USP微生物试验说明
USP微生物限度及无菌检验方法1
USP微生物限度及无菌检验方法1 表1. 培养基的生长促进、抑菌、指示性能定量检测—选择和再培养—将在样品的制备和预培养项下规定的制备品和/或分别包含，，和（或0.1毫升，0.01毫升，和0.001毫升）该供试品的稀释液，接种于适量的肠道菌增菌肉汤培养基Mossel。
在温度30℃至35℃下培养24至48小时。
在紫红色胆汁葡萄琼脂培养基的平皿上对培养物进行再次培养。
在温度30℃至35℃下培养18至24小时。
说明—菌落的生长构成了阳性结果。
记录产生阳性结果的最少量供试品和产生阴性结果的最大量供试品。
从表2中大概确定细菌的数量。
表2. 结果的说明大肠杆菌样品的制备和预培养—按在非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节下的描述，将不少于1克的供试品以1:10稀释来制备样品，并使用10毫升或对应1克或1毫升的数量，接种于适量（按照检查方法的适用性项下的内容来确定）的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基，混匀，并在温度30℃至35℃下培养18至24小时。
选择和再次培养—摇动容器，转移1毫升大豆酪蛋白消化物肉汤培养基至100毫升的麦康凯（MacConkey）肉汤培养基，并在温度42 ℃至44 ℃下培养24至48小时。
在温度30至35℃下，于麦康凯（MacConkey）琼脂培养基的平皿上再次培养18至72小时。
说明—菌落的生长表明了大肠杆菌存在的可能性。
这需通过鉴别检测来证明。
如果没有菌落存在或如果确认鉴别检测为阴性，则该供试品符合该检测的要求。
沙门氏杆菌样品的制备和预培养—按照在非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节下的描述制备供试品，并使用对应不少于10克或10毫升的数量接种于适量（按照检查方法的适用性项下内容来确定）的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基，混合，在温度30℃至35℃下培养18至24小时。
选择和再次培养—大豆酪蛋白消化物肉汤培养基至10毫升氯化镁孔雀绿沙门氏菌富集肉汤培养基，并在温度30至35℃之间培养18至24小时。
USP 非无菌产品微生物限度检查 控制菌 USP
62 MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: TESTS FOR SPECIFIEDMICROORGANISMS非无菌产品微生物限度检查:控制菌（USP38）1.INTRODUCTION导言The tests described hereafter will allow determination of the absence of, or limited occurrence of, specified microorganisms that may be detected under the conditions described.控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。
The tests are designed primarily to determine whether a substance or preparation complies with an established specification for microbiological quality. When used for such purposes, follow the instructions given below, including the number of samples to be taken, and interpret the results as stated below.当本法用于检查非无菌制剂及其原辅料是否符合相应的微生物限度标准时,应按下列规定进行检验，,包括样品的取样量,结果的判断.Alternative microbiological procedures, including automated methods, may be used, provided that their equivalence to the Pharmacopeial method has been demonstrated.可以使用包括自动化法在内的方法,需确认与药典方法的等同性.2.GENERAL PROCEDURES通用规程The preparation of samples is carried out as described in Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests 61.供试品制备,同USP<61>If the product to be examined has antimicrobial activity, this is insofar as possible removed or neutralized as described in Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests 61.若供试品有抗菌活性,应尽可能中和或去除,中和或去除的方法同USP<61>If surface-active substances are used for sample preparation, their absence of toxicity for microorganisms and their compatibility with any inactivators used must be demonstrated as described in Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests 61.若供试品制备过程中使用了表面活性剂,应确认其对微生物的无毒性以及与所用的中和剂/灭活剂的相容性，同USP<61>3.GROWTH-PROMOTING AND INHIBITORY PROPERTIES OF THE MEDIA, SUITABILITYOF THE TEST AND NEGATIVE CONTROLS 培养基适用性检查，控制菌检查方法的适用性确认，阴性对照The ability of the test to detect microorganisms in the presence of the product to be tested must be established. Suitability must be confirmed if a change in testing performance or a change in the product that may affect the outcome of the test is introduced.在有供试品存在的情况下，所建立的方法应能检测微生物。
