖的量.DNS 黄色试剂在碱性条件下与还原糖共热反应生成的棕红色氨基化合物3-氨基-5-硝基水杨酸为比色法的测定基础物.2.2最大吸收波长的确定根据物质的颜色和吸收光颜色的关系,以及DNS 试剂的颜色及反应生成的棕红色氨基化合物的颜色,选取490~580nm 波长对显色液进行比色.由图1可知,不同浓度葡萄糖溶液在490~500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收.为了排除DNS 的干扰,选择在波长530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,但仍符合 吸收最大、干扰最小!的原则.2.3底物及酶本身的含糖量在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色.而且,试验所用的纤维素酶是工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同.为了排除还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物.2.4葡萄糖标准曲线用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值,结果如图2所示.从图2可知,标准曲线y = 2.0666x+0.1362,线性相关系数R 2为0.9991,线性相当好,可以用于酶活力的测定.2.5底物的选择对酶活的影响大多数由微生物产生的纤维素酶是多组分的酶系,主要含有3种组分:(1)endo- -1,4-葡聚糖酶;(2)exo- -1,4-葡聚糖酶;(3) -1,4-葡萄糖苷酶.其中,endo-酶能进攻纤维素大分子链的中间部位,任意地切断大分子成较短的链;而exo-酶则仅能从纤维素大分子链的非还原性末端切下一个个纤维二糖; -葡萄糖苷酶则把低分子葡聚糖催化分解成葡萄糖.纤维素酶复合体与纤维素纤维作用的最终效果,是由各种酶综合作用所决定的.作为底物的滤纸结构较为松散,可及区较多,非还原性末端也较多,容易同时被endo-酶和exo-酶降解,再由 -葡萄糖苷酶分解成葡萄糖等还原糖.用比色法定量测定还原糖的生成量,可反映纤维素酶的总酶活FPA.由于exo-酶对纤维素链的专一性高,而endo-酶的专一性较低.在降解羧甲基纤维素(CMC)时,主要是反映endo-酶的活力.本试验选择了3种酸性纤维素酶,分别以滤纸和CMC 为底物,其酶活(FPA 和CMC A)的测试数据结果如表1所示.从表1可知:CMCA 和FPA 两种酶活的大小顺序是:杰能科>NOVO L>PLUS L.这几种酶的endo-酶活(CMCA)较高,且比总酶活(FPA)大,几乎相差一个数量级.这说明酶对水溶性底物有较高的活力,而滤纸与酶是多相催化,酶分子也是高分子物,所以反应COO HNH 22OHCOOH +还原糖N 2NO 2OH表1不同酶种的滤纸酶活(FPA)和CMC 酶活(CMC A)酶种酶活/uCMCAFPA 杰能科528.1671.63NOVO L417.4030.92PLUS L327.8327.27553期张瑞萍:纤维素酶的滤纸酶活和CMC 酶活的测定的空间阻碍较大,这也表明了吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响.另外,从酶整理过程中机械处理条件对织物减量率的影响(如图3所示),也说明了这一点.所以,为了使酶在基质上充分发挥作用,至少要满足两个条件:首先,酶分子要非常接近、附着于基质,并和基质分子配位,形成中间络合物(对基质的亲和性);其次,以某种程度促进酶和基质分子的反应(对基质的活性).纤维素织物不溶于水,纤维素酶在对其攻击时会有空间障碍,而吸附于纤维素上的纤维素酶的活性又受时间的限制,在尚存活性时,如果不与基质作用,就会失活.所以,纤维素酶对基质的接近、附着不仅是单纯的物理结合,而且对纤维素水解反应的影响也很大.3结论3.1葡萄糖浓度与吸光度OD 值的相关系数在0.9991以上,从而确定该标准曲线可用于酶的活力测定.3.2分析确定了DNS 法测定活力的波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DNS 等共热的反应物.3.3底物不同,活力的测定值也不同,以羧甲基纤维素为底物测得的酶活值CMCA 比以滤纸为底物测得的酶活值FPA 高;这说明酶对水溶性底物有较高的活力;也表明了吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响.参考文献:[1] C.H.温著[英].罗兰译.酶的结构和功能[M].北京:科学技术出版社,1983.[2]相尺孝亮著[日].黄文淘译.酶应用手册[M].上海:上海科技出版社,1986.[3]Ghose T.Meas urement of Cellulase Activities[J].Pure A pp l.Ch em,1987,58(2):257-268.加盟联胜化工,踏上成功之路!联胜化工是专业生产和销售纺织助剂的精细化工公司,公司有完善的管理,发展前途广阔,在香港特区和大陆有完善的销售及售后服务网络,为适应公司的快速发展,诚聘英才加盟我公司(长期有效)。
