最新生物化学 第2章 蛋白质(2)演示教学
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
（2)氧化法：常用过甲酸(CHOOOH)作为氧化剂， 使二硫键氧生成半胱氨磺酸(磺基丙氨酸残基) 。
（四）肽链的部分水解 常用胰蛋白酶法, 胰凝乳蛋白酶法和溴化氰法等方法。下面是
一个典型的多肽，用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶 (糜蛋白酶)和溴化氰 分别处理所得到的结果：
生物化学 第2章 蛋白质(2)
（四） 毛细管电泳
毛细管电泳技术是将养品点在装有凝胶的、 直径为20-75 μm 内经的毛细管里，进行电泳。 优点是分辨率高、、样品需要量小。电泳速度 快、上样和分离物的检测都能够进行自动化操 作。因为毛细管散热性能好，允许使用很高的 电压进行电泳。
除分离检测蛋白质外，在核酸的序列分析中 使用较为普遍。
（一） 氨基酸的组成分析 蛋白质在标准条件下经酸水解后, 进行氨基酸的组成
分析.通过组成分析基本上可推测出部分水解所产生的肽 碎片的数目。
（二）末端分析(确定蛋白质的肽链组成) ：通常测定肽链 的N-末端. 二硝基氟苯(DNFB)法 或丹磺酰氯（DNSCl）法是常用的方法。丹磺酰氯为一种更有效的试剂， 灵敏度比DNFB法高100倍。
600g,3 min.上清
沉淀：细胞核
6000g,8 min.上清
沉淀：线粒体，叶绿体， 溶酶体，过氧化酶体
沉淀：细胞质膜，高尔基 体和内质网膜的碎片
40000g.30 min.上 清
100000g.90 min.上清
沉淀：核糖体亚基
细胞液
平衡密度梯度离心：
用不同的离心速度、依据被分离物的密度而进 行分离的效果；通常是将没有纯化的物质铺在密度 溶液（如蔗糖溶液，氯化铯溶液为介质，离心管内 的溶液密度从底部到顶部是浓至稀的梯度）的顶层， 通过离心（160000g，3h）细胞内各成分不停地 下沉分别达到与溶液的密度相等时的位置。其介质 的密度范围宽于被分离组分的密度。
七 蛋白质的沉降作用及超离心分离
沉降速度(ν = dx / dt )与蛋白质分子的大小和密 度有关。
沉降速度法，适用于分离沉降系数不同但密度相近 的蛋白质。
沉降平衡法，适用于沉降系数相近，但密度不同 的蛋白质。
沉降系数：当沉降界面以恒定的速度移动时，单 位离心场里的沉降速度。
用离心法分离细胞亚微结构
目标蛋白质的分离纯化程序主要包括:
1 材料的选择； 2 组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液； 3 蛋白质初步提纯； 4 选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全纯化； 5 目标蛋白的鉴定。 用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性。因此，在目标蛋白质 的整个分离纯化过程中要在较低温度下(0－4℃)操作，注意使用蛋白 酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质特 定的折叠结构受到破坏。
三级结构（tertiary structure）：多肽 链在二级结构基础上进一步卷曲折叠，即整 个肽链（亚基）的空间形状。三级结构指的 是处于充分折叠、具有生物学活性的一个完 整的球蛋白的三维结构， 。
四级结构（quaternary structure）：寡 聚蛋白质分子亚基之间的相互关系和空间位 置。
二 蛋白质一级结构测定
蛋白质测序的一般步骤：
首先目标蛋白质分离纯化得到高度纯净的蛋白质样 品。
（1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目，末端分析， 分析多肽链的N末端和C末端。
（2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。断裂链内二硫键。 （3） 测定多肽链的氨基酸组成，酸水解或碱水解。 （4） 多肽链部分裂解成肽段，专一性酶解。 （5） 测定各个肽段的氨基酸顺序。 （6） 确定肽段在多肽链中的顺序。 （7） 确定多肽链中二硫键的位置。
差异（速）离心与平衡密度梯度离心法
第五节 蛋白质的一级结构和测定
（一）蛋白质一级结构概述
蛋白质的结构层次：