USP29(61)_微生物限度检查
USP29-<61> 微生物限度检查<61> 微生物限度检查本章所提供的检测程序用于测定包括原料药及制剂在内的各种药品中需氧菌数量以及不含有指定的微生物。
如果已有充分的证据证明某种自动化的方法可以给出与本章所提供的方法等效的或更好的实验结果，可以用该方法替代本章所提供的方法。
在实验准备以及实施的过程中，应遵守无菌操作。
除另有规定外，本检查法中“孵育”是指将容器置于温度控制在30-35˚C的空气中24-48小时。
术语“生长”在此处是专用于表示存活的微生物的增殖。
预试验（验证试验）应有充分的证据证明在实验条件下检品本身对可能存在微生物的增殖无抑制作用，这在很大程度上决定了下述所规定的检查方法的结果有效性。
因此，应进行预试验，测定金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌以及沙门氏菌分别接种到稀释的检品中共同培养后的存活情况，以使检查标准化并作为随后试验的具体要求。
方法如下：接种1ml金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌以及沙门氏菌的24小时肉汤培养物（稀释度大于等于10-3）至最低稀释级样品供试液中（样品用pH 7.2磷酸盐缓冲液, 大豆-酪蛋白水解物琼脂培养基或乳糖液体培养基稀释），若微生物在相应的培养基中不能生长，则该部分试验无效，有必要按下述步骤对实验进行调整：通过（1），增加稀释剂的体积，供试品量保持不变，或（2）在稀释剂中加入足够量的灭活剂；或（3）适当地将（1）和（2）结合使接种物可以生长。
可在培养基中加入0.5%的大豆卵磷脂和4.0%的聚山梨酸酯-20以中和供试品中的所存在的抑菌成分。
或者用酪蛋白水解物-大豆卵磷脂-聚山梨酸酯-20-培养基按前述方法重复试验以确认对供试品中的保护剂或其他抗菌剂的中和作用。
若产品中含有抑菌成分，而该产品又是可溶的，可采用无菌检查项下产品的无菌检查法中的薄膜过滤法。
如果在加入灭活剂或大大增加稀释剂的体积后仍不能使上述培养物恢复存活，而且该产品不适合采用薄膜过滤法，可以作如下推断：所接种微生物的分离培养失败是由于该产品的抑菌活性。
微生物检测方法-USP
<61>非无菌产品微生物检查：微生物计数检查简介：下述方法能够对在有氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌进行定量计数。
该检查主要是为了确定某种物质或剂型是否符合既定的微生物质量标准。
当以此为目的时，按照下面给出的规定进行，包括所需的样品数量以及按照下文规定的要求对结果进行描述。
此方法不适用于用活微生物作为活性成分的产品。
若使用了其他的微生物程序，包括自动方法，则应提供其等同于药典方法的证明。
一般程序为了避免外来微生物的影响，必须在设定的条件下进行微生物检查。
为避免此污染所采取的预防措施必须不影响所要进行检查的微生物。
如果待测样品具有抗微生物活性，则在可能的情况下，移除或中和这种抗微生物活性。
如果因此而是用了钝化剂，则必须证明其有效性及对微生物无毒性。
如果在处理样品时使用了表面活性剂，必须证明其对微生物无毒性及与证明其所使用的钝化剂的兼容性。
计数方法用薄膜过滤法和平皿计数法。
最大机率法（MPN）一般来说最不准确的微生物计数方法。
但是对于生物负荷非常小的确定的产品来说可能是最适合的方法。
对检查方法的选择是基于像产品的本质和微生物的限度这样一些因素。
所选择的方法必须能够用足够的样品来判断出其是否符合标准规定。
必须证明所选择的方法的适用性。
生长促进试验、计数方法的适用性和阴性对照一般原则必须证明检测方法能够从携带微生物的样品中检测出此微生物。
如果在检测过程中有了改变或会影响检测结果的产品的改变，则必须证明其适用性。
测试菌株的准备用标准化的测试菌株的稳定混悬液或用下述规定的方法准备测试菌株。
使用菌种培养维护技术（菌种系统），以使从原始主菌株中移除的用于接种的微生物不大于5个片段。
按照表1中所描述的方法分别对细菌和真菌的测试菌株进行培养。
用PH 7.0 的氯化钠-蛋白胨缓冲液或PH 7.2 磷酸盐缓冲液来配制测试混悬液；制备A. brasiliensis 孢子混悬液，可加入0.05%的聚山梨酯80。
在2小时内使用该混悬液或如果在2°－8°储存则在24小时内使用。
微生物实验室良好规范 USP_1117
公用系统取样：如，水，无菌取样方式
微生物实验室布局与操作
环境监测取样
仪器设备的摆放与移除对无菌操作要求较低 设备仪器应同时与微生物培养基同时摆放
各类无菌检验：应在控制环境中进行
无菌制剂 原料药 发酵菌种 生物制品菌种
隔离器 <1208>
样品操作
样品操作
操作与储存条件：关键 微生物样品：水、环境监测样、生物负荷样 关键参数： 样品成分 包材成份 储存时间 储存温度 取样操作至检验开始的时间 严格控制 期间的储存条件 样品转移到较远处检测 运输条件确认：时间、温度等 USP <1231> 医药用水
检验时间大于72小时，按天表达
30-35℃, 3 – 5天 上午或下午开始培养，也应同样时间结束
人员培训
人员培训
微生物学教育背景 员工 主管 经理 职责明确 操作规程的培训 检验方法描述 文件编号便于检索化验员接受的培训内容 建立个人培训档案 确认后方能独立操作 培训记录时效性：现行版本与SOP
化验室记录的维护
化验室记录应包括的要素
日期 样品名称 化验员姓名 规程号 记录检验结果 偏差 参数记录
设备、微生物菌种、培养基批号
主管/复核人签名
化验室记录的维护
记录 关键设备，按期校验、有维保记录、使用日志 设备温度（水浴、培养箱、灭菌柜），可追溯 SOP SOP名称与版本号 方法描述应具体详细 书写修改： 单线划掉，签字、日期 原数据不得擦掉、或涂抹 检验结果 原始平板计数：便于复核 图表：装订应安全、数据可读；骑缝签字
首次结果无效
做出结论 进行复验（按复验SOP） 必要时重新取样
Thank You !
