耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的IMP—4耐药基因LAMP检测

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的IMP—4耐药基因LAMP检测目的：分析耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌的临床一般情况的特点，检测IMP-4耐药基因分布情况。

方法：搜集2014年11月-2016年4月福建省立医院微生物室从不同病区各种临床标本分离的肺炎克雷伯菌280株，其中包括耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌38株。

根据对碳青酶烯类抗生素的敏感性，选择38株耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）设为试验组，随机选择28株非耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌（KP）为对照组进行MP-4基因的LAMP技术检测，产物电泳观察结果。

结果：耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌多见于老年有抗生素使用史的患者，LAMP 法检测出CRKP组38株细菌中23例含IMP-4基因，KP组28株细菌中2例含IMP-4基因，差异有统计学意义（P＜0.05）。

结论：本研究建立的IMP-4 基因LAMP检测方法有助于初步判断肺炎克雷伯菌是否为耐药株。

[Abstract] Objective：To analyze the clinical characteristics of carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae，and to detect the distribution of IMP-4 resistance gene.Method：A total of 280 strains of Klebsiella pneumoniae were isolated from various clinical specimens of the Fujian Province Hospital from November 2014 to April 2016，including the carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae strains of.According to the sensitivity of carbapenem antibiotics，38 strains of carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae（CRKP）for the experimental group，randomly selected 28 strains of carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae（KP）for the matched group.MP-4 gene LAMP technology products the results of electrophoresis.Result：Carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae was more common in elderly patients with a history of antibiotic use，LAMP detected a CRKP group of 38 strains of bacteria in 23 cases with IMP-4 gene，KP group of 28 strains of bacteria in 2 cases with IMP-4 gene，the differences were statistically significant （P ＜0.05）.Conclusion：The IMP-4 gene LAMP detection method established in this study can help to determine whether Klebsiella pneumoniae is a resistant strain.[Key words] Klebsiella pneumoniae；Carbapenem resistant；LAMP肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia，KP）属肠杆菌科，存在于上呼吸道和肠道中，是常见的人体条件致病菌，当机体抵抗力减弱时，该菌可引起肺部、泌尿系感染，甚至败血症。

近年来，肺炎克雷伯菌引起的医院感染逐年增高，已成为医院感染的重要致病菌[1]。

碳青霉烯类抗生素自问世以来，就成为多重耐药性肺炎克雷伯菌的主要治疗药物，能有效杀灭病原菌。

但是肺炎克雷伯菌在临床抗生素广泛使用甚至滥用的选择压力下，特别是第三代头孢菌素、碳青霉烯类药物的大量应用，耐药形势日趋严重，出现了对碳青霉烯类药物耐药的肺炎克雷伯菌（Carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP），并且耐藥率逐年递增，给临床治疗带来极大困难[2]。

2015年，全国耐药监测网数据显示，肺炎克雷伯菌对第三代头孢菌素的耐药率全国为36.5%，耐碳青霉烯类耐药率为7.6%[3]。

面对如此严重的细菌耐药形势发展，加强细菌耐药监测、减少抗生素滥用导致的细菌耐药变得十分重要。

本研究针对肺炎克雷伯对碳青霉烯的耐药情况和耐药基因测定进行研究，寻找可以快速判断细菌耐药性的基因指标，指导临床抗生素使用。

1 资料与方法1.1 菌株来源搜集2014年11月-2016年4月笔者所在医院微生物室从不同病区各种临床标本培养出的肺炎克雷伯菌280株，标本类型包括：血液、痰、尿液、伤口分泌物、导管末端、肺泡灌洗液、胆汁、鼻腔分泌物、穿刺液、肝脓肿引流液、腹水、胸水等。

标本2 h内送检，采用常规细菌分离培养方法，鉴定细菌，所有菌株均应用法国生物梅里埃公司的VlTEK2-compact全自动细菌分析仪进行细菌鉴定及药敏分析，测定最低抑菌浓度（MIC），质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC700603。

对符合标准的菌株采用纸片法和细菌保存液保存法各保存菌株一份于-70℃冰箱中，所有标本均采用统一形式编号，以建立肺炎克雷伯菌标本库。

1.2 判定及排除标准（1）耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌判定标准：根据美国临床实验室标准化协会（CLSI）2016年版标准（CLSIM100-S26）[4]，厄他培南≤18 mm、亚胺培南和美罗培南的抑菌圈直径≤19 mm判断为耐药或VITEK-2药敏显示这三种抗生素中介/耐药，需进行手工法确认。

美罗培南、亚胺培南或厄他培南三者中，至少对其中之一耐药的菌株为耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌。

