高效液相色谱解析
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质谱负离子模式的总离子流图与 356 nm 波长下紫外色谱图基本吻合， 但总离子流图的基线噪声较大。
液—质联用分析锦绣杜鹃叶黄酮类成分
1903年提出、1969～1970年开始发展
原理：以液体为相，采用高压输液系统，将具有不 同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液 等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分 被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样 的检测
六口旋转进样阀示意图
工作原理：手柄位于取样(Load)位置时， 样品经微量进样针从进样孔注射进定量环， 定量环充满后，多余样品从放空孔排出； 将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液 相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量 环，推动样品进入液相分析柱进行分析。
三、色谱柱
色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与 固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜 及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有 限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm， 内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往 内径较大，可达25mm 以上。一般在分离前备有一 个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这 样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱 和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保 证分离的性能不受影响。
技术：采用高效固定相、高压泵、高灵敏检测器
实现：分析速度快、分离效率高、操作自动化分析。
2 通过进样器，注入样品混合物
3.由于混合物中各组分 性质不同，因而它们在 柱内移动速度不同而逐 渐分离。
1 通过高压泵，将流动相抽入柱子
4.通过检测器检测，得到组分的 电信号并进行放大；记录仪将放百度文库大的电信号以图形形式记录下来。
b.高压梯度 ( 或称内梯度系统 ) ：利用两台高压输液泵，将 两种不同极性的溶剂按设定的比例送入梯度混合室，混合后， 进入色谱柱。
结果分析
黄酮类化合物 一级质谱中大多以 准离子分子形式存在，有少量碎片离 子。二级质谱中碎片信息则较少，主 要峰的质谱图见图 3 ～7。根据分析液 相中的色谱峰与总离子流图中所对应 的离子峰的质谱信息，并结合相关文 献的报道，对锦锈杜鹃 HPLC 分离出 的5 个主要峰进行分析，推断出其可能 的结构 。
1.高压
一般：150～300kg/cm2 ,甚至：500kg/cm2 为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压
2.高速
两相间交换千分之几秒，分析时间较经典法少很多(几分~几十分钟) 通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内可完成
3 高效
气相：2000塔板/米，液相：5000塔板/米
可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业蒸馏塔和气相 色谱的分离效能高出许多倍
4.高灵敏 紫外检测器：10－9g数量级
度
荧光检测器：10－11g(百万分之几），试样量小（几微升）
5.高选择 可分析在性质上极为相似化合物 性
（手性化合物、同位素、同分异构、空间异构）
相同点
1.都是重要的分离、分析 手段
2.气相的基本理论（塔板 理论、定性定量方法）
3.基本术语（色谱参数、 色谱图、色谱柱效）
上述每种色 谱类型均可进一 步分为多个不同 色谱方法。这些 方法可用于分析 分离，也可用于 制备分离，各色 谱方法在相关领 域应用互相补充。
一、泵系统
通用HPLC仪输液泵系统的基本要求是：提供(50-500)×105Pa的柱前 液压；输出无脉动恒定的液流；流速范围0.1-10mL/min；流速控制精度 0.5%或更好；系统组件耐腐蚀(密封性良好的不锈钢或氟塑料)。高压泵 产生的液体高压没有爆炸危险，因为液体的压缩性极小。最重要的是系 统密封性能好。