人员培训
USP微生物限度法
MICROBIAL LIMIT TESTS （微生物限度检查USP）This chapter provides tests for the estimation of the number of viableaerobic microorganisms present and for freedom from designated microbialspecies in pharmaceutical articles of all kinds, from raw materials to thefinished forms. An automated method may be substituted for the testspresented here, provided it has been properly validated as giving equivalentor better results. In preparing for and in applying the tests, observe asepticprecautions in handling the specimens. Unless otherwise directed, where theprocedure specifies simply ―incubate,‖ hold the container in air that isthermostatically controlled at a temperature between 30 and 35, for a periodof 24 to 48 hours. The term ―growth‖ is used in a spec ial sense herein,i.e., to designate the presence and presumed proliferation of viablemicroorganisms.这一章规定，测试估计的数目可行的好氧微生物，从指定的微生物物种在制药文章的所有品种，从原料到成品的形式。
USP微生物限度检查 中文
USP微生物限度检查中文61）微生物限度检测（MICROBIAL LIMIT TESTS）此章提供方法来检测可能存在的好氧微生物其他制药过程中可能出现的微生物的数量，包括原材料和成品中的。
如果经过验证确认可以得到相同或更好的检测结论，也允许采用自动化的检测方法。
在样品检测过程中须进行无菌操作。
若无特别说明，则“培养（incubate）”一词指在30—35℃的培养箱内培养24至48小时；“生长（growth）”一词用于专门的判定，说明“存在和可能存在活的微生物”。
准备实验 (Preparatory Testing)本章涉及实验结果的有效性取决于：提供的被检测样品本身在实验条件下，被充分证明不会抑制可能存在的微生物的生长。
因此，在准备样品时，需要正规的实验操作和符合要求的实验条件，接种稀释样品到含有以下（微生物）培养物的培养基：金黄色（奥里斯）葡萄球菌（Staphylococcus aureus）,大肠埃希氏菌（Escherichia coli）, 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa), 和沙门氏菌（Salmonella）。
方法如下：将用肉汤培养基培养24小时后的（微生物）不小于10-3稀释的微生物培养物，加1 ml（微生物）培养液到磷酸(盐)缓冲液(pH 7.2)，液体大豆酪蛋白消化物培养基（Fluid Soybean-Casein Digest Medium），或者液体乳糖培养基（Fluid Lactose Medium）。
相应培养基培养失败则需要采取以下方法更改检测程序：（1）增加稀释液体积，检测样品加入量仍维持不变；或者（2）中和一定数量的干扰因子；或者（3）结合（1）、（2）得出适当条件，使接种物得以生长。
以下是一些物质的成分和浓度，该物质及浓度可用于加入培养基、阻止物质发挥抑菌作用：大豆卵磷脂（soy lecithin, 0.5%）或者聚山梨醇酯20（polysorbate 20, 4.0%）。
USP微生物限度及无菌检验方法2
USP微生物限度及无菌检验方法1First supplement, USP-NF 发补1，USP-NFSoybean-casein digest medium (continued)大豆蛋白消化酶（继续）Dibasic Potassium Phosphate二盐基亚磷酸钾……Dextrose Monohydrate/Anhydrous葡萄糖一水/无水……Purified water纯化水……pH after sterilization:7.3±0.2 灭菌后pH值：7.3±0.2Dissolve the solids in the purified water, heating slightly to effect a solution. Cool the solution to room temperature, and adjust the pH within 1N sodium hydroxide so that, after sterilization, it will have a PH of 7.3±0.2. Filter, if necessary to clarify, dispense into suitable containers, and sterilize using a validated procedure. Store at a temperature between 2° and 25° in a sterile well-closed container, unless it is intended for immediate use. Do not use the medium for a longer storage period than has been validated. 将固体物质溶解于纯净水，轻微加热以实现溶解。
USP34 61 非无菌产品的微生物检验：微生物计数检测
61 非无菌产品的微生物检验：微生物计数检测简介后面所提到的检测都是用于在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
设计这个实验旨在确定药物或制剂是否符合已建立的微生物质量要求规范。