一级结构(primary structure)：多肽链内氨基酸残基从N端到பைடு நூலகம்C端的排列顺序，或称氨基酸序列。
二级结构（secondary structure）：多肽链主链不同肽段沿主 轴盘旋折叠而形成的空间结构。二级结构是蛋白质结构的构象单 元。主要有α螺旋、β折叠、β转角、无规卷曲。
丹磺酰氯分析多 肽链的N－末端
苯异硫氰酸 酯（PITC） Edman试 剂
水解多 肽确定 氨基酸 组成
确定N末端的 氨基酸残基
确定N末端的氨基酸残基 剩下的多肽可以再利用。
（三）拆开链间或链内的二硫键
（1) 还原法：用巯基乙醇(HSCH2CH2OH)或二硫 苏糖醇等还原性试剂使二硫键打开，还原生成-SH。
（五）电泳后的蛋白质检测：
考马斯亮蓝染色是常用的一项电泳染色方法,是根据考 马斯亮蓝能与蛋白质多肽链定量结合的原理而建立起的。 对于一个混合蛋白质的电泳分离来说,它只能检测样品的分 离情况；如果被检蛋白质的位置可以确定,可以将该蛋白质 的色带切下之后进行脱色,测定脱色液光吸收值,能对该蛋 白质进行定量分析。
活性染色：
根据有活性的目标蛋白质特有的生物化学反应 产生的有色物质或另外加入某种能与产物生成颜色 的物质来进行检测的.活性染色可以从一个复杂的蛋 白质样品中检测到目标蛋白出现的位置。活性染色 法在同工酶(例如酯酶同工酶、谷氨酸脱氢酶同工酶、 谷氨酰胺合成酶同工酶等)的检测中非常有用。
免疫印迹(Immunoblotting)或蛋白质印迹 (Western blotting)是检测目标蛋白质的一项十分 有效的方法。一种蛋白质(抗原)能与它产生的抗体专 一地反应。在电泳之后,欲检测目标蛋白的存在,可以 先将凝胶中的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上,然后 用目标蛋白产生的抗体与之产生抗原-抗体反应,最后 可用连接有碱性磷酸酯酶或辣根过氧化酶的第二抗体 (通用抗体)与第一抗体反应,加入能与抗体共接的酶 反应生成有色物质的生色液,即可十分可靠地检到的 目标蛋白。
差异（速）离心：用不同的离心速度、依据被
分离物的大小而将细胞亚结构彼此分离的效果。
速度区带离心：将样品铺在稀的蔗糖溶液的顶
层，溶液不用于分离而用以抗对流作用，离心完成 后，细胞各成分以其大小不同而在离心管中呈区带 分布，若离心时间太长，或离心力过大，细胞各成 分都会沉降至管底，而达不到分离效果。
差异（速）离心法
（四）肽链的部分水解 常用胰蛋白酶法, 胰凝乳蛋白酶法和溴化氰法等方法。下面是
一个典型的多肽，用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶 (糜蛋白酶)和溴化氰 分别处理所得到的结果：
生物化学 第2章 蛋白质(2)
（四） 毛细管电泳
毛细管电泳技术是将养品点在装有凝胶的、 直径为20-75 μm 内经的毛细管里，进行电泳。 优点是分辨率高、、样品需要量小。电泳速度 快、上样和分离物的检测都能够进行自动化操 作。因为毛细管散热性能好，允许使用很高的 电压进行电泳。
除分离检测蛋白质外，在核酸的序列分析中 使用较为普遍。
（一） 氨基酸的组成分析 蛋白质在标准条件下经酸水解后, 进行氨基酸的组成
分析.通过组成分析基本上可推测出部分水解所产生的肽 碎片的数目。
（二）末端分析(确定蛋白质的肽链组成) ：通常测定肽链 的N-末端. 二硝基氟苯(DNFB)法 或丹磺酰氯（DNSCl）法是常用的方法。丹磺酰氯为一种更有效的试剂， 灵敏度比DNFB法高100倍。
600g,3 min.上清
沉淀：细胞核
6000g,8 min.上清
沉淀：线粒体，叶绿体， 溶酶体，过氧化酶体
沉淀：细胞质膜，高尔基 体和内质网膜的碎片
40000g.30 min.上 清
100000g.90 min.上清
沉淀：核糖体亚基
细胞液
平衡密度梯度离心：
用不同的离心速度、依据被分离物的密度而进 行分离的效果；通常是将没有纯化的物质铺在密度 溶液（如蔗糖溶液，氯化铯溶液为介质，离心管内 的溶液密度从底部到顶部是浓至稀的梯度）的顶层， 通过离心（160000g，3h）细胞内各成分不停地 下沉分别达到与溶液的密度相等时的位置。其介质 的密度范围宽于被分离组分的密度。
七 蛋白质的沉降作用及超离心分离
沉降速度(ν = dx / dt )与蛋白质分子的大小和密 度有关。
沉降速度法，适用于分离沉降系数不同但密度相近 的蛋白质。
沉降平衡法，适用于沉降系数相近，但密度不同 的蛋白质。
沉降系数：当沉降界面以恒定的速度移动时，单 位离心场里的沉降速度。
