过氧化氢酶米氏常数的测定
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过氧化氢酶米氏常数的测定
傅璐121140012
一、实验目的
1. 了解米氏常数的测定方法
2. 学习提取生物组织中的酶
二、实验原理
1.米氏反应动力学
(Michaelis-Menten Equation):
米氏方程
2.米氏常数的意义：
①反映酶的种类：Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关，与酶浓度、
底物浓度无关。
②米氏常数是酶促反应达到最大反应速度Vmax一半时的底物浓度。其数值大
小反映了酶与底物之间的亲和力：Km值越大，亲和力越弱，反之Km值越小，亲和能力越强。
③Km可用来判断酶（多功能酶）的最适底物：Km值最小的酶促反应对应底物
就是该酶的最适底物。
3.米氏常数的求法：
该方法的缺点是难以确定最大
反应速度Vmax。
该作图法应用最广。但在低浓度是v值误差较大，在[S]等差值实验时作图点较集中于纵轴。因此在设计底物浓度时，最好将1/[S]配成等差数列，这样可使点距较为平均，再配以最小二乘回归法，就可以得到较为准确的结果。
此法优点是横轴上点分布均匀，缺点是1/v会放大误差，同时对底物浓度的选择有要求。[S]<
4.氧化酶：生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是消除体内自由基：
①POD：过氧化物酶
②SOD:超氧化物歧化酶
③CAT：；过氧化氢酶
5.过氧化氢酶的作用：
植物体内活性氧代谢加强而使过氧化氢发生积累。过氧化氢可进行一步生成氢氧自由基。氢氧自由基是化学性质最活泼的活性氧，可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶（catalase，CAT）可以清除过氧化氢、分解氢氧自由基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密切相关。
6.过氧化氢酶活力的测定方法：
①紫外吸收法：
过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240nm）随反应时间而降低。根据测量吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。（以一分钟内A240nm下降0.1为一个单位）
②滴定法（高锰酸钾法、碘量法）
在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。根据单位时间内消耗的过氧化氢的量即可测出过氧化氢酶活力大小。
7.实验中的反应：
H2O2被过氧化氢酶分解出H2O 和O2 , 未分解的H2O2 用KMnO4 在酸性环境中滴定, 根据反应前后的浓度差可以算出反应速度:
酶
2H2O2 −→2H2O + O2
2KMnO4+5H2O2+3H2SO4 −→2MnO4+K2SO4+8H2O+5O2
（本实验以马铃薯提供过氧化氢酶）
三、实验试剂
1. 0.02mol/L 磷酸缓冲溶液(pH=7.0): 实验室提供.
2. 酶液: 称取马铃薯5g, 加缓冲液10mL, 匀浆过滤.
3. 0.01mol/L 高锰酸钾.
4. 0.098mol/L H2O2.
5. 25%H2SO4.
四、实验操作
取6 只锥形瓶, 按下表的顺序加入试剂.
先加好过氧化氢和蒸馏水, 加酶液后立即混合, 依次记录各瓶的起始反应时间. 反映到达5min 立即加入2ml 25%硫酸终止反应, 充分混匀.。用0.01mol/L 的KMnO4溶液滴定瓶中剩余的过氧化氢至微红色, 记录消耗的高锰酸钾体积.。
五、注意事项：
1.反应时间必须准确。
2.酶浓度须均一，若酶活力过大，应适当稀释。
3.滴定终点的判定。
六、实验结果：
过氧化氢浓度：0.098mol/L
称取马铃薯的质量：5.00g 序号 1 3 4 5
V （KMnO4）/ml 2.7 4.4 6.32 12.4
[S]/(mol/L) 0.0098 0.016368 0.0245 0.049
v/(mmol/min) 0.0061 0.010732 0.0174 0.036
1/[S] 102.0408 61.0948 40.8163 20.4082
1/v 163.9344 93.1793 57.4713 27.7778
米氏常数计算曲线y = 1.6828x - 8.7953R 2 = 0.998802040
60
801001201401601800204060801001201/[S]1/v 系列1线性 (系列1)
米氏常数Km= -0.1913
七、实验结果分析：
1.曲线上少一个点的原因：
用移液管移取序号为2的过氧化氢溶液（应为1.25ml）错误的移取了1.75ml，故在制图时将其舍去。
2.曲线线性较好（R²=0.9988）的原因：
本实验采取了两人分工的方法完成实验，控制反应结束及滴定分别由一人完成，所以标准都相同，从而在一定程度上提高了实验的准确性。
3.Km计算结果呈负值的原因：
Km呈负值（即整条直线都向下移动），亦即所有测定的v值都偏大。
由v=(c1*V1-2.5*c2*V2)/5，故推断最可能的原因是V2整体测量偏小，可能的操作失误是编号为0的空白对照组中高锰酸钾的滴加量偏高，从而使除去该点的整体的高锰酸钾量都偏小。