第二章发酵产酶资料
合集下载
第二章 微生物发酵产酶
曲霉、欧文氏菌 啤酒酵母、假丝酵母
水勇果于加工开，始果，汁、才果能酒找澄到清，成麻类纤维脱胶
功的路
制造转化糖
凝乳酶
米赫毛霉、大肠杆菌和真菌生产的重组酶 制造乳酪
脂肪酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖异构酶 青霉素酰化酶
曲霉、根霉、酵母等 青霉、曲霉 凝结芽胞杆菌，白色链霉菌 细菌、霉菌、放线菌
加酶洗涤剂，油脂加工，生物化工 食品去氧、除葡萄糖，测定葡萄糖 生产果葡糖浆 制造6-氨基青霉烷酸
第三节 发酵工艺条件及控制
工艺流程
原生质体 固定化原生质体
培养基
保藏细胞 细胞活化 扩大培养
发酵 分离纯化
酶
固定化细胞
预培养 无菌空气
一、细胞活化与扩大培养
1、生产菌种的来源
（1）购买或筛选
向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。 中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）； 中国典型培养物保藏中心（CCTCC，又称武大保藏中心）
一、产酶菌种的要求
1、发酵周期短，产量高； 2、容易培养和管理； 3、产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染； 4、利于酶的分离纯化； 5、安全可靠，无毒性。（非致病菌）。
二、产酶微生物
菌种是发酵生产酶的重要条件。已经在自然界中 发现的酶有数千种，目前投入工业发酵生产的酶约有 50～60种。它们的生产菌种十分广泛，包括细菌、放 线菌、酵母菌、霉菌。
工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
酶
α-淀粉酶
葡萄糖淀粉酶 中性蛋白酶 碱性蛋白酶
植酸酶
产酶微生物 枯草芽胞杆菌， 地衣芽胞 杆菌， 米曲霉
米曲霉，黑曲霉，米根霉 枯草芽胞杆菌，米曲霉
地衣芽胞杆菌 黑曲霉，毕赤酵母工程菌株
酶工程第二章微生物发酵产酶
细胞 浓度 mg/ml
酶 浓度 U/ml
细胞 浓度 mg/ml
酶 浓度 U/ml
以半乳糖醛酸为诱导物
以含有葡萄糖的果胶为诱导物
2、延续合成型
特点： 延续合成型的酶其生物合成可以受诱导物的诱
导，一般不受分解代谢物阻遏。 mRNA相当稳定。
3、滞后合成型
此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成 并大量积累。又称为非生长偶联型。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。
合成速率影响不大。如：DNA聚合酶、RNA聚 合酶、糖酵解途径的各种酶等。 适应型酶(adaptive enzyme)（调节型酶 regulated enzyme）： 在细胞中的含量变化很大，合成速率明显受到 环境因素的影响。如大肠杆菌分解乳糖的酶。 调节对象：适应型酶（调节型酶）
二、酶生物合成的调节
多种微生物混合发酵，保证有益微生物正常生长 繁殖和发酵代谢；
固态甑桶蒸馏提取成品酒。大曲酒酿造分为清渣 法和续渣法两种。
液体深层发酵
培养基：液体，在生物反应器中 优点： 适用范围广 机械化程度较高，技术管理较严格，酶的产率
较高，质量较稳定，产品回收率较高。 是目前发酵生产的主要方式。
制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等
(2) 醋酸杆菌（Acetobacter）
理想的酶合成模式
对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程\细胞工程等 先进技术,选育得到优良的菌株, 并通过工艺条件的优化 控制, 使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。
对于同步合成型的酶，要尽量提高其对应的mRNA的稳定性，
为此适当降低发酵温度是可取的措施；
对于滞后合成型的酶，要设法降低培养基中阻遏物的浓度，
第二章微生物发酵20121120
• 组成型 酶 环境因素对它们的合成速率影 响不大。如DNA、RNA聚合酶等。
• 适应型酶 环境因素对它们的合成速率影 响较大。
• 研究结果表明，转录水平的调节控制对酶 的生物合成是最重要的。
4.原核生物中酶生物合成的调节
• 转录水平的调节控制，又称为基因的调节， 它最早是由雅各(Jacnb)和莫诺德(Monod) 于1960年提出的操纵子学说来阐明的。 1965年，莫诺与雅可布即荣获诺贝尔生理 学与医学奖。
• 提供转录停止信号的DNA序列叫终止子。
5.转录的起始
• RNA转录酶结合到DNA链上，DNA双链部 分解开形成转录空泡.由σ因子辨认转录起 始位点。
• 加入的第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP。所形成 的启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起 始复合物，第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起 始点， σ亚基就会被释放脱离核心酶。