当用作上述目的时，可参考下面的说明，包括所取样品的量及以结果的解释。
该方法不适用于将微生物作为有效成分的产品。
可以运用包括自动化方法在内的替代微生物方法。
但要求已被证明其等价于药典方法。
通用方法在拟定的条件下进行试验，拟定的条件旨在避免待测产品的外在微生物污染。
采取的避免污染的措施必须不影响任何测试中需要披露的微生物。
如果待测产品具有抗菌活性，尽可能取消或者解除这个活性。
如果是用灭活剂，则它的效用和毒性情况必须说明。
如果表面活性物质作为检测样品，则它们对微生物的毒性和与灭活剂的兼容性应作说明。
计数方法按照规定使用膜过滤法或者平板计数法。
最可能数目法（MPN）是微生物计数法中精密度最差的方法。
然而，对于特定的低生物负荷的产品组，可能是最适宜的方法。
方法的选择是基于如产品属性，微生物限度要求等因素进行选择的。
选择的方法必须进行大量的样品检测来判断是否符合规范。
并建立其方法的适用性。
促生长实验，计数方法的适用性和阴性对照总则需建立有样品进行试验的条件下微生物测试的性能状况。
检验条件改变或样品改变时，因影响其测量结果，则应确定其适用性。
试验菌株制备用标准的、稳定的试验菌株悬浮液或者将它们按以下步骤制备。
因使用种子批培养保留技术（种子批技术），则用于接种的可用的微生物从原始的第一代开始继代培养不能超过5代。
且按照表1表所示将每一批细菌和真菌等试验菌株进行独立培养。
表1．试验菌的制备及应用微生物实验菌株的制备促生长有样品的情况下，微生物计数方法的适用性总需氧微生物计数总酵母菌和霉菌的计数总需氧微生物计数总酵母菌和霉菌的计数金黄色葡萄球菌ATCC6538 NCIMB9518CIP4.83 NBRC13276 酪蛋白大豆琼脂培养基或酪蛋白大豆肉汤培养基30-35℃18-24h酪蛋白大豆琼脂培养基和酪蛋白大豆肉汤培养基≤100CFU30-35℃≤3天——酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU30-35℃≤3天——绿脓假单胞菌ATCC9027 NCIMB8626 CIP82.118 NBRC13275 酪蛋白大豆琼脂培养基或酪蛋白大豆肉汤培养基30-35℃18-24h酪蛋白大豆琼脂培养基和酪蛋白大豆肉汤培养基≤100CFU30-35℃≤3天——酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU30-35℃≤3天——枯草芽孢杆菌ATCC6633 NCIMB8054 CIP52.62 NBRC3134 酪蛋白大豆琼脂培养基或酪蛋白大豆肉汤培养基30-35℃18-24h酪蛋白大豆琼脂培养基和酪蛋白大豆肉汤培养基≤100CFU30-35℃≤3天——酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU30-35℃≤3天——白色念珠菌ATCC10231 NCPF3179 IP48.72 NBRC1594沙氏-葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基20-25℃2-3天酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU30-35℃≤5天沙氏-葡萄糖琼脂培养基≤100CFU20-25℃≤5天酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU30-35℃≤5天沙氏-葡萄糖琼脂培养基≤100CFU20-25℃≤5天黑曲霉ATCC16404 IMI149007 IP1431.83 NBRC9455沙氏-葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄培养基糖琼脂培养基20-25℃5-7天，或直到获得好的芽孢酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU30-35℃≤5天沙氏-葡萄糖琼脂培养基≤100CFU20-25℃≤5天酪蛋白大豆琼脂培养基≤100CFU30-35℃≤5天沙氏-葡萄糖琼脂培养基≤100CFU20-25℃≤5天使用pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液或者pH7.2磷酸缓冲溶液来制备实验所用的菌悬液。
美国药典 USP 微生物限度检查
USP36 1117 优良微生物检测规范（中英文1/ 2）2013-08-09 15:30:46| 分类：USP|举报|字号订阅1117 MICROBIOLOGICAL BEST LABORATORY PRACTICES 优良微生物检测规范INTRODUCTION 介绍Good laboratory practices in a microbiology laboratory consist of activities that depend on several principles: aseptic technique, control of media, control of test strains, operation and control of equipment, diligent recording and evaluation of data, and training of the laboratory staff. Because of the inherent risk of variability in microbiology data, reliability and reproducibility are dependent on the use of accepted methods and adherence to good laboratory practices.优良微生物检测规范由一些活动组成，这些活动依赖于几个基本要素：无菌技术、培养基控制、检测用菌株控制、设备操作和控制、完善的记录和数据评估、化验室员工的培训。
由于微生物数据具有天生的不确定性，数据的可靠性和重复性取决于是否使用被接受的方法，以及是否严格遵守化验室规范。