纤维素酶活力测定方法
５
塞 妒 蕾
０
５
图２葡萄糖标准曲线
２．５底物的选择对酶活力的影响 目前理论认为，大多数由微生物产生的纤维素酶 是一个多组分酶系，主要含有三种组分：内切ｐｌ，４一葡 聚糖酶、外切８ １，４一葡聚糖酶和ｐ—ｌ，４葡萄糖苷酶。其 中，内切（ｅｎｄｏ一）酶能进攻纤维素大分子链的中间部 位，任意地切断大分子，而生成较短的链；而外切 （”ｍ）酶仅从纤维索大分子链的非还原性末端切下 一个个纤维二糖；６－葡萄糖苷酶则把低分子葡聚糖催
Ｉ。＝（０．８３：
１），杰能科：ＰＬＵＳ Ｉ。一（０．６７；１）。这与不同酶的
Ｉ。，ＰＬＵＳ Ｌ一１：
我们选择三种酸性纤维素酶，分别以滤纸和ＣＭＣ 为底物，其酶括力（ＦＰＡ和ＣＭＣ…）的测试数据结果如
表ｌ所示。
表１不同酶种的滤纸酶活（ＦＰＡ）和ＣＭＣ酶活（ＣＭＣ。。）
结论
从表ｌ可知，ＣＭＣａｓｅ和ＦｐＡ两种酶活的大小顺 序是：杰能科＞ＮＯＶＯ Ｌ＞ＰＬＵＳ Ｌ。这几种酶的内切 酶活（ＣＭＣ。）较高，且比总酶活（ＦＰＡ）大，几乎相差一 个数量级，这说明酶对水溶性底物有很高的活力．而滤 纸与酶属多相催化，酶也是高分子物，所以反应的空间 阻碍较大，这也表明了吸附对酶的活性部位与纤维素 分子链段的结合及催化均有很大影响。 ２．６纤维素酶活与织物酶减量率的关系 用这几种酶对织物进行整理，织物的减量率与酶 种及酶量的关系如图３所示。从图３可看出，当三种酶 的用量分别为２％、４％、６％、８％、ｌＯ％（ｏｗｆ）时，对 应的减量率的比值平均（杰能科：ＮＯＶＯ
２墨：：！！：竺！：
＝＝兰２兰垒竺竺竺
《藏蠹ｊ
摘
纤维素酶活力测定方法
张瑞萍 南通工学院（２２６００７）
要用ＤＮＳ为显色剂，分别以滤纸和ＣＭＣ为底物，“滤纸糖酶括性（ＦＰＡ）和羧甲基纤维索酶活性（ＣＭＣｍ）表征
纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定
纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定1.纤维素CMC酶1.0标题用3.5一二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活性单位。
2.0范围生产分析和质量控制部门适用。
3.0原理纤维素CMC酶（EC3.2.1.4）水解羧基纤维素分子中β－1.4葡萄糖苷键,释放出的还原糖(以葡萄糖计)与3.5二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖(以葡萄糖计)的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。
通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。
4.0试剂4.1无水醋酸钠(分析纯)4.2冰醋酸(分析纯)4.3 3.5－二硝基水杨酸4.4无水葡萄糖4.5四水酒石酸钾钠(分析纯)4.6氢氧化钠(分析纯)4.7重蒸苯酚(分析纯)4.8无水亚硫酸钠(分析纯)4.9叠氮化钠(分析纯)4.10羧甲基纤维素钠5.0仪器5.1水浴锅(恒温)50±1℃5.2电热干燥箱80±1℃5.3 722型分光光度机计5.4分析天平感量0.1㎎5.5一级玻璃制品5.6电冰箱6．0试剂的准备6．1乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8）溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。
溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。
以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。
6.2 DNS试剂:溶液A:称分析纯NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。
溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml热水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。