园盘固体发酵机
产品描述
• 规格范围:直径2m-12m 园盘固体发酵机（园盘式自动微生物培养 床），是在微生物培养平床的基础上不断 改进，并吸收国外某些先进经验，设计制 造。通过实践证明，比微生物培养平床更 先进，更优越，其条件更合适微生物的生 成、发育。
园盘式自动微生物培养床（园盘制 曲机）的主要特点
2、酶的发酵生产的种类
• 根据微生物培养方式的不同可分为： • 固体培养发酵 • 液体深层发酵 • 固定化微生物细胞发酵 • 固定化微生物原生质体发酵
1）. 固体发酵法
定义：利用麸皮和米糠为主要原料，添加谷 壳，豆饼等，加水拌成半固体状态，供微 生物生长和产酶用。
浅盘法、转桶法、厚层通气法
（1）浅盘法：将固态培养基平铺在浅盘（多为木
二、蛋白质的生物合成——翻译
• 翻译：以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核 糖体上通过各种tRNA，酶和辅助因子的作用， 合成多肽的过程。
• 适应型酶 环境因素对它们的合成速率影 响较大。
• 研究结果表明，转录水平的调节控制对酶 的生物合成是最重要的。
4.原核生物中酶生物合成的调节
• 转录水平的调节控制，又称为基因的调节， 它最早是由雅各(Jacnb)和莫诺德(Monod) 于1960年提出的操纵子学说来阐明的。 1965年，莫诺与雅可布即荣获诺贝尔生理 学与医学奖。
• 提供转录停止信号的DNA序列叫终止子。
5.转录的起始
• RNA转录酶结合到DNA链上，DNA双链部 分解开形成转录空泡.由σ因子辨认转录起 始位点。
• 加入的第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP。所形成 的启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起 始复合物，第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起 始点， σ亚基就会被释放脱离核心酶。
园盘固体发酵机
产品描述
• 规格范围:直径2m-12m 园盘固体发酵机（园盘式自动微生物培养 床），是在微生物培养平床的基础上不断 改进，并吸收国外某些先进经验，设计制 造。通过实践证明，比微生物培养平床更 先进，更优越，其条件更合适微生物的生 成、发育。
园盘式自动微生物培养床（园盘制 曲机）的主要特点
2、酶的发酵生产的种类
• 根据微生物培养方式的不同可分为： • 固体培养发酵 • 液体深层发酵 • 固定化微生物细胞发酵 • 固定化微生物原生质体发酵
1）. 固体发酵法
定义：利用麸皮和米糠为主要原料，添加谷 壳，豆饼等，加水拌成半固体状态，供微 生物生长和产酶用。
浅盘法、转桶法、厚层通气法
（1）浅盘法：将固态培养基平铺在浅盘（多为木
二、蛋白质的生物合成——翻译
• 翻译：以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核 糖体上通过各种tRNA，酶和辅助因子的作用， 合成多肽的过程。
第二章 (酶工程)微生物发酵产酶ppt课件
分解代谢物阻遏现象：
实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先 利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生 了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次 生长现象”(diauxie或biphasic growth）。
这一现象又称葡萄糖效应， 产生的原因是由于葡萄糖降解 物阻遏了分解乳糖酶系的合成。 此调节基因的产物是环腺苷酸 受体蛋白（CRP）,亦称降解物 基因活化蛋白（CAP）。
腺苷酸 环化酶 cAMP
抑制
CAP：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）
5'-AMP
磷酸二酯 酶 激活
分解代 谢产物
三、提高酶产量的策略
（一）菌种选育（一劳永逸） 1.诱变育种
(1) 使诱导型变为组成型——选育组成型突变株
(2)使阻遏型变为去阻遏型
C R P c A M P 复 合 物
C R P + c A M P
cAMP-CRP复合物的作用示意图
操纵基因（Operater gene）:
位于启动基因和结构基因之间的一段碱基 顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋 白结合，操纵酶合成的时机与速度。
结构基因（Structural gene）:
决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自 的对应关系，其中的遗传信息可转录为 mRNA，再翻译为蛋白质。
阻遏蛋白
蛋白质
诱导剂
调节基因(regulator gene)：
可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) （一种变构蛋白），通过与效应物 (effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合 而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。