MEDIA PREPARATION AND QUALITY CONTROL 培养基制备和质量控制Media Preparation 培养基制备Culture media are the basis for most microbiological tests. Safeguarding the quality of the media is therefore critical to the success of the microbiology laboratory. Media preparation, proper storage, and quality control testing can ensure a consistent supply of high-quality media.培养基是大多数微生物测试的基础。
美国药典-微生物检测
〈61〉非无菌产品的微生物检测：微生物计数检测法生长促进试验和计数方法的适用性概述在供试品存在的情况下，必须确立检测微生物的试验能力。
如果引入了可能影响试验结果的在测试性能或产品方面的变更，则必须确认其适用性。
供试菌株的制备使用供试菌株的标准化稳定悬浮液或者按照以下所述制备。
使用菌种保存技术（种子批系统）以便用于接种的可萌发微生物从最初的主种子批不超过五代。
按照表1中的描述，分别培养每种细菌和真菌供试菌株。
表1.供试微生物的制备和使用用pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲溶液或pH7.2的磷酸盐缓冲液配制供试悬浮液；为使黑曲霉孢子悬浮，可将0.05%的聚山梨醇酯80加入该缓冲液中。
这些悬浮液需在2个小时之内使用，或存放在2o～8o条件下24小时内使用。
作为制备并稀释黑曲霉或枯草杆菌营养细胞的新鲜悬浮液的替代方法，可制备稳定的孢子悬浮液，然后将适量的孢子悬浮液用于试验接种。
稳定的孢子悬浮液可在2o～8o下保存，保存期经过时间验证。
阴性对照为了确认试验的条件，用所选的稀释液替代供试品阴性对照。
必须没有微生物的生长。
培养基的生长促进对每一批已制备好的培养基和每一批从脱水培养基或根据描述的组分制备出来的培养基进行测试。
在部分/整个平皿内的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基和大豆酪蛋白消化物琼脂培养基中接种少量(不超过100cfu) 表1中指定的微生物，每种微生物均使用单独一部分/整个平皿培养基。
在平皿内的沙氏葡萄糖琼脂培养基中接种少量(不超过100cfu)表1中指定的微生物，每种均使用一个单独平皿的培养基。
按照表１中描述的条件进行培养。
对于固体培养基，所获得的生长与标准化接种体的计算值之间的差异因素不大于2。
对于刚刚制备好的接种体，发生的微生物生长与用此前检验并批准过的培养基批次所得到的微生物生长相当。
如果出现了与此前从上一个经过测试并通过的培养基批次获得的微生物生长相当、清晰可见的微生物生长，则液体培养基适用。
供试品计数法的适用性样品的制备样品制备方法取决于供试品的物理特征。
USP微生物限度检查 中文
USP微生物限度检查中文61）微生物限度检测（MICROBIAL LIMIT TESTS）此章提供方法来检测可能存在的好氧微生物其他制药过程中可能出现的微生物的数量，包括原材料和成品中的。
如果经过验证确认可以得到相同或更好的检测结论，也允许采用自动化的检测方法。
在样品检测过程中须进行无菌操作。
若无特别说明，则“培养（incubate）”一词指在30—35℃的培养箱内培养24至48小时；“生长（growth）”一词用于专门的判定，说明“存在和可能存在活的微生物”。
准备实验 (Preparatory Testing)本章涉及实验结果的有效性取决于：提供的被检测样品本身在实验条件下，被充分证明不会抑制可能存在的微生物的生长。
因此，在准备样品时，需要正规的实验操作和符合要求的实验条件，接种稀释样品到含有以下（微生物）培养物的培养基：金黄色（奥里斯）葡萄球菌（Staphylococcus aureus）,大肠埃希氏菌（Escherichia coli）, 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa), 和沙门氏菌（Salmonella）。
方法如下：将用肉汤培养基培养24小时后的（微生物）不小于10-3稀释的微生物培养物，加1 ml（微生物）培养液到磷酸(盐)缓冲液(pH 7.2)，液体大豆酪蛋白消化物培养基（Fluid Soybean-Casein Digest Medium），或者液体乳糖培养基（Fluid Lactose Medium）。
相应培养基培养失败则需要采取以下方法更改检测程序：（1）增加稀释液体积，检测样品加入量仍维持不变；或者（2）中和一定数量的干扰因子；或者（3）结合（1）、（2）得出适当条件，使接种物得以生长。
以下是一些物质的成分和浓度，该物质及浓度可用于加入培养基、阻止物质发挥抑菌作用：大豆卵磷脂（soy lecithin, 0.5%）或者聚山梨醇酯20（polysorbate 20, 4.0%）。
美国药典微生物限度检测
61微生物限度检测（MICROBIAL LIMIT TESTS）此章提供方法来检测可能存在的好氧微生物其他制药过程中可能出现的微生物的数量，包括原材料和成品中的。
如果经过验证确认可以得到相同或更好的检测结论，也允许采用自动化的检测方法。
在样品检测过程中须进行无菌操作。
若无特别说明，则“培养（incubate）”一词指在30—35℃的培养箱内培养24至48小时；“生长（growth）”一词用于专门的判定，说明“存在和可能存在活的微生物”。
准备实验 (Preparatory Testing)本章涉及实验结果的有效性取决于：提供的被检测样品本身在实验条件下，被充分证明不会抑制可能存在的微生物的生长。
因此，在准备样品时，需要正规的实验操作和符合要求的实验条件，接种稀释样品到含有以下（微生物）培养物的培养基：金黄色（奥里斯）葡萄球菌（Staphylococcus aureus）,大肠埃希氏菌（Escherichia coli）, 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa), 和沙门氏菌（Salmonella）。
方法如下：将用肉汤培养基培养24小时后的（微生物）不小于10-3稀释的微生物培养物，加1 ml（微生物）培养液到磷酸(盐)缓冲液(pH 7.2)，液体大豆酪蛋白消化物培养基（Fluid Soybean-Casein Digest Medium），或者液体乳糖培养基（Fluid Lactose Medium）。