（2）排除标准：剔除重复标本。

1.3 主要仪器与试剂DNA核酸提取试剂盒（博奥生物公司）；LAMP引物合成（上海生工生物工程有限公司）；BstDNA聚合酶（北京百奥莱博科技有限公司）；VlTEK2-compact 全自动细菌分析仪（法国生物梅里埃公司）。

1.4 方法1.4.1 细菌DNA的提取（玻璃珠法）采用博奥生物公司细菌核酸提取试剂盒提取。

1.4.2 引物设计引物设计根据Genebank公布的基因序列，用PrimerExplorer4.0引物设计软件进行目标序列引物设计，获取一套特异性IMP-4基因的LAMP引物，包括1对内引物和1对外引物，引物序列见表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4.3 LAMP扩增方法与步骤配制25 μl的LAMP扩增反应体系，反应体系组成包括：反应缓冲液2.5 μl，MgSO4（100 mmol/L）1.5 μl，dNTP mixture（10 mmol/L）3.5 μl，FIP/BIP（40 μmol/L）1.0 μl，F3/B3（5μmol/L）1.0 μl，Bst DNAPolymerase（8000 U/ml）10 μl，DNA模板2.0 μl，HBN（4 mmol/L）0.75 μl，加超纯水ddH2O至25 μl，65 ℃水浴恒温反应60 min。

1.4.4 LAMP产物测定琼脂凝胶电泳法测定LAMP产物，在凝胶成像仪中观察或拍照记录结果。

1.5 统计学处理采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验；计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 一般情况2014年11月-2016年4月笔者所在医院微生物室搜集到肺炎克雷伯菌280株，标本来源主要为痰、尿、血，还包括其他如脓液、穿刺液、导管末端、肺泡灌洗液、鼻腔分泌物、腹水、胸水、胆汁等。

细菌培养及药敏鉴定结果提示有耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）38株，耐药率为15.7%。

临床资料提示CRKP 组38例，男26例，女12例，年龄28～97岁，平均（74.76±16.96）岁；65岁以上患者31例，占81.58%；标本来源主要为痰和尿液，感染多为入院48 h以上发生，占63.58%；31.58%患者在送检标本前有使用过抗生素治疗。

非耐药菌组242例，男173例，女69例，年龄0～96岁，平均（60.54±20.61）岁；65岁以上患者133例，占54.96%；标本来源主要为痰和血液，感染多为入院48 h以上发生，占70.25%；15.29%患者在送检表本前有使用过抗生素治疗，见表2 。

2.2 IMP-4耐药基因的LAMP检测结果：利用LAMP技术对38株耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌（CRKP组）和从非耐药菌中随机挑选的28株肺炎克雷伯菌（KP组）进行IMP-4基因检测，反应产物进行凝胶电泳判定，CRKP组38株菌株中检测出23株阳性，KP组28株菌株中检出2株阳性，比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图1、图2、表3。

3 讨论肺炎克雷伯菌对碳青酶烯类抗生素耐药率逐年上升，临床分离到的耐药菌往往出现在危重患者身上。

在传统病原学检测报告出具之前，临床医生仅能采取经验性使用抗生素。

如何避免传统细菌培养和药敏结果报告滞后的缺点，寻找可以很好提示细菌耐药性的临床特点和基因型检测指标是当前研究的热点。

环介导恒温扩增法（Loop-mediated Isothcrmal Amplifieation，LAMP）属于恒温扩增法中的一种，2000年由日本科学家Notomi等[5]提出，可以体外扩增并检测目标基因。

反应原理是DNA遵循严格的碱基配对，所以针对目的基因的6个序列区域设计4条特异性引物（2条内引物、2条外引物）来检测目的基因的存在与否。

本研究通过设计了一套特异性IMP-4基因的LAMP引物，测定我院肺炎克雷伯菌的IMP-4基因分布情况。

包括细菌DNA提取、LAMP反应体系、LAMP反应产物凝胶电泳分析获得结果，整个过程仅需2 h左右。

相比传统的细菌培养药敏结果2～3 d出具结果，有明显的优势，并且進行LAMP反应不需要对致病菌进行增菌养殖，在反应第一步就杀灭了致病菌，提取出DNA，生物安全更有保障；相比PCR方法，LAMP不需要专门的核酸扩增仪器，反应过程恒温，减少了PCR升温、降温过程对DNA的损耗，而LAMP与PCR一样，遵循严格的碱基配对，对检验标本可以不提纯致病菌而直接处理提取DNA进行检测，其特异性和敏感度都得到多个试验的验证[6-7]，在敏感度方面甚至优于PCR。