酶工程第二章微生物发酵产酶
贵州茅台；山西汾酒；四川泸州老窖特曲酒；陕西西 凤酒；四川五粮液；四川全兴大曲酒；安徽古井贡酒； 贵州遵义董酒；郎酒；剑南春。
精品医学ppt
6
精品医学ppt
7
参与白酒生产中的微生物
1.霉菌
白酒生产常见的霉菌菌种：曲霉、根霉、念珠霉、青
霉、链孢霉等。
2.酵母菌
常见的酵母菌菌种：酒精酵母、产酯酵母、假丝酵母
采用固态配醅发酵，发酵物料的含水量较低，常 控制在55%～65%；
在较低温度下边糖化边发酵，保证酶和酵母的活 性，有利于香味物质的形成和累积；
多种微生物混合发酵，保证有益微生物正常生长 繁殖和发酵代谢；
固态甑桶蒸馏提取成品酒。大曲酒酿造分为清渣 法和续渣法两种。
精品医学ppt
22
精品医学ppt
精品医学ppt
10
大曲分类（按微生物来源）
传统大曲，菌种来源于大自然。 强化大曲，人工接入某些特殊菌种，使大曲在
糖化力、发酵力或产香方面更加突出。 纯种大曲，采用多菌纯种培养大曲，该大曲出
酒率高，是今后发展方向。
精品医学ppt
11
大曲分类（按制曲温度分）
高温大曲，培养制曲的最高温度在60℃以上，酱 香型和部分浓香型大曲酒，采用此大曲。
用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某 些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。 例如：葡萄糖阻遏 – 半乳糖苷酶的生物合成。
精品医学ppt
30
转录水平的调节——操纵子学说
转录水平的调节机制 2、酶生物合成的诱导作用 加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行
的现象，成为酶生物合成的诱导作用，简称为 诱导作用。 如：乳糖诱导分解乳糖相关酶的产生。
第二章 微生物发酵产酶
精品医学ppt
6
精品医学ppt
7
参与白酒生产中的微生物
1.霉菌
白酒生产常见的霉菌菌种：曲霉、根霉、念珠霉、青
霉、链孢霉等。
2.酵母菌
常见的酵母菌菌种：酒精酵母、产酯酵母、假丝酵母
采用固态配醅发酵，发酵物料的含水量较低，常 控制在55%～65%；
在较低温度下边糖化边发酵，保证酶和酵母的活 性，有利于香味物质的形成和累积；
多种微生物混合发酵，保证有益微生物正常生长 繁殖和发酵代谢；
固态甑桶蒸馏提取成品酒。大曲酒酿造分为清渣 法和续渣法两种。
精品医学ppt
22
精品医学ppt
精品医学ppt
10
大曲分类（按微生物来源）
传统大曲，菌种来源于大自然。 强化大曲，人工接入某些特殊菌种，使大曲在
糖化力、发酵力或产香方面更加突出。 纯种大曲，采用多菌纯种培养大曲，该大曲出
酒率高，是今后发展方向。
精品医学ppt
11
大曲分类（按制曲温度分）
高温大曲，培养制曲的最高温度在60℃以上，酱 香型和部分浓香型大曲酒，采用此大曲。
用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某 些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。 例如：葡萄糖阻遏 – 半乳糖苷酶的生物合成。
精品医学ppt
30
转录水平的调节——操纵子学说
转录水平的调节机制 2、酶生物合成的诱导作用 加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行
的现象，成为酶生物合成的诱导作用，简称为 诱导作用。 如：乳糖诱导分解乳糖相关酶的产生。
第二章 微生物发酵产酶
第二章 酶的生物合成与发酵生产
第二章酶的生物合成与发酵生产酶工程就是将酶所具有的生物催化功能，借助工程手段应用于社会生活的一门科学技术。
酶制剂是如何生产的呢？我们知道，酶是活细胞产生的具有催化作用的生物大分子，广泛存在于动植物和微生物体内。
酶的生产方法有三种：提取分离法、生物合成法、化学合成法。
生物合成法又包括：微生物细胞发酵产酶、植物细胞发酵产酶和动物细胞发酵产酶第一节酶生物合成及调节一、酶的生物合成先从遗传信息传递的中心法则谈起（1958年，Crick提出）遗传信息传递的中心法则：生物体通过DNA复制将遗传信息由亲代传递给子代，通过RNA 转录和翻译而使遗传信息在子代得以表达。
DNA具有基因的具有基因的所有属性。
基因是DNA的一个片段，基因的功能最终由蛋白质来执行，RNA控制着蛋白质的合成。
核酸是遗传的物质基础，蛋白质是生命活动的体现者。
1970年Temin和Baitimore发现了逆转录酶，是对中心法则的补充。
即：细胞能否合成某种酶分子。
首先取决于细胞中的遗传信息载体－DNA分子中是否存在有该酶所对应的基因。
DNA分子可以通过复制生成新的DNA，再通过转录（transcription）生成所对应的RNA，然后再翻译（translation）成为多肽链，经加工而成为具有完整空间结构的酶分子。
（一）RNA的生物合成--转录(transcription)P102DNA分子中的遗传信息转移到RNA分子中的过程，称为转录。