相应培养基培养失败则需要采取以下方法更改检测程序：（1）增加稀释液体积，检测样品加入量仍维持不变；或者（2）中和一定数量的干扰因子；或者（3）结合（1）、（2）得出适当条件，使接种物得以生长。
以下是一些物质的成分和浓度，该物质及浓度可用于加入培养基、阻止物质发挥抑菌作用：大豆卵磷脂（soy lecithin, 0.5%）或者聚山梨醇酯20（polysorbate 20, 4.0%）。
USP微生物试验说明
美國藥典微生物試驗說明Essentials of USP Microbiological Testing研討會大綱I.基礎微生物學II.良好微生物實驗室規範III.藥典協同之改變IV.IV.滅菌滅菌滅菌與無菌保證與無菌保證V.微生物方法之確效微生物學研究微小生命形式的生物學分支研究微小生命形式的生物學分支。
典型的微小生命形式是單細胞的生命形式的微小生命形式是單細胞的生命形式，，也包括非常少也包括非常少量量的多細胞生物體 新陳代謝基本需求能量(如光、硫、一氧化碳或氨一氧化碳或氨))碳、氮、鈣、磷、硫、鎂、鉀和鈉 水(即使真菌也需要0.6 Aw 以上的游以上的游離離水)分類學生物環境多樣性嗜低溫菌嗜中溫菌嗜高溫菌生物環境多樣性嗜酸性菌嗜中性菌嗜鹼性菌依DNA在細胞中的情況可將細胞分為兩大類：真核細胞Eukaryotic cells原核細胞Prokaryotic cells原核生物Prokaryotic cells大部分細菌對人體無害如: 乳酸菌但, 也有微生物會致病細菌(分2界) 古細菌 真細菌原核生物革原核生物革蘭蘭氏分類氏分類法法Hans C.J. Gram –丹麥細菌學家(1853-1938).發現發現了了細胞學上的染色和染色技術細胞學上的染色和染色技術（（革蘭氏染色染色），），），用於區分細菌的分用於區分細菌的分用於區分細菌的分類類學組群學組群。
脂多糖(相對耐熱)如果進入人體，能導致發燒、白血球減少、腹瀉、休克（熱原Pyrogen）(內毒素Endotoxin)革蘭氏陽性結構革蘭氏陰性結構什麼是芽孢?在惡劣惡劣的環境條件下產生的有再生能的環境條件下產生的有再生能的環境條件下產生的有再生能力力的細胞或細胞群的細胞或細胞群。
特徵特徵：：–厚壁–耐惡劣惡劣環境環境–非常緩慢的代謝速非常緩慢的代謝速度度分4界原生動物 動物植物真菌真菌-特徵皆為化學異異營菌皆為化學具強大的酵素 (腐生或寄生腐生或寄生) ) ) 具強大的酵素pH5））酸性的生活環境（（pH5 比細菌比細菌更更酸性的生活環境高鹽、、高糖環境中生長高鹽黴菌和蕈是多細胞酵母是單細胞新陳代謝Metabolism 依據分解代謝是否能夠使用O2為什麼了解微生物對新陳代謝的需求很重要？為的是想培養微生物生長更為的是防止微生物生長USP微生物相關務必遵守章節<51> 防腐效力/Antimicrobial Preservatives –Effectiveness耐受力力測試<55> 生物指示劑–耐受Biological Indicators –Resistance Performance Tests微生物計數數試驗非無菌產品的微生物檢驗：：微生物計<61> 非無菌產品的微生物檢驗Microbiological Examination of Nonsterile Products:Microbial Enumeration Tests<62> 特定菌的微生物檢查/ Microbiological Proceduresfor Absence of Specified Microorganisms<71> 無菌試驗/ Sterility Tests<85> 細菌內毒素試驗Bacterial Endotoxins TestUSP微生物相關章節建議遵循<1035> 滅菌生物指示劑<1072> 消毒劑與殺菌劑<1111> 非無菌產品的微生物評估<1112> 水活性應用<1116> 清淨室和其他管制環境的微生物評估<1117> 微生物實驗室規範 <1207> 無菌產品包裝–完整性評估 <1209> 滅菌–化學和物理化學指示劑，及綜合指示劑<1211> 滅菌與無菌保證<1222> 最終滅菌藥品–參數放行 <1223> 微生物方法確效<1227> 藥物的微生物回收率確效 <1231> 製藥用水<2021> 微生物計數試驗–營養和膳食補充劑<2022> 特定菌的微生物檢查–營養和膳食補充劑<2023> 非無菌營養和膳食補充劑的微生物評估EP & USP & JP 藥典方法的國際協合International Harmonization of Pharmacopoeia時限–現行的EP 只維持到2008年12月31日–USP 將維持至2009年4月影響行適用性試驗並需重新進行–各藥廠將必需提早因應,並需重新進批產品來來測試其一致性.( Suitability Test),以至少3 批產品此協合後的方法不不僅在產品( non-sterile)的稀釋液此協合後的方法及預試驗,生長試驗上有改變,在部份培養基的組成有所改變,甚至新增一些檢驗項目與培養基,在有些品管菌株及接種量量都有改變品管菌株及接種微生物限量(USP <61> & EP 2.6.12) Microbial Enumeration TestTAMC= Total aerobic microbial count (on TSA, incl. fungi)TYMC= Total combined yeast/mould count (on Sab.4%-Dextrose Agar, incl. bacteria)特定微生物USP <62> & EP 2.6.13 Tests for Specific Microorganisms目前–Escherichia coli–Salmonella–Pseudomonasaeruginosa–Staphylococcusaureus 協調後–Escherichia coli–Salmonella–Pseudomonas aeruginosa–Staphylococcus aureus–Clostridia 產芽孢梭菌–Bile-tolerant Gram-negative bacteria 耐膽鹽革耐膽鹽革蘭蘭氏陰性菌–Candida albicans白色白色念念珠菌Test for Escherichia coli:Presence/Absence (Current USP Method)Test for Escherichia coli:Presence/Absence (Harmonized Method)<1112> 水活性應用水活性是水活性是什什麼?–產品中水的蒸氣壓P 與相同溫與相同溫度度下純水中的蒸氣壓Po 的比的比率率。