将A、B溶液混合，定容至5000ml，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。
6.3 CMC溶液：用羧甲基纤维素钠（CMC）以PH4.8醋酸缓冲液配成1%的溶液。
7．0标准曲线制作：7.1无水葡萄糖80℃烘干至恒重。
四种纤维素酶酶活测定方法的比较
四种纤维素酶酶活测定方法的比较一、本文概述纤维素酶是一类能够水解纤维素链中β-1,4-糖苷键的酶类，它们在生物降解纤维素以及纤维素类物质的转化利用中发挥着至关重要的作用。
由于纤维素酶在纺织、造纸、生物燃料、食品工业等多个领域的广泛应用，对其酶活性的准确测定就显得尤为重要。
本文旨在比较四种常用的纤维素酶酶活测定方法，包括滤纸酶活法、羧甲基纤维素钠（CMC）酶活法、对硝基苯酚纤维二糖法（pNPC）和荧光底物法，以期为读者提供一个全面而深入的理解，帮助研究者根据实验需求选择合适的测定方法。
本文将首先简要介绍纤维素酶的重要性和应用领域，然后详细阐述这四种酶活测定方法的原理、操作步骤、优缺点以及适用范围。
通过对比这些方法的灵敏度、准确性、重现性、操作简便性等方面，我们将为读者提供一个清晰的方法选择指南。
本文还将讨论影响酶活测定准确性的因素，并提出相应的改进措施，以期提高纤维素酶酶活测定的准确性和可靠性。
我们将对纤维素酶酶活测定方法的未来发展趋势进行展望，以期为相关领域的研究和应用提供参考和借鉴。
二、方法介绍纤维素酶是一种能够水解纤维素链中β-1,4-糖苷键的酶类，其酶活测定对于了解纤维素酶的性质、优化酶的生产工艺以及评估其在各种工业应用中的效率至关重要。
目前，常见的纤维素酶酶活测定方法主要包括滤纸酶活测定法、羧甲基纤维素钠（CMC）酶活测定法、还原糖法以及荧光底物法。
滤纸酶活测定法：此方法是基于纤维素酶对滤纸的水解能力。
在一定条件下，纤维素酶将滤纸水解成还原糖，通过比色法或滴定法测定还原糖的含量，从而推算出纤维素酶的活性。
该方法操作简单，但受滤纸质量、实验条件等因素影响，结果可能存在一定误差。
羧甲基纤维素钠（CMC）酶活测定法：该方法以羧甲基纤维素钠为底物，通过测定酶解后释放的还原糖量来计算纤维素酶的活性。
该方法具有底物纯度高、反应条件易控制等优点，因此在许多研究中得到广泛应用。
然而，CMC与天然纤维素的结构差异可能导致测定的酶活与实际应用中的酶活不完全一致。
纤维素酶活力的测定方法
纤维素酶活力的测定方法纤维素酶活力的测定方法1 原理纤维素酶是一种复合酶。
酶系包括外切B-1.4-葡聚糖酶（ExoB-1.4glucanase,EC3.2.1.9）内切B-1.4葡聚糖酶（Endoβ-1.4-glucanase,EC1.2.1.4）和纤维二糖酶。
纤维素酶在一定温度和PH条件下，将纤维素酶底物（滤纸或羟甲基纤维素钠）水解，释放出还原糖。
在碱性，煮沸条件下，3.5-二硝基水杨酸（DNS试剂）与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖（与葡萄糖汁）含量成正比。
通过在540nm测定吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的FPA酶和CMCA酶活力，以此代表纤维素酶的酶活力。
2 操作A.FPA酶A.1绘制标准曲线按表1规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液、缓冲溶液和DNS试剂加入各管中，混匀。
表1葡萄糖标准曲线管号葡萄糖标准使用溶液缓冲液吸取量DNS试剂吸取量ml 浓度mg/ml 吸取量ml 0 0.0 0.00 2.0 3.01 1.0 0.50 1.5 3.02 1.5 0.50 1.5 3.03 2.0 0.50 1.5 3.04 2.5 0.50 1.5 3.05 3.0 0.50 1.5 3.06 3.5 0.50 1.5 3.0将标准管同时置于沸水浴中，反应10min。
取出，迅速冷却至室温。
用水定容至25ml，盖塞，混匀。
用10mm比色杯，在分光光度计波长540nm处测量吸光度。
以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。
线性回归系数应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。
A.2 样品的测定A.2.1待测酶液的制备称取固体酶样1g，精确至0.1mg（或吸取液体酶样1ml,精确至0.01ml），用水溶解，磁力搅拌混匀，准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.3-0.4范围内），放置10min，待测。