转录：见课件附图，书P102定义：以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。
模板链（template strand）：又称反意义链（antisense strand），指导转录作用的一条DNARNA的转录过程：转录过程分为三步：起始、延长、.终止补充：原核生物的RNA聚合酶(DDRP)-见课件附图E.coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（α2、β、β′、）全酶（holoenzyme）包括起始因子σ和核心酶（core enzyme）。
微生物发酵产酶
Back
抗体酶 （abzyme）
是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。
抗体酶制备的理论依据： 1948年， Pauling提出的过渡态理论； 1975年，Kohler和 Milstein发明的单克隆抗体制备技术； 1986年，Lerner和Schultz 分别获得具有催化活性的抗体酶。此 后，不少抗体酶被制备出来。
本章小结
1. 不是所有的微生物都能用于发酵产酶；
2. 微生物生长有4个时期，微生物培养产酶有4种方式，可根据 蛋白质生物合成理论、操纵子理论调节控制；
3. 影响微生物生长的环境因素有：培养基的组成、pH、温度、 溶解氧，精心调节，效益增加；
4. 固定化微生物发酵产酶是在传统方式上的一种新尝试，优点 很多。
一、酶生物合成的模式 二、细胞生长动力学 三、产酶动力学
酶生物合成的模式
细胞生长过程（4个阶段）： 调整期、生长期、平衡期、衰退期。
酶生物合成模式（4种）： P60图2－9 ➢ 同步合成型 ➢ 延续合成型 ➢ 中期合成型 ➢ 滞后合成型 结论：最理想的合成模式是延续合成型。
第五节 固定化微生物细胞发酵产酶 第六节 固定化微生物原生质体发酵产酶
P53
调节pH值的必要性: 培养基的pH值与细胞的生长、繁殖以及 发酵产酶关系密切。
pH值变化的原因：
细胞的生长和代谢产物的积累；
细胞特性；
培养基的组成成分；
P54
发酵工艺条件。
调节pH值常用的的方法：
改变培养基的组分或其比例； 使用缓冲液； 通过流加适宜的酸、碱溶液到培养 基中。
Back
产生一种阻遏 决定酶的合成
蛋白，由多个 是否开始，有
亚基组成。 两个位点：一
抗体酶 （abzyme）
是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。
抗体酶制备的理论依据： 1948年， Pauling提出的过渡态理论； 1975年，Kohler和 Milstein发明的单克隆抗体制备技术； 1986年，Lerner和Schultz 分别获得具有催化活性的抗体酶。此 后，不少抗体酶被制备出来。
本章小结
1. 不是所有的微生物都能用于发酵产酶；
2. 微生物生长有4个时期，微生物培养产酶有4种方式，可根据 蛋白质生物合成理论、操纵子理论调节控制；
3. 影响微生物生长的环境因素有：培养基的组成、pH、温度、 溶解氧，精心调节，效益增加；
4. 固定化微生物发酵产酶是在传统方式上的一种新尝试，优点 很多。
一、酶生物合成的模式 二、细胞生长动力学 三、产酶动力学
酶生物合成的模式
细胞生长过程（4个阶段）： 调整期、生长期、平衡期、衰退期。
酶生物合成模式（4种）： P60图2－9 ➢ 同步合成型 ➢ 延续合成型 ➢ 中期合成型 ➢ 滞后合成型 结论：最理想的合成模式是延续合成型。
第五节 固定化微生物细胞发酵产酶 第六节 固定化微生物原生质体发酵产酶
P53
调节pH值的必要性: 培养基的pH值与细胞的生长、繁殖以及 发酵产酶关系密切。
pH值变化的原因：
细胞的生长和代谢产物的积累；
细胞特性；
培养基的组成成分；
P54
发酵工艺条件。
调节pH值常用的的方法：
改变培养基的组分或其比例； 使用缓冲液； 通过流加适宜的酸、碱溶液到培养 基中。
Back
产生一种阻遏 决定酶的合成
蛋白，由多个 是否开始，有
亚基组成。 两个位点：一
微生物发酵产酶(2)
医学ppt
16
任何培养基都应该具备微生物生长所需要五 大营养要素！！！
培养基（medium）是人工配制的，适合微生物生长繁 殖或产生代谢产物的营养基质。 培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础
五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水
医学ppt
17
水
水是微生物最基本的组成分（７０％—９０％） 水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物） 水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动 调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）
医学ppt
2
基本要求：
不是致病菌
发酵周期短，产酶量高
不易变异退化
最好是产生胞外酶的菌种,利于分离。
对医药和食品用酶,还应考虑安全性：
凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶, 安全!