液相色谱-质谱（HPLC-MS）联用是以HPLC 为分离手段，MS为检测器的一门综合性分析技术， 它集HPLC的高分离能力与MS的高灵敏度、极强的 定性专属特异性于一体的技术。它以液体溶剂作为 流动相的色谱技术，一般在室温下操作。可以直接 分析不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物 （包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等），分析范围 广，而且不需衍生化步骤。
不同点
1.应用范围： 气相：易挥发、热稳定 液相：不易挥发、热不稳定 但具有一定溶解性化合物， 不适合气体。
2.流动相作用： 气相：运载样品，不影响色 谱分离 液相：运载样品，参与、影 响色谱分离，且起主要作用。
3.分析样品： 气相：破坏样品，不能回收。 液相：不破坏样品，能回收。
ⅰ液固吸附色谱（LSC)
（ 利用样品分子在固定相上吸附性能差异而分离）
ⅱ液液分配色谱（LLC）
（利用样品分子在两相中分配系数不同导致溶解度 不同而分离）（键合相色谱 60％） ⅲ离子交换色谱（IEC）
（利用样品分子的电荷性、导电性不同，导致对固 定相的亲合力不同而分离）
ⅳ体积排阻色谱（SEC)
（利用溶质分子大小不同导致对固定相的渗透力不 同而分离）
四、检测系统 功能：连续地将色谱柱中流出的组分随时间
变化的情况，转变成大小不同的电信 号输入到记录仪中，得到色谱图。 按检测方式不同，分为： ①总体性质检测器（通用型） 示差折射检测器、电导检测器 ②溶质性质检测器（选择型） 紫外（最常用，对大部分有机物有响应）、荧光、 电化学检测器
五、梯度洗涤
类似于GC中的程序升温。已成为现代高效液相色谱中 不可缺少的部分。气动放大泵
梯度洗提，就是载液中含有两种（或更多）不同极性的 溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配 比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离 因素，以提高分离效果。梯度洗提可以分为两种：
a.低压梯度（也叫外梯度）：在常压下，预先按一定程序将 两种或多种不同极性的溶剂混合后，再用一台高压泵输入色 谱柱。
目前常使用的有三种类型的输液泵，即往复柱塞泵、气动放大泵、 螺旋注射泵，它们各有优、缺点。
二、进样系统
高效液相色谱柱比气相色谱柱 短得多（约5～30cm），所以柱外 展宽（又称柱外效应）较突出。柱 外展宽是指色谱柱外的因素所引起 的峰展宽，主要包括进样系统、连 接管道及检测器中存在死体积。柱 外展宽可分柱前和柱后展宽。
液—质联用分析锦绣杜鹃叶黄酮类成分
1903年提出、1969～1970年开始发展
原理：以液体为相，采用高压输液系统，将具有不 同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液 等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分 被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样 的检测
六口旋转进样阀示意图
工作原理：手柄位于取样(Load)位置时， 样品经微量进样针从进样孔注射进定量环， 定量环充满后，多余样品从放空孔排出； 将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液 相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量 环，推动样品进入液相分析柱进行分析。
三、色谱柱
色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与 固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜 及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有 限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm， 内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往 内径较大，可达25mm 以上。一般在分离前备有一 个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这 样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱 和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保 证分离的性能不受影响。
技术：采用高效固定相、高压泵、高灵敏检测器
实现：分析速度快、分离效率高、操作自动化分析。
2 通过进样器，注入样品混合物
3.由于混合物中各组分 性质不同，因而它们在 柱内移动速度不同而逐 渐分离。