A.2.2 滤纸条的准备----将待用滤纸放入（硅胶）干燥器中平衡24h----将水分平衡后的滤纸制成宽1cm、质量为（50±0.5）mg的滤纸条，折成M型，备用。
纤维素酶的检测方法新
纤维素酶的检测方法新-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1纤维素酶的检测方法摘要：本文主要介绍了纤维素酶的降解原理，通过实验比较了四种常用纤维素酶的检测方法的稳定性，以及纤维素酶的发展前景，为纤维素酶的应用提供了进一步的参考价值。
关键词：纤维素酶酶活测定葡萄糖回归方程一、纤维素酶及其降解原理纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，占植物总干重的30%-50%，是地球上分布最广，含量最丰富的可再生性碳源化合物，占地球总生物量的40%。
据报道，我国每年光作物秸秆，稻梗等含纤维素较丰富的物质就有5亿吨之多，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达吨，其中尚有89%未被人们利用，而大量的秸秆，稻梗等含纤维素丰富的物质的利用率也很低。
大多采用燃烧的方式来处理，这样就造成了环境污染，破坏了土壤的理化性质和丧失了有机质成分。
所以，纤维素的充分利用与有效的转化对于解决当前的能源危机，粮食短缺，环境污染等有重大意义。
纤维素酶是分解纤维素的一类酶，它能将纤维素分解为葡萄糖，充分的利用了纤维素。
自1906年Sellieres 在蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，纤维素酶的研究和应用受到了国内外学者的极大关注，取得了很大进展。
目前，国内外学者通过筛选产酶菌株来发酵产酶，再应用纤维素酶到食品，医药，饲料，洗涤等工业中，不仅解决了纤维素的再利用问题还取得了很可观的经济效益。
纤维素酶是由许多具有高协同作用的水解酶组成的。
习惯上将纤维素酶分成三种主要成分：内切酶（内切β-1,4-葡萄糖酶，也称Cx酶）、外切酶（外切β-1,4葡萄糖酶，也称C1酶）、β-1,4葡萄糖酶（即为纤维二糖酶）[1]。
C1酶主要作用于天然纤维素，使之转变为非结晶的纤维素。
Cx酶又分为Cx1酶和Cx2酶。
Cx1酶是一种内断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-（1,4）糖苷键，生成纤维糊精和纤维二塘。
Cx2酶是一种外断型纤维素酶，它从水合性纤维素分子的非还原端作用于β-（1,4）糖背键，逐步切断β-（1,4）糖节键生成葡萄糖。
纤维素酶活力的测定
β-糖苷酶活力的测定（CMC）一目的：掌握CMC酶活力测定纤维素酶的原理及测定方法。
原理：纤维素酶能从底物羧甲基纤维素钠（CMC-Na）中分解出还原糖，还原糖又同3，5-而硝基水杨酸发生反应，产生一种黄橙混合色，用分光光度计可测定其色度，计算酶活力。
二试剂：1．3，5-而硝基水杨酸显色剂（又称DNS试剂）：称取10g3,5-而硝基水杨酸，溶于蒸馏水中，加入20g分析纯NaOH，200g酒石酸钾钠，加税500ml,升温溶解后，加入重蒸酚2g,无水亚硫酸钠0.5g,加热搅拌，待全部溶解后，定容至1000ml。
贮存于棕色瓶中，室温保存，放置一周后使用。
2．0.1mol/L pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液：称取结晶醋酸钠（CH3COONa.3 H2O）13.61g，醋酸（CH3COOH）6.00g，用蒸馏水溶解，并定容至1000 ml，配好后用pH计矫正。
3．1mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在70℃、600nm汞柱下干燥5h至恒重），用少量蒸馏水溶解并定容至100ml，冰箱中保存备用。
4．代测酶液：称取酶粉1.0g（或吸取酶液1.00ml），先用少量的0.05mol/L pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入适当的容量瓶中，沉渣部分再加上述缓冲液溶解，如此反复捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，40℃水浴锅中浸提1h，用四层纱布或脱脂棉过滤，滤液供测定用。
5．底物：0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液，配制方法为城区0.5000g羧甲基纤维素钠（Sigma公司生产），准确至0.001g,用上述缓冲液溶解定容至100ml,冰箱中保存，有效期3d。