由非致病微生物制取的酶，需作短期毒性实验。
非常见微生物制取的酶，需做广泛的毒性实验，包括慢性
医学ppt
10
(2)曲霉(Aspergillus)
分类：多数属于子囊菌 亚门，少数属于半知菌 亚门。
分布：广泛分布于土壤 、空气和谷物上，可引 起食物、谷物和果蔬的 霉腐变质，有的可产生 致癌性的黄曲霉毒素。
医学ppt
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
11
代表种：黑曲霉Asp. Niger、黄曲霉Asp.flavus和 米曲霉Asp.oryzae
具有分枝状菌丝的单细胞原核微生物。革兰氏阳性，菌丝 有气生菌丝和基内菌丝之分。常用于酶生产的主要为链霉 菌。
应用：主要生产葡萄糖异 构酶，还可生产青霉素酰 化酶、纤维素酶、碱性蛋 白酶、几丁质酶等。
医学ppt
8
三、霉菌
(1) 根霉(Rhizopus)
酶的发酵生产
特点： ①适用性强，可用于各种细胞的悬浮培养和发酵； ②易于人为控制； ③机械化程度高，酶产品质量较好，酶产率及产品回收率较 高。 （三）固定化细胞发酵（70 年代后期） 固定化细胞： 固定在水不溶性载体上，在一定的空间范围内进行生命 活动（生长、繁殖和新陈代谢）的细胞。
优点： ①固定化细胞的密度较高，反应器水平的生产强度较大，可提 高生产能力； ②发酵稳定性好，固定化细胞可以反复使用或连续使用较长的 时间，易于连续化，自动化生产； ③细胞固定在载体上，流失较少，可在高稀释率的情况下连续 发酵，大大提高设备利用率； ④发酵液中含细胞较少，利于产品分离纯化，提高产品质量。 缺点： ①只适用于胞外酶的生产； ②技术要求较高，需要特殊的固定化细胞反应器，且许多技术 问题都有待研究解决。
二．发酵液的分离、过滤：得到粗品 设备：转鼓式真空吸滤机，离心沉降分离机，板框压滤机。 三．酶液的脱色 活性炭或使用无离子交换作用的脱色树脂。 四．发酵液的浓缩与初步提纯 （一）盐析 1．常用的盐：MgSO4, (NH4)2SO4, (Na)2SO4, NaH2PO4, 它们 盐析蛋白质的能力一般按以上顺序依次增大。实际应用得最多的 是(NH4)2SO4，因其溶解度 在较低的温度下仍相当高。 2．优点：在常温沉淀过程中不会造成酶的失活，沉淀物在室温 下可长期放置，分级沉淀可去除大部分杂质，适用于多数酶的沉 淀。 3．缺点：要经脱盐处理。
七．提高酶产量的其它措施 1．添加诱导物 诱导物一般分为三类：酶的作用底物或底物类似物以及酶的 反应产物。 选择： a. 特异性； b. 诱导效果； c. 来源。 2．控制阻遏物浓度 根据不同的阻遏类型，采取不同的控制方式 ①分解代谢物阻遏
a. 采用其它的碳源； b. 控制浓度，或分次流加； c. 加一定量的cAMP. ②反馈阻遏 a. 控制终产物浓度； b. 添加末端产物类似物。 3．添加表面活性剂 4．添加产酶促进剂
酶的发酵工程
温（冷）水进行调节控制，固态发酵可通过通风量或风 温来进行调节。
图2-1 温度调节装臵
第二章 酶的发酵工程
3. 溶解氧对产酶的影响与调节控制 临界氧浓度——不影响细胞正常代谢的最低氧浓度
溶氧浓度是由溶氧速率和耗氧速率来决定的。 调节控制 ① 调节氧分压 ② 增加通气量 ③ 延长气液接触时间，增加气液接触面积 ④ 改变培养液的性质 改变组分或浓度，添加消泡剂 改变进气压力或罐压，改变氧含量， 添加氧载体
第二章 酶的发酵工程
一、酶的生产菌种
（一）产酶微生物的种类 1. 细菌：大肠杆菌—青霉素酰化酶、L-天冬酰胺酶；
枯草芽孢杆菌—中性蛋白酶、中温α-淀粉酶； 地衣芽孢杆菌—高温α-淀粉
2. 放线菌：葡萄糖异构酶、谷氨酰胺转氨酶 3. 酵母菌：凝血激酶、尿激酶、植酸酶 4. 霉菌：黑曲霉、米曲霉—α-淀粉酶、糖化酶、乳糖酶、
醚，泡敌（聚环氧丙烷环氧乙烷甘油）。勤加、少加较好
第二章 酶的发酵工程
5. 湿度对产酶的影响与控制
对固体发酵产酶而言，影响微生物的产酶量，也会影
响产酶达到高峰的时间。
特定菌种，发酵过程的不同时期，对湿度要求不同。 固态发酵产酶，前期湿度低，后期湿度高，有利于产酶。
调节控制
配制培养基时，控制物料的含水量；控制鼓风量大小， 或调节空气的湿度；喷洒水分
第一节
酶生物合成的调节机制
一、原核生物中酶生物合成的调节