美国药典微生物试验说明
實驗數據判讀
不合格原因
–實驗室錯誤 –產品失敗 無論上述何種情況，管理階層必須立即被告知
OOS調查
–數據偏離的程度(嚴重性？) –實驗室環境 –取樣方法 –物料的特性(存活的污染微生物？) –留樣的評估
32/9
<1211>滅菌和無菌保證
每批產品不是通過<71>無菌試驗就可得到無 菌保證。
<1209> 滅菌–化學和物理化學指 示劑，及綜合指示劑
<1211> 滅菌與無菌保證
<1222> 最終滅菌藥品–參數放行
<1223> 微生物方法確效
<1227> 藥物的微生物回收率確效
<1231> 製藥用水
<2021> 微生物計數試驗–營養和 膳食補充劑
<2022> 特定菌的微生物檢查–營 養和膳食補充劑
Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests <62> 特定菌的微生物檢查 / Microbiological Procedures for Absence of Specified Microorganisms <71> 無菌試驗 / Sterility Tests <85> 細菌內毒素試驗 Bacterial Endotoxins Test
劑型 (投藥途徑) 口服固體 口服液劑
外用或鼻腔用藥
陰道用藥
直腸用藥 藥品主成分&賦型劑
<61> TAMC [CFU/g or CFU/ml]
USP 微生物试验
USP微生物检测精要
生产商必须按GMP的指导进行制剂产品的生产 储存和分发，以保证最终制剂仅带有低水平的 微生物。
药物制剂和药用物质的接受标准
介绍
非无菌产品的微生物检查根据非无菌产 品的微生物检查：微生物计数<61>和非
无菌产品的微生物检查：控制微生物测 试<62>正文中的方法进行。
药物制剂和药用物质的接受标准
非无菌制剂的微生物质量标准
成品微生物控制的USP观点及文件
<71>无菌测试 <85>细菌内毒素测试 <151>热原测试 <51>抗菌有效性测试 <1222>最终灭菌药品——参数放行 <1207>无菌产品包装——完整性评估
微生物实验室规范
<1117>微生物实验室规范 重要的控制点
无菌技术 培养基控制 菌种控制 设备控制 实验室布局和运作 数据文件控制 员工培训
微生物实验室规范
实验室结果的维护
测试结果 —应包含平皿计数结果（如有） —数据分析的方法应罗列在相关的SOP中 —对粘贴的图表、数据，骑缝签名 存档 —记录应存档并防止丢失 —应有记录保存计划
微生物实验室规范
测试结果解释
微生物数据有时不容易解释
—与人类相关的微生物群落被广泛的用于许多测试 —人员污染是始终被关心的问题 —样品或环境中的微生物并非均匀分布 —微生物检测可变范围大：可能在+/-0.5log10单位左 右 因此，得到的结果与期望的结果略有差异并不是重大 问题。
定期稳定性检查以确认种保藏
—建立标准程序处理、保存菌种。防止污染 和特性变化 —必须小心地处理 —使用前确认菌种的身份，纯度 —根据生产商说明书复苏菌种，使用接种技 术 — -70℃以下或冷冻干燥保存储备菌种，可 延长保存周期 —开启后不要重新冷冻菌种 —追溯传代次数，不超过五代
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美國藥典微生物試驗說明Essentials of USP Microbiological Testing研討會大綱I.基礎微生物學II.良好微生物實驗室規範III.藥典協同之改變IV.IV.滅菌滅菌滅菌與無菌保證與無菌保證V.微生物方法之確效微生物學研究微小生命形式的生物學分支研究微小生命形式的生物學分支。
典型的微小生命形式是單細胞的生命形式的微小生命形式是單細胞的生命形式，，也包括非常少也包括非常少量量的多細胞生物體 新陳代謝基本需求能量(如光、硫、一氧化碳或氨一氧化碳或氨))碳、氮、鈣、磷、硫、鎂、鉀和鈉 水(即使真菌也需要0.6 Aw 以上的游以上的游離離水)分類學生物環境多樣性嗜低溫菌嗜中溫菌嗜高溫菌生物環境多樣性嗜酸性菌嗜中性菌嗜鹼性菌依DNA在細胞中的情況可將細胞分為兩大類：真核細胞Eukaryotic cells原核細胞Prokaryotic cells原核生物Prokaryotic cells大部分細菌對人體無害如: 乳酸菌但, 也有微生物會致病細菌(分2界) 古細菌 真細菌原核生物革原核生物革蘭蘭氏分類氏分類法法Hans C.J. Gram –丹麥細菌學家(1853-1938).發現發現了了細胞學上的染色和染色技術細胞學上的染色和染色技術（（革蘭氏染色染色），），），用於區分細菌的分用於區分細菌的分用於區分細菌的分類類學組群學組群。
脂多糖(相對耐熱)如果進入人體，能導致發燒、白血球減少、腹瀉、休克（熱原Pyrogen）(內毒素Endotoxin)革蘭氏陽性結構革蘭氏陰性結構什麼是芽孢?在惡劣惡劣的環境條件下產生的有再生能的環境條件下產生的有再生能的環境條件下產生的有再生能力力的細胞或細胞群的細胞或細胞群。
特徵特徵：：–厚壁–耐惡劣惡劣環境環境–非常緩慢的代謝速非常緩慢的代謝速度度分4界原生動物 動物植物真菌真菌-特徵皆為化學異異營菌皆為化學具強大的酵素 (腐生或寄生腐生或寄生) ) ) 具強大的酵素pH5））酸性的生活環境（（pH5 比細菌比細菌更更酸性的生活環境高鹽、、高糖環境中生長高鹽黴菌和蕈是多細胞酵母是單細胞新陳代謝Metabolism 依據分解代謝是否能夠使用O2為什麼了解微生物對新陳代謝的需求很重要？