三仪器：分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。
四方法步骤：1．标准曲线的绘制分别吸取0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4ml的1mg/ml葡萄糖液于7支20ml的比色管中，分别用蒸馏水补充体积至2.oml,各加3，5-而硝基水杨酸1.5ml,在沸水浴中煮沸5min，冷却后分别用蒸馏水定容至20ml，摇匀。
纤维素酶活力的测定方法
纤维素酶活力的测定方法1 原理纤维素酶是一种复合酶。
酶系包括外切B-1.4-葡聚糖酶（ExoB-1.4glucanase,EC3.2.1.9）内切B-1.4葡聚糖酶（Endoβ-1.4-glucanase,EC1.2.1.4）和纤维二糖酶。
纤维素酶在一定温度和PH条件下，将纤维素酶底物（滤纸或羟甲基纤维素钠）水解，释放出还原糖。
在碱性，煮沸条件下，3.5-二硝基水杨酸（DNS试剂）与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖（与葡萄糖汁）含量成正比。
通过在540nm测定吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的FPA酶和CMCA酶活力，以此代表纤维素酶的酶活力。
2 操作A.FPA酶A.1绘制标准曲线按表1规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液、缓冲溶液和DNS试剂加入各管中，混匀。
表1葡萄糖标准曲线管号葡萄糖标准使用溶液缓冲液吸取量 DNS试剂吸取量ml 浓度mg/ml 吸取量ml 0 0.0 0.00 2.0 3.01 1.0 0.50 1.5 3.02 1.5 0.50 1.5 3.03 2.0 0.50 1.5 3.04 2.5 0.50 1.5 3.05 3.0 0.50 1.5 3.06 3.5 0.50 1.5 3.0将标准管同时置于沸水浴中，反应10min。
取出，迅速冷却至室温。
用水定容至25ml，盖塞，混匀。
用10mm比色杯，在分光光度计波长540nm处测量吸光度。
以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。
线性回归系数应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。
A.2 样品的测定A.2.1待测酶液的制备称取固体酶样1g，精确至0.1mg（或吸取液体酶样1ml,精确至0.01ml），用水溶解，磁力搅拌混匀，准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.3-0.4范围内），放置10min，待测。
A.2.2 滤纸条的准备----将待用滤纸放入（硅胶）干燥器中平衡24h----将水分平衡后的滤纸制成宽1cm、质量为（50±0.5）mg的滤纸条，折成M型，备用。
CMC糖化力法测定纤维素酶活性条件的研究[1]
![CMC糖化力法测定纤维素酶活性条件的研究[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/b1f983b2fd0a79563c1e7246.png)
０
０．５
１
１．５
２
２．５
３
ＤＮＳ 添加量（ ｍｌ）
图 ２ ＤＮＳ 添加量对测定结果的影响
２．３ 沸水浴显色时间的选择 由于不同来源的纤维素酶酶活不同， 产生的还原
糖量也不同， 因此， 直接以纤维素酶来确定显色时间 的 方 法不 可 靠。考 虑到 煮 沸主 要 是 使 还 原 糖 与 ＤＮＳ 反应完全， 而在比色分析过程中， 吸光值一般要求控 制在 ０．２～０．８ 范 围内 ， 以保 证 测定 数 据的 准 确性 ， 因 此， 采用最高测量值的还原糖标准液来确定显色反应 的时间， 结果见图 ３。从图 ３ 可以看出， 当显色时间超 过 ５ ｍｉｎ， 吸光值已基本趋于稳定。因此， 显色反应的 时间确定为 ５ ｍｉｎ。
关键词 ＣＭＣ 糖化力法； 纤维素酶； 酶活； 测定 中图分类号 Ｑ８１４
纤维素是植物纤维的主要成分， 自身难以被单胃 动物消化利用， 并且对饲料中各种养分的消化利用具 有明显的干扰和抑制作用。纤维素酶是降解纤维素 生成 葡 萄糖 的 一组 酶的 总 称［１］。研 究 表 明 ， 向 饲 料 中 添加纤维素酶， 不仅能有效地消除纤维素的抗营养 作用， 而且能促进饲料中各种养分的消化和吸收利 用， 提高饲料代谢能值和动物的生产性能， 增进畜禽 健康， 减少畜禽排泄物对环境的污染及拓宽饲料原 料 的 范围［２］。因 此， 纤 维 素酶 在饲 料 工 业 中 具 有 广 阔 的应用前景。