原核生物酶的合成主要是在转录水平上进行调节，调 节方式主要有酶合成的诱导和酶合成的阻遏两种方式 原核生物中酶合成的诱导和阻遏作用机制：Jacob和 Monod提出的操纵子理论
第二章 酶的发酵工程
（一）乳糖操纵子学说
1. 基本概念
操纵子：在代谢途径中功能密切相关的一组蛋白质编码
图2-1 温度调节装臵
第二章 酶的发酵工程
3. 溶解氧对产酶的影响与调节控制 临界氧浓度——不影响细胞正常代谢的最低氧浓度
溶氧浓度是由溶氧速率和耗氧速率来决定的。 调节控制 ① 调节氧分压 ② 增加通气量 ③ 延长气液接触时间，增加气液接触面积 ④ 改变培养液的性质 改变组分或浓度，添加消泡剂 改变进气压力或罐压，改变氧含量， 添加氧载体
第二章 酶的发酵工程
一、酶的生产菌种
（一）产酶微生物的种类 1. 细菌：大肠杆菌—青霉素酰化酶、L-天冬酰胺酶；
枯草芽孢杆菌—中性蛋白酶、中温α-淀粉酶； 地衣芽孢杆菌—高温α-淀粉
2. 放线菌：葡萄糖异构酶、谷氨酰胺转氨酶 3. 酵母菌：凝血激酶、尿激酶、植酸酶 4. 霉菌：黑曲霉、米曲霉—α-淀粉酶、糖化酶、乳糖酶、
醚，泡敌（聚环氧丙烷环氧乙烷甘油）。勤加、少加较好
第二章 酶的发酵工程
5. 湿度对产酶的影响与控制
对固体发酵产酶而言，影响微生物的产酶量，也会影
响产酶达到高峰的时间。
特定菌种，发酵过程的不同时期，对湿度要求不同。 固态发酵产酶，前期湿度低，后期湿度高，有利于产酶。
调节控制
配制培养基时，控制物料的含水量；控制鼓风量大小， 或调节空气的湿度；喷洒水分
第一节
酶生物合成的调节机制
一、原核生物中酶生物合成的调节
原核生物酶的合成主要是在转录水平上进行调节，调 节方式主要有酶合成的诱导和酶合成的阻遏两种方式 原核生物中酶合成的诱导和阻遏作用机制：Jacob和 Monod提出的操纵子理论
第二章 酶的发酵工程
（一）乳糖操纵子学说
1. 基本概念
操纵子：在代谢途径中功能密切相关的一组蛋白质编码
第二章 微生物产酶
滞后合成型
• 1）细胞生长一段时间或进入平衡期以后才开始酶 的合成，又称非生长偶联型。
• 2）许多水解酶属于此合成模型。 • 3）阻碍物存在延缓了酶的合成。 • 4）酶的mRNA稳定。 • 5）滞后合成型↔延续合成型。
6）典型例子：黑曲霉培养合成羧基蛋白酶
图2-11，黑曲霉细胞生长约 24h后，几乎进入平衡期， 此时羧基蛋白酶才开始合成， 直至80h，酶的合成还在继 续。
④最好分泌胞外酶，产量高且易纯化。
⑤能利用廉价原料，营养要求低，对培养基要 求不苛刻，发酵周期短、原料利用率高、易于 培养。
采用一个新的产酶菌时，应有大量病理或动物 喂养实验数据作基础。美国FDA认定可用于食 品医药工业的生产菌有：曲霉（黑曲霉、米曲 霉）、枯草杆菌、某些芽孢杆菌、某些酵母、 根霉等。
5）典型例子：米曲霉培养生产单宁酶
图2-8 所示，单宁酶的生物合成与米曲霉细胞生长同步，属于同步合成 型（生长偶联型）
延续合成型
1）酶的生物合成伴随细胞生长开始，当细胞进入 平衡期后酶还可以继续合成。
2）酶的生物合成可以被诱导物诱导，一般不被细 胞代谢物阻碍。
3）酶的mRNA相当稳定。在平台期仍然可以翻译成 酶。
4）典型的例子， 黑曲霉培养生产聚半乳糖醛酸酶（图2-9A）。
图2-9A，以半乳糖醛酸为诱导物的情况下，培养一段时间以后（约40h）， 细胞生长旺盛，半乳糖醛酸酶开始合成；当细胞生长达到平衡期（约 80h），此酶继续合成，直至约120h以后。呈现延续合成型模式。 图2-9B，以粗果胶（含葡萄糖）为诱导物时，细胞生长较快，但是聚半乳 糖醛酸酶的合成被推迟。 因此，酶合成受到分解代谢物阻遏，葡萄糖被细胞利用完之后，酶才开始 合成，细胞进入平衡期，酶的合成还在继续。呈现滞后合成型模式。
第二章发酵产酶资料
厌氧培养（厌氧罐技术、滚管 技术、厌氧手
一个微生物细胞
合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。 如果同化作用的速度超过了异化作用
个体的生长 原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加
如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就 会发生繁殖，引起个体数目的增加。
群体内各个个体的进一步生长
群体的生长
