生化大实验实验报告

生化大实验

实验报告

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实验1 多酚氧化酶（PPO）的分离提取

一、实验原理：

多酚氧化酶(PPO)能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌，它是植物组织广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体，可参与植物生长、分化、种皮透性及植物抗性的调节，属于末端氧化酶的一种。

植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以受伤组织一般这种酶的活性就会提高。另外，多酚氧化酶也可以与细胞其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。

蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而可以将PPO蛋白从体系中析出，且大分子蛋白质不能通过透析膜。

二、实验目的：

通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。

三、材料与试剂：

1.材料：马铃薯（两小组共称200g）

2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮）配制是配x10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵； 0.03M磷酸缓冲液pH 6.0（含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）

3.设备：试管与试管架；烧杯、玻璃棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆机；pH计和pH试纸；高速冷冻离心机；

四、操作步骤：

1.两小组共称取200g土豆削皮后切成小块，加入300ml缓冲液A，两者按1:1(W/V)比例匀浆1min；

2.用两层纱布将所得的浆液过滤；

3.将匀浆滤液装入200ml的离心管10000rpm离心5min；

4.上清液两组平分，每组150ml，加36.45g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心5min；

5.取上清液定容至150ml，加入30.75g硫酸铵固体搅拌均匀后10000rpm离心8min，倒掉上清液得粗酶沉淀,用并加入10ml 0.03M磷酸缓冲液B复溶沉淀3-5min；

6.将所得溶液倒入透析袋中，用0.02M的KCl溶液透析至无硫酸铵根离子。

五、结果和分析：

实验所得的初酶液颜色为浅黄色，颜色浅，主要是实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少，从而最大程度的保留了PPO的活性；经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体，这样就为进一步的柱层析提供了优良材料。

六、讨论与结论：

1. 本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化；

2．实验材料马铃薯在削皮前一定要清洗干净；

免溶液局部盐离子浓度过大，使蛋白变性，并注意用量的计算，第二步加入的时候起点浓度是40%而不是0，否则会加入过量，影响实验的结果；

4.透析时，提前检查透析袋是否完整，避免透析时出现孔洞导致样品丢失。

实验2 胰酶分离提取及活性诱导

一、实验原理：

胰酶是医药、食品、饲料等工业上重要的酶制剂，胰酶的分离提取是普通生化实验的最主要、最经典的实验。

提取胰酶的经典方法，多采用硫酸铵分级沉淀，胰酶在75%饱和硫酸铵中沉淀，其它杂蛋白一般在10%硫酸铵饱和度下被沉淀除去。经此多次提取，最后在pH 8.0硼酸缓冲液中得到结晶。

胰酶在pH 3.0时最为稳定，可在低温下储存较长时间而不失活；低于此pH酶易变性；高于pH 5.0时，酶易自溶而失活。因此提取制备胰酶的全部操作过程易在低pH和低温下进行。胰酶以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。

二、实验目的：

本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备样品。

三、材料与试剂：

1.仪器：紫外光分光光度计、恒温水浴、离心机、组织捣碎机、pH计、显微镜、秒表、剪刀、镊子、搪瓷盘、乳钵，大玻璃漏斗、抽滤瓶，塑料小桶、纱布、pH试纸，滤纸、玻璃器皿等；

2. 材料：新鲜猪胰脏；

3. 试剂及溶液配制：pH 2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M NaOH溶液、5M NaOH溶液、0.1M HCl溶液、0.025M HC1溶液、0.01M HCl溶液、0.4M pH 9.0硼酸缓冲液Tris，硫酸铵，0.8M pH 9.0硼酸缓冲液。

四、操作步骤：

1.取新鲜猪胰脏1个冰浴下剥除脂肪和结缔组织，用绞肉机绞碎胰脏；

2.加1-2倍体积已预冷却的pH 2.5-

3.0乙酸酸化水溶液提取(按1g组织相当于1ml体积算)；

3.检查提取液中pH，若高于pH 3.0时应及时用10%乙酸调节，使提取液维持在pH 2.5-3.0之间，在冷室5℃左右搅拌提取18-24h，4层纱布过滤，用50m1 pH 2.5乙酸酸化水抽提残渣一次(时间约为1-2h)合并滤液，用5M H2PO4溶液调正pH至2.5-3.0，过滤，离心30min，取上清，量其总体积；

4.盐析加固体粉状硫酸铵33.9g，至40%饱和度；盐析1h，12000rpm离心10min；

5. 然后上清液加硫酸铵33.3 g，至75%饱和度盐析1h，然后12000rpm离心10min；

6. 沉淀溶于10ml pH

7.5，0.1M Tris，透析过夜，4℃保存。

五、结果和讨论：

1. 经过以上实验步骤得到澄清的酶液。

2. 用新鲜的猪胰脏是因为新鲜的胰脏胰酶含量高，容易分离提取。

3. 提取过程中保持pH值2.5-3.0之间，是因为胰酶在低pH值下没有活性，不会催化其他蛋白的水解从而降低酶的含量。