但长期以来， 纤维素酶酶活的分析测定一直是困 扰 纤 维 素 酶 生 产 和 应 用 的 主 要 难 题 之 一 。这 是 因 为 纤 维素酶是一种多组分的复合酶， 不同来源的纤维素酶 的组成及各组分的比例有较大差异； 同时， 纤维素酶 作用的底物也比较复杂， 致使纤维素酶酶活的测定方 法很多， 且复杂而不统一。常用的测定方法有： ＣＭＣ 糖 化 力 法 、ＣＭＣ 液 化 力 法 、滤 纸 糖 化 力 法 、滤 纸 崩 溃 法 和 棉 花 糖 化 力 法 等 ［３］。 国 内 许 多 单 位 分 别 采 用 了 上 述各种方法并进行了种种修改使测定方法更加多样 化。在上述测定方法中， ＣＭＣ 糖化力主要代表内切 β－ １，４ 葡聚糖酶酶活［４］， 在研究和实际生产中应用比较普 遍， 但具体的测定条件也有较大差异。例如， 测定波长 从 ４９０～５７０ ｎｍ［５－９］、底 物浓 度 从 ５～２０ ｇ／ｌ［１０－１３］、酶 促 反应
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定
1.纤维素CMC酶
1.0标题
用3.5一二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活性单位。
2.0范围
生产分析和质量控制部门适用。
3.0原理
纤维素CMC酶（EC3.2.1.4）水解羧基纤维素分子中β－1.4葡萄糖苷键,释放出的还原糖(以葡萄糖计)与3.5二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖(以葡萄糖计)的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。
通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。
4.0试剂
4.1无水醋酸钠(分析纯)
4.2冰醋酸(分析纯)
4.3 3.5－二硝基水杨酸
4.4无水葡萄糖
4.5四水酒石酸钾钠(分析纯)
4.6氢氧化钠(分析纯)
4.7重蒸苯酚(分析纯)
4.8无水亚硫酸钠(分析纯)
4.9叠氮化钠(分析纯)
4.10羧甲基纤维素钠
5.0仪器
5.1水浴锅(恒温)50±1℃
5.2电热干燥箱80±1℃
5.3 722型分光光度机计
5.4分析天平感量0.1㎎
5.5一级玻璃制品
5.6电冰箱
6．0试剂的准备
6．1乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8）
溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。
溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。
以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。
6.2 DNS试剂:
溶液A:称分析纯NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。
溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml热水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。
将A、B溶液混合，定容至5000ml，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。
6.3 CMC溶液：用羧甲基纤维素钠（CMC）以PH4.8醋酸缓冲液配成1%的溶液。
7．0标准曲线制作：
7.1无水葡萄糖80℃烘干至恒重。
7.2准确称取1.000g溶于1000ml水中，加10mg叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。
7.3标准葡萄糖曲线制作
取1mg/ml标准葡萄糖液各0，0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2ml补加水至2.0ml,加入2.0mlDNS 试剂,具塞,沸水浴中加热10分钟,冷却后定容至15ml,分光光度计550nm波长下测OD值,3次重复实验的均值用最小乘法相拟合Y=ax+b一元线性方程。
由光密度值引得葡萄糖量。
8.0 CMC酶活性测定。
8.1活性定义：1g酶粉（1ml酶液）于50℃PH4.8条件下，每分钟水解1%CMC溶液产生1µg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个CMC酶活力单位。
8.2分析程序：