為的是想培養微生物生長更為的是防止微生物生長USP微生物相關務必遵守章節<51> 防腐效力/Antimicrobial Preservatives –Effectiveness耐受力力測試<55> 生物指示劑–耐受Biological Indicators –Resistance Performance Tests微生物計數數試驗非無菌產品的微生物檢驗：：微生物計<61> 非無菌產品的微生物檢驗Microbiological Examination of Nonsterile Products:Microbial Enumeration Tests<62> 特定菌的微生物檢查/ Microbiological Proceduresfor Absence of Specified Microorganisms<71> 無菌試驗/ Sterility Tests<85> 細菌內毒素試驗Bacterial Endotoxins TestUSP微生物相關章節建議遵循<1035> 滅菌生物指示劑<1072> 消毒劑與殺菌劑<1111> 非無菌產品的微生物評估<1112> 水活性應用<1116> 清淨室和其他管制環境的微生物評估<1117> 微生物實驗室規範 <1207> 無菌產品包裝–完整性評估 <1209> 滅菌–化學和物理化學指示劑，及綜合指示劑<1211> 滅菌與無菌保證<1222> 最終滅菌藥品–參數放行 <1223> 微生物方法確效<1227> 藥物的微生物回收率確效 <1231> 製藥用水<2021> 微生物計數試驗–營養和膳食補充劑<2022> 特定菌的微生物檢查–營養和膳食補充劑<2023> 非無菌營養和膳食補充劑的微生物評估EP & USP & JP 藥典方法的國際協合International Harmonization of Pharmacopoeia時限–現行的EP 只維持到2008年12月31日–USP 將維持至2009年4月影響行適用性試驗並需重新進行–各藥廠將必需提早因應,並需重新進批產品來來測試其一致性.( Suitability Test),以至少3 批產品此協合後的方法不不僅在產品( non-sterile)的稀釋液此協合後的方法及預試驗,生長試驗上有改變,在部份培養基的組成有所改變,甚至新增一些檢驗項目與培養基,在有些品管菌株及接種量量都有改變品管菌株及接種微生物限量(USP <61> & EP 2.6.12) Microbial Enumeration TestTAMC= Total aerobic microbial count (on TSA, incl. fungi)TYMC= Total combined yeast/mould count (on Sab.4%-Dextrose Agar, incl. bacteria)特定微生物USP <62> & EP 2.6.13 Tests for Specific Microorganisms目前–Escherichia coli–Salmonella–Pseudomonasaeruginosa–Staphylococcusaureus 協調後–Escherichia coli–Salmonella–Pseudomonas aeruginosa–Staphylococcus aureus–Clostridia 產芽孢梭菌–Bile-tolerant Gram-negative bacteria 耐膽鹽革耐膽鹽革蘭蘭氏陰性菌–Candida albicans白色白色念念珠菌Test for Escherichia coli:Presence/Absence (Current USP Method)Test for Escherichia coli:Presence/Absence (Harmonized Method)<1112> 水活性應用水活性是水活性是什什麼?–產品中水的蒸氣壓P 與相同溫與相同溫度度下純水中的蒸氣壓Po 的比的比率率。
–測量物質中自由或游物質中自由或游離離的濕氣降低水活性對微生物生長的影響:–停滯期較長停滯期較長、、生長速生長速度度較慢較慢、、穩定期較少的微生物微生物數量數量數量、、減少微生物產生毒素–然而然而，，降低水活性後低水活性後，，微生物的耐熱性會提高注意: 水活性≠水分含水分含量量為什麼想要以水活性微生物限量量檢驗?減少微生物限許多非無菌藥品的微生物污染可能性很不大因此檢驗的價值不低，因此檢驗的價值周期，，增加微生物檢驗延長產品的放行行周期微生物檢驗延長產品的放庫存成本和市場缺貨的機會ISO 11133 –Part 2Methods for Solid Culture Media Productivity Most important change !Productivity >70% for non selective media > 50% for selective media實驗數據判讀不合格原因–實驗室錯誤–產品失敗無論上述何種情況上述何種情況，，管理階層必須階層必須立立即被告知 OOS 調查–數據偏據偏離離的程的程度度(嚴重性嚴重性？？)–實驗室環境–取樣方法–物料的特性的特性((存活的污染微生物存活的污染微生物？？)–留樣的評估<1211>滅菌和無菌保證每批產品不是通過<71>無菌試驗就可得到無菌保證。
而是通過適當滅菌工程或無菌充填過程確效，並嚴格執行製程規定（cGMP）才可得到的。
環境的微生物控制原料和組成分的微生物控制所有微生物控制的整合人員的微生物控制製程的微生物控制最終成品的微生物控制無菌的概率possibility每批產品的無菌性是根據概率推定的，即有產品被污染的可能性也是微乎其微的通常被接受的無菌保證度（SAL）是10-6 的微生物存活率或更低，即保證經滅菌的物品或劑型中有活的微生物的可能性不超過百萬分之一。
我們能做到比10-6更好嗎?滅菌前的生物負荷對熱不安定的物品，透過了解滅菌前物品的生物負荷，經過適當的時間週期，及足夠的滅菌前產品批數，才足以建立滅菌製程。
什麼是“D值”?–減少微生物數量90%或1個log所需要的時間(分鐘）–許多滅菌製程確效使用生物指示劑，以決定物品暴露在滅菌條件下的時間，才能達到至少10-6的無菌保證度（SAL）過度滅菌–暴露於12個D值，就造成典型的“過度滅菌”–生物指示劑，適當的生物指示劑是：121℃時D值為1.5 分鐘，含1010芽孢<1211>滅菌與無菌充填濕熱滅菌(蒸氣滅菌) 乾熱滅菌氣體滅菌游離輻離輻射滅菌射滅菌過濾滅菌濾膜過膜過濾濾–以Brevundimonasdiminuta(ATCC19146) 挑戰確效 最終滅菌是保證微生物污染最小化的首選無法使用最終滅菌無法使用最終滅菌，，則須藉由一系須藉由一系列列無菌充填步驟進行–無菌充填是設計防止活的微生物進入產品的微生物進入產品，，微生物一旦進入產品一旦進入產品，，沒有任何後續步驟可將之去除無菌充填重點考量直接接觸產品的微生物環境，如何將預先已滅菌的產品組成部分，，以無菌充填工程已滅菌的產品組成部分生產成產品設計及有效維護的空調系統，，使空氣 合理設計及有效維護的空調系統環境沒有活的微生物–環境監控經培訓的操作人員穿戴適當的衣物和裝備–人員監控The End 感謝您的傾聽。