1.特征：指数生长。
G = t/n
2.典型生长曲线 （Growth curve）
延对 滞数 期期
稳定期
衰亡期
时期的划分：按照生长速率常数R（growth race constant）的不同
延滞期（lag phase）
又称：停滞期、调整期、适应期
1.现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。 2.特点：
还原
乙酰谷氨 酸激酶
N-乙酰谷氨酸半醛 转氨酶 转乙酰基酶
N-乙酰鸟氨酸
裂解酶
N-乙酰-谷氨酰磷酸 精氨酸琥珀酸
鸟氨酸
氨甲酰磷酸
瓜氨酸
转氨基甲酰酶
生物酶技术专题( 2014最新版)
第二节 微生物的培养
一、微生物的培养方法
获得单细胞 （纯培养）
套箱技术）
好氧培养
固体培养法 液体培养法
摇瓶培养 发酵罐
Pyr
Al a
CO2 AcCoA
Val
Oaa Mal
SucLeabharlann IsocitCO2 NADP H
aKG
SucCoA
CO2
NH4 + AT P
Gl u
细胞膜
Gl u
Gl n
Gl n
=====================================
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
二、微生物酶开发的一般程序
(一) 样品的采集 采样的目的、采样地点、采样方法及采样的数
量。 (二) 菌种的分离
培养基的确定、培养条件的确定。
(三) 菌种的初筛
(1)用简单的定性反应进行初筛； (2) 最初分离阶段给予特殊的培养基或培养条 件，让目的菌株大量繁殖。
(四) 菌种的复筛 初筛之后，还要进行复筛。复筛的目的是筛
二、微生物的同步生长及同步培养方法
同步培养法：使培养基中所有微生物细胞处 于相同的生长阶段的培养方法。
同步生长：培养物中所有的微生物细胞都处 于同一生长阶段，并能同时分裂的生长方式。
获得同步生长的方法：
同 步培养法
诱 导法
筛 选法
化学诱导
过滤法
物理诱导
区带密度梯度离心法
膜洗脱法
获得同步生长的方法主要有两类： 环境条件诱导法：抗生素、变换温度、光线、培养基等。造成 与正常细胞周期不同的周期变化。 机械筛选法：选择性过滤、梯度离心或膜洗脱法。 物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。
(六) 最佳产酶条件的初步确定
(1)培养方式的确定； (2)最佳培养条件组合； (3) 产酶特性(胞内酶、胞外酶)； (4)微生物酶收集的时间顺序；
(七) 微生物产酶性能的进一步提高
(1)获得高产菌种的突变体； (2)利用代谢工程和代谢调节机理来提高酶产量； (3)运用基因工程技术将原有菌株中目的基因转 移到对生产环境更适应的菌株内，使其高效表 达；
形成谷氨酰胺
ATP
NH4+
ADP
谷氨酸
E:谷氨酰胺合成酶 谷氨酰-5-磷酸
Pi + H+
谷氨酰胺
谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸代 谢网络图
由-酮戌二酸合成脯氨酸
谷氨酸激酶
二氢吡咯-5-羧酸还原酶
谷氨酸脱氢酶 自动环化
谷氨酰--半醛
由-酮戌二酸合成精氨酸
转乙酰基酶
N-乙酰谷氨酸
三、微生物生长繁殖的测定方法
（一）测生长量
测体积（离心）
1.直接法
称干重
离心法（单细胞微生物） 过滤法（丝状微生物）
比浊法（分光光度计）
2.间接法
含氮量
生理指标法 含碳量
DNA含量测定
（二）计繁殖数
直接计数法
血球计数法 涂片计数法
间接计数法
涂布平板法 倒平板法
四、微生物的群体生长
一）无分支单细胞微生物的群体生长
叉学科，它F6P将计算机技术、自动Xyl5控P 制、基Rib因5P
操作技术1与,6FD发P 酵工程结合起来，研究生产过
程中D细HAP胞代谢流GAP的分布，利用代E4P谢控制理Sed论7P
和网络刚性理论G3P寻找限制代谢流率的代谢瓶
颈和代谢网络中制约转化率提高的酶反应，
PEP
为定向菌CO种2 选育和发酵控制Lac提供思路。
第二章 酶的生产
第一节 微生物酶的开发
一、应用微生物开发酶的优点： (1)微生物生长快、周期短。生产能力 大， 能满足市场需求。 (2)微生物种类多，不同的环境下的微生物 以特殊的代谢方式分解利用不同的底物。为 酶品种的多样性提供了物质基础。