取三支15ml刻度试管分别加入0.2ml稀释酶液，在分别吸取1.8mlCMC溶液,50℃水浴保温30分钟,空白样用0.2ml稀释酶液,加入1.8ml醋酸缓冲液,同样50℃水浴30分钟,再吸取DNS2ml 摇匀后,具塞,沸水浴反应10分钟,冷却后,补加水至15ml,轻轻上下摇匀,用空白调零点,于550nm 下测OD值。
9.0计算活力单位
A×D×5×1000
CMC酶活力=————————µ/g(ml)
30
A：OD值在标准曲线上对应的葡萄糖量（）
D：酶粉（液）稀释倍数
2.FPA酶
即滤纸酶，即以滤纸作为底物，因滤纸中的纤维素含量较高，FPA酶水解滤纸中的纤维素，释放出的还原糖与3.5-乙硝基水扬酸（DNS）反应，产生颜色变化，这种颜色变化与释放的还原糖量成正比关系，即与酶样品的酶活性成正比关系。
通过在550NM的光吸收值查对标准曲线，可以确定还原糖产生的量，从而确定酶活力单位，它也是恒量纤维素酶活的一个重要指标。
3.半纤维素酶：
1.0标题
用3.5一二硝基水杨酸测定半纤维素酶活性单位
2.0范围
生产分析和质量控制部门适用
3.0原理
半纤维素酶水解木聚糖，释放出的还原糖（以木糖计）与3.5一二硝基水杨酸（DNS）反应，产生颜色变化，这种颜色变化与释放的还原性糖（以木糖计）的量成正比关系，即与酶样品中的酶活性成正比。
通过在550nm的光吸收值查对标准曲线（以木糖为标准物）可以确定还原糖产生的量，从而确定出酶的活力单位。
4.0单位定义
一个半纤维素酶单位定义为；1g酶粉（或1ml酶液）于50℃PH4.8条件下，每分钟分解1%木聚糖溶液产生一微克还原糖（以木糖）的酶量定义为一个半纤维素酶活力单位。
5.0试剂
5.1无水醋酸钠（分析纯）
5.2冰醋酸（分析纯）
5.3 3.5一二硝基水杨酸（分析纯）
5.4木糖（分析纯）
5.5四水酒石酸钾钠（分析纯）
5.6氢氧化钠（分析纯）
5.7重蒸苯酚（分析纯）
5.8无水亚硫酸钠（分析纯）
5.9叠氮化钠（分析纯）
5.10木聚糖（分析纯）
6.0仪器
6.1水浴锅（恒温）50±1℃
6.2电热干燥箱80±1℃
6.3 772型分光光度计
6.4分析天平感量0.1
6.5一级玻璃制品
6.6电冰箱
7.0试剂的制备：
7.1乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8）
溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml配成0.1MNaNC溶液。
溶液B：称取8.2gNaAC，溶解后容至1000ml，制成0.1MNaAC溶液。
使用溶液以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。
7.2 DNS试剂
溶液A：称分析纯NaoH104g，溶于1300ml水中，加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。
B：称分析纯酒石酸钾钠910g溶于2500ml水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钾钠加入酒石酸钾钠溶液，将A、B溶液混合加入1200ml中，储存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。
7.3木聚糖溶液：用木聚糖以PH4.8醋酸缓冲液配成1%溶液。
8.0标准曲线制作：
8.1木糖80℃烘干至恒重。
8.2标准称取1.000g木糖以溶于1000ml水中，加10ml叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。
8.3标准木糖曲线制作
取1mg/ml标准木糖液各0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2补加水至2.0ml，加入2.0mlDNS 试剂,具塞、沸水浴中加热10分钟，冷却后定容至15ml，分光光度计550nm波长下测OD值，3次重复试验的均值用最小二乘法相拟合Y=ax+b一元线性方程，由光密度值引得木糖量。
9.0半纤维素酶活性测定；
15ml刻度试管中加入稀释酶液0.2ml（三支平行样），再各吸取1.8ml1%的木聚糖溶液，摇匀，50℃水溶60分钟，取出后，再吸取2mlDNS试剂摇匀，具塞，立即沸水浴反应10分钟，冷却后，补加水定容到15ml，轻轻上下摇匀，空白用0.2ml稀释酶液加。
1.8ml醋酸缓冲液，不加木聚糖溶液，同样依上述步骤，用空白调零点，于550nm下测OD值。
10.0计算活力单位:
半纤维素酶活力=(A×D×5×1000)÷60 u/g(ml)
A:OD值在标准曲线上对应的葡萄糖量(mg)
D:酶粉(液)稀释倍数。