用离心法分离细胞亚微结构
目标蛋白质的分离纯化程序主要包括:
1 材料的选择； 2 组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液； 3 蛋白质初步提纯； 4 选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全纯化； 5 目标蛋白的鉴定。 用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性。因此，在目标蛋白质 的整个分离纯化过程中要在较低温度下(0－4℃)操作，注意使用蛋白 酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质特 定的折叠结构受到破坏。
三级结构（tertiary structure）：多肽 链在二级结构基础上进一步卷曲折叠，即整 个肽链（亚基）的空间形状。三级结构指的 是处于充分折叠、具有生物学活性的一个完 整的球蛋白的三维结构， 。
四级结构（quaternary structure）：寡 聚蛋白质分子亚基之间的相互关系和空间位 置。
二 蛋白质一级结构测定
蛋白质测序的一般步骤：
首先目标蛋白质分离纯化得到高度纯净的蛋白质样 品。
（1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目，末端分析， 分析多肽链的N末端和C末端。
（2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。断裂链内二硫键。 （3） 测定多肽链的氨基酸组成，酸水解或碱水解。 （4） 多肽链部分裂解成肽段，专一性酶解。 （5） 测定各个肽段的氨基酸顺序。 （6） 确定肽段在多肽链中的顺序。 （7） 确定多肽链中二硫键的位置。
差异（速）离心与平衡密度梯度离心法
第五节 蛋白质的一级结构和测定
（一）蛋白质一级结构概述
蛋白质的结构层次：
一级结构(primary structure)：多肽链内氨基酸残基从N端到பைடு நூலகம்C端的排列顺序，或称氨基酸序列。
二级结构（secondary structure）：多肽链主链不同肽段沿主 轴盘旋折叠而形成的空间结构。二级结构是蛋白质结构的构象单 元。主要有α螺旋、β折叠、β转角、无规卷曲。
丹磺酰氯分析多 肽链的N－末端
苯异硫氰酸 酯（PITC） Edman试 剂
水解多 肽确定 氨基酸 组成
确定N末端的 氨基酸残基
确定N末端的氨基酸残基 剩下的多肽可以再利用。
（三）拆开链间或链内的二硫键
（1) 还原法：用巯基乙醇(HSCH2CH2OH)或二硫 苏糖醇等还原性试剂使二硫键打开，还原生成-SH。
（五）电泳后的蛋白质检测：
考马斯亮蓝染色是常用的一项电泳染色方法,是根据考 马斯亮蓝能与蛋白质多肽链定量结合的原理而建立起的。 对于一个混合蛋白质的电泳分离来说,它只能检测样品的分 离情况；如果被检蛋白质的位置可以确定,可以将该蛋白质 的色带切下之后进行脱色,测定脱色液光吸收值,能对该蛋 白质进行定量分析。
活性染色：
根据有活性的目标蛋白质特有的生物化学反应 产生的有色物质或另外加入某种能与产物生成颜色 的物质来进行检测的.活性染色可以从一个复杂的蛋 白质样品中检测到目标蛋白出现的位置。活性染色 法在同工酶(例如酯酶同工酶、谷氨酸脱氢酶同工酶、 谷氨酰胺合成酶同工酶等)的检测中非常有用。
免疫印迹(Immunoblotting)或蛋白质印迹 (Western blotting)是检测目标蛋白质的一项十分 有效的方法。一种蛋白质(抗原)能与它产生的抗体专 一地反应。在电泳之后,欲检测目标蛋白的存在,可以 先将凝胶中的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上,然后 用目标蛋白产生的抗体与之产生抗原-抗体反应,最后 可用连接有碱性磷酸酯酶或辣根过氧化酶的第二抗体 (通用抗体)与第一抗体反应,加入能与抗体共接的酶 反应生成有色物质的生色液,即可十分可靠地检到的 目标蛋白。
差异（速）离心：用不同的离心速度、依据被
分离物的大小而将细胞亚结构彼此分离的效果。
速度区带离心：将样品铺在稀的蔗糖溶液的顶
层，溶液不用于分离而用以抗对流作用，离心完成 后，细胞各成分以其大小不同而在离心管中呈区带 分布，若离心时间太长，或离心力过大，细胞各成 分都会沉降至管底，而达不到分离效果。
差异（速）离心法