(3)通过基因工程使动植物细胞中的酶都能用微 生物细胞获得。因此，有计划地筛选菌种， 可以生产几乎任何一种酶。
还原
乙酰谷氨 酸激酶
N-乙酰谷氨酸半醛 转氨酶 转乙酰基酶
N-乙酰鸟氨酸
裂解酶
N-乙酰-谷氨酰磷酸 精氨酸琥珀酸
鸟氨酸
氨甲酰磷酸
瓜氨酸
转氨基甲酰酶
生物酶技术专题( 2014最新版)
第二节 微生物的培养
一、微生物的培养方法
获得单细胞 （纯培养）
套箱技术）
好氧培养
固体培养法 液体培养法
摇瓶培养 发酵罐
个体生长——微生物细胞个体吸收营养物质，进行新 陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。
群体生长——群体中个体数目的增加。可以用重量、 体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极 小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况）
个体生长个体繁殖 群体生长 群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖
纯培养(pure culture)——微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培 养繁殖而得到的后代,称纯培养。
选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。 酶活的测定方法的建立对其很重要。
(五) 对复筛获得菌株的要求 (1)不是致病菌； (2)菌株不易变易和退化； (3)不易感染噬菌体； (4)微生物产酶量高； (5)酶的性质符合应用需要，最好是胞外酶； (6) 便于分离和提取，得率高； (7)微生物培养营养要求低。
(八) 微生物酶的提取方法 (1)酶的粗提； (2)酶的精制。
(九) 微生物产酶菌种的保藏 (1)斜面； (2)沙土管； (3)冷冻。
代谢流分析与控制
Gl ucose
细胞膜
=======================
PEP
Pyr
CO2
代谢工G程6P 是当今国际生化工程界R的ibu5新P 兴交
厌氧培养（厌氧罐技术、滚管 技术、厌氧手
一个微生物细胞
合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。 如果同化作用的速度超过了异化作用
个体的生长 原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加
如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就 会发生繁殖，引起个体数目的增加。
群体内各个个体的进一步生长
群体的生长
硝酸纤维素膜 法
原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于具不同电荷的硝酸纤 维微孔滤膜上。 步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；
反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞； 除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细 胞，即为同步培养。
★这种细胞在培养过程中，一般经2 3个分裂周期就会丧失其同步性。
1.特征：指数生长。
G = t/n
2.典型生长曲线 （Growth curve）
延对 滞数 期期
稳定期
衰亡期
时期的划分：按照生长速率常数R（growth race constant）的不同
延滞期（lag phase）
又称：停滞期、调整期、适应期
Pyr
Al a
CO2 AcCoA
Val
Oaa Mal
Suc
Isocit
CO2 NADP H
aKG
SucCoA
CO2
NH4 + AT P
Gl u
细胞膜
Gl u
Gl n
Gl n
=====================================
谷氨酸与谷氨酰胺产生代谢网络图
形成谷氨酸
谷氨酸脱氢酶既可利用NADH作为其辅酶，也可利 用NADPH作为其辅酶。