第二章发酵产酶资料

二、微生物酶开发的一般程序
(一) 样品的采集 采样的目的、采样地点、采样方法及采样的数
量。 (二) 菌种的分离
培养基的确定、培养条件的确定。
(三) 菌种的初筛
(1)用简单的定性反应进行初筛； (2) 最初分离阶段给予特殊的培养基或培养条 件，让目的菌株大量繁殖。
(四) 菌种的复筛 初筛之后，还要进行复筛。复筛的目的是筛
第二章 酶的生产
第一节 微生物酶的开发
一、应用微生物开发酶的优点： (1)微生物生长快、周期短。生产能力 大， 能满足市场需求。 (2)微生物种类多，不同的环境下的微生物 以特殊的代谢方式分解利用不同的底物。为 酶品种的多样性提供了物质基础。
(3)通过基因工程使动植物细胞中的酶都能用微 生物细胞获得。因此，有计划地筛选菌种， 可以生产几乎任何一种酶。
三、微生物生长繁殖的测定方法
（一）测生长量
测体积（离心）
1.直接法
称干重
离心法（单细胞微生物） 过滤法（丝状微生物）
比浊法（分光光度计）
2.间接法
含氮量
生理指标法 含碳量
DNA含量测定
（二）计繁殖数
直接计数法
血球计数法 涂片计数法
间接计数法
涂布平板法 倒平板法
四、微生物的群体生长
一）无分支单细胞微生物的群体生长
形成谷氨酰胺
ATP
NH4+
ADP
谷氨酸
E:谷氨酰胺合成酶 谷氨酰-5-磷酸
Pi + H+
谷氨酰胺
谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸代 谢网络图
由-酮戌二酸合成脯氨酸
谷氨酸激酶
二氢吡咯-5-羧酸还原酶
谷氨酸脱氢酶 自动环化
谷氨酰--半醛
由-酮戌二酸合成精氨酸
转乙酰基酶
N-乙酰谷氨酸
厌氧培养（厌氧罐技术、滚管 技术、厌氧手
一个微生物细胞
合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。 如果同化作用的速度超过了异化作用
个体的生长 原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加
如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就 会发生繁殖，引起个体数目的增加。
群体内各个个体的进一步生长
群体的生长
还原
乙酰谷氨 酸激酶
N-乙酰谷氨酸半醛 转氨酶 转乙酰基酶
N-乙酰鸟氨酸
裂解酶
N-乙酰-谷氨酰磷酸 精氨酸琥珀酸
鸟氨酸
氨甲酰磷酸
瓜氨酸
转氨基甲酰酶
生物酶技术专题( 2014最新版)
第二节 微生物的培养
一、微生物的培养方法
获得单细胞 （纯培养）
套箱技术）
好氧培养
固体培养法 液体培养法
摇瓶培养 发酵罐
选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。 酶活的测定方法的建立对其很重要。
(五) 对复筛获得菌株的要求 (1)不是致病菌； (2)菌株不易变易和退化； (3)不易感染噬菌体； (4)微生物产酶量高； (5)酶的性质符合应用需要，最好是胞外酶； (6) 便于分离和提取，得率高； (7)微生物培养营养要求低。
硝酸纤维素膜 法
原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于具不同电荷的硝酸纤 维微孔滤膜上。 步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；
反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞； 除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细 胞，即为同步培养。
★这种细胞在培养过程中，一般经2 – 3个分裂周期就会丧失其同步性。
二、微生物的同步生长及同步培养方法
同步培养法：使培养基中所有微生物细胞处 于相同的生长阶段的培养方法。
同步生长：培养物中所有的微生物细胞都处 于同一生长阶段，并能同时分裂的生长方式。
获得同步生长的方法：
同 步培养法
诱 导法
筛 选法
化学诱导
过滤法
物理诱导
区带密度梯度离心法
膜洗脱法
获得同步生长的方法主要有两类： 环境条件诱导法：抗生素、变换温度、光线、培养基等。造成 与正常细胞周期不同的周期变化。 机械筛选法：选择性过滤、梯度离心或膜洗脱法。 物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。
1.特征：指数生长。
G = t/n
2.典型生长曲线 （Growth curve）
延对 滞数 期期
稳定期
衰亡期
时期的划分：按照生长速率常数R（growth race constant）的不同
延滞期（lag phase）
又称：停滞期、调整期、适应期
(六) 最佳产酶条件的初步确定
(1)培养方式的确定； (2)最佳培养条件组合； (3) 产酶特性(胞内酶、胞外酶)； (4)微生物酶收集的时间顺序；
Baidu Nhomakorabea
(七) 微生物产酶性能的进一步提高
(1)获得高产菌种的突变体； (2)利用代谢工程和代谢调节机理来提高酶产量； (3)运用基因工程技术将原有菌株中目的基因转 移到对生产环境更适应的菌株内，使其高效表 达；
(八) 微生物酶的提取方法 (1)酶的粗提； (2)酶的精制。
(九) 微生物产酶菌种的保藏 (1)斜面； (2)沙土管； (3)冷冻。
代谢流分析与控制
Gl ucose
细胞膜
=======================
PEP
Pyr
CO2
代谢工G程6P 是当今国际生化工程界R的ibu5新P 兴交
个体生长——微生物细胞个体吸收营养物质，进行新 陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。
群体生长——群体中个体数目的增加。可以用重量、 体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极 小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况）
个体生长个体繁殖 群体生长 群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖
纯培养(pure culture)——微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培 养繁殖而得到的后代,称纯培养。
叉学科，它F6P将计算机技术、自动Xyl5控P 制、基Rib因5P
操作技术1与,6FD发P 酵工程结合起来，研究生产过
程中D细HAP胞代谢流GAP的分布，利用代E4P谢控制理Sed论7P
和网络刚性理论G3P寻找限制代谢流率的代谢瓶
颈和代谢网络中制约转化率提高的酶反应，
PEP
为定向菌CO种2 选育和发酵控制Lac提供思路。
Pyr
Al a
CO2 AcCoA
Val
Oaa Mal
Suc
Isocit
CO2 NADP H
aKG
SucCoA
CO2
NH4 + AT P
Gl u
细胞膜
Gl u
Gl n
Gl n
=====================================
谷氨酸与谷氨酰胺产生代谢网络图
形成谷氨酸
谷氨酸脱氢酶既可利用NADH作为其辅酶，也可利 用NADPH作为其辅酶。