1 通过高压泵，将流动相抽入柱子
4.通过检测器检测，得到组分的 电信号并进行放大；记录仪将放百度文库大的电信号以图形形式记录下来。
b.高压梯度 ( 或称内梯度系统 ) ：利用两台高压输液泵，将 两种不同极性的溶剂按设定的比例送入梯度混合室，混合后， 进入色谱柱。
结果分析
黄酮类化合物 一级质谱中大多以 准离子分子形式存在，有少量碎片离 子。二级质谱中碎片信息则较少，主 要峰的质谱图见图 3 ～7。根据分析液 相中的色谱峰与总离子流图中所对应 的离子峰的质谱信息，并结合相关文 献的报道，对锦锈杜鹃 HPLC 分离出 的5 个主要峰进行分析，推断出其可能 的结构 。
1.高压
一般：150～300kg/cm2 ,甚至：500kg/cm2 为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压
2.高速
两相间交换千分之几秒，分析时间较经典法少很多(几分~几十分钟) 通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内可完成
3 高效
气相：2000塔板/米，液相：5000塔板/米
可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业蒸馏塔和气相 色谱的分离效能高出许多倍
4.高灵敏 紫外检测器：10－9g数量级
度
荧光检测器：10－11g(百万分之几），试样量小（几微升）
5.高选择 可分析在性质上极为相似化合物 性
（手性化合物、同位素、同分异构、空间异构）
相同点
1.都是重要的分离、分析 手段
2.气相的基本理论（塔板 理论、定性定量方法）
3.基本术语（色谱参数、 色谱图、色谱柱效）
上述每种色 谱类型均可进一 步分为多个不同 色谱方法。这些 方法可用于分析 分离，也可用于 制备分离，各色 谱方法在相关领 域应用互相补充。
一、泵系统
通用HPLC仪输液泵系统的基本要求是：提供(50-500)×105Pa的柱前 液压；输出无脉动恒定的液流；流速范围0.1-10mL/min；流速控制精度 0.5%或更好；系统组件耐腐蚀(密封性良好的不锈钢或氟塑料)。高压泵 产生的液体高压没有爆炸危险，因为液体的压缩性极小。最重要的是系 统密封性能好。
液相色谱-质谱（HPLC-MS）联用是以HPLC 为分离手段，MS为检测器的一门综合性分析技术， 它集HPLC的高分离能力与MS的高灵敏度、极强的 定性专属特异性于一体的技术。它以液体溶剂作为 流动相的色谱技术，一般在室温下操作。可以直接 分析不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物 （包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等），分析范围 广，而且不需衍生化步骤。
不同点
1.应用范围： 气相：易挥发、热稳定 液相：不易挥发、热不稳定 但具有一定溶解性化合物， 不适合气体。
2.流动相作用： 气相：运载样品，不影响色 谱分离 液相：运载样品，参与、影 响色谱分离，且起主要作用。
3.分析样品： 气相：破坏样品，不能回收。 液相：不破坏样品，能回收。
ⅰ液固吸附色谱（LSC)
（ 利用样品分子在固定相上吸附性能差异而分离）
ⅱ液液分配色谱（LLC）
（利用样品分子在两相中分配系数不同导致溶解度 不同而分离）（键合相色谱 60％） ⅲ离子交换色谱（IEC）
（利用样品分子的电荷性、导电性不同，导致对固 定相的亲合力不同而分离）
ⅳ体积排阻色谱（SEC)
（利用溶质分子大小不同导致对固定相的渗透力不 同而分离）
四、检测系统 功能：连续地将色谱柱中流出的组分随时间
变化的情况，转变成大小不同的电信 号输入到记录仪中，得到色谱图。 按检测方式不同，分为： ①总体性质检测器（通用型） 示差折射检测器、电导检测器 ②溶质性质检测器（选择型） 紫外（最常用，对大部分有机物有响应）、荧光、 电化学检测器
五、梯度洗涤
类似于GC中的程序升温。已成为现代高效液相色谱中 不可缺少的部分。气动放大泵
梯度洗提，就是载液中含有两种（或更多）不同极性的 溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配 比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离 因素，以提高分离效果。梯度洗提可以分为两种：
a.低压梯度（也叫外梯度）：在常压下，预先按一定程序将 两种或多种不同极性的溶剂混合后，再用一台高压泵输入色 谱柱。
目前常使用的有三种类型的输液泵，即往复柱塞泵、气动放大泵、 螺旋注射泵，它们各有优、缺点。
二、进样系统
高效液相色谱柱比气相色谱柱 短得多（约5～30cm），所以柱外 展宽（又称柱外效应）较突出。柱 外展宽是指色谱柱外的因素所引起 的峰展宽，主要包括进样系统、连 接管道及检测器中存在死体积。柱 外展宽可分柱前和柱后展宽。