FQ-PCR技术的原理及应用

合集下载

荧光定量PCR检测技术

如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数（Ct）。 Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域

值时所经历的循环数。
什么是C(t)值
C(t)
Threshold（域值）
为什么要引入C(t)值
Endpoin
96 replicates of B7 gene molecular beacon

1 、采用闭管检测，不需 PCR 后处理，并采用dUTP-UNG酶的防污染系统，扩增和检测一次同时完成。不需开盖，不
产生污染，避免了假阳性。
FQ-PCR与普通PCR的区别

2 、探针与被检 DNA 序列特异杂交，增强了特异性。
A、上下游引物和探针三道关卡控制其特异性； B、引物和探针都比较长，退火温度较高，非特异性扩增几率减少。
FQ-PCR与普通PCR的区别

5、可以多重检测。
如果检测两种以上的基因片断，可以对各个基因分别设计探针和引物，在不同的反应管中进行TaqMan检测，或者将各自的探针分别标记不同的荧光信号，在同一个反应体系中检测多个基因片断。
二、SYBR荧光染料原理

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入 DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR产物的增加完全同步。

FQ-PCR与普通PCR的区别
3、可定量结果，准确灵敏地反应了病原体的感染和治疗恢复情况。
FQ-PCR与普通PCR的区别

4、光谱分析仪直读结果，自动分析，增强了灵敏性和客观性。能够实时检测，即一边PCR，一边检测PCR的结果，而不需要在PCR结束之后进行核酸电泳来显示PCR反应的结果，（因此实时荧光PCR检测技术操作更简单；也避免了核酸电泳非常难以回避的化学污染和核酸污染等严重问题）；

简述PCR技术的主要原理及应用

简述PCR技术的主要原理及应用1. PCR技术的主要原理聚合酶链式反应（PCR）是一种重要的分子生物学技术，其主要通过在一系列循环中扩增特定DNA片段，最终获得大量目标DNA的倍增产物。

PCR技术广泛应用于基因测序、基因克隆、突变分析、分子诊断等领域。

PCR技术的主要原理包括以下三个步骤：1.1 反应体系的准备PCR反应体系主要由以下组分组成： - DNA模板：即待扩增的目标DNA段，可以是从任何来源提取的DNA片段。

- 引物：由两个单链DNA片段构成，分别与目标DNA序列的两个相邻区域互补，作为DNA复制的起始点。

- DNA聚合酶：用于引导DNA的复制，具有高温稳定性。

- 反应缓冲液：提供适宜的酶活性和其他反应条件。

1.2 热循环反应PCR反应通过一系列的循环反应，完成DNA的扩增。

每个循环包括以下三个步骤：1.热变性（Denaturation）：将PCR反应管中的DNA双链变性为单链，提供引物结合的机会。

2.引物结合（Annealing）：反应体系通过降温，使引物与目标DNA互补的区域结合。

3.DNA扩增（Extension）：通过DNA聚合酶在适宜温度下复制DNA模板。

1.3 扩增产物的倍增反复进行热循环反应会连续复制目标DNA段，导致DNA的指数级扩增。

经过多个循环之后，扩增产物的数量将呈指数式增长。

2. PCR技术的应用PCR技术在生物学研究和医学诊断中得到广泛应用，主要包括以下几个方面：2.1 基因测序PCR技术在基因测序中起到关键作用。

通过扩增需要测序的DNA片段，可以获得足够的模板量，用于测序仪的读取。

2.2 基因克隆PCR技术可用于基因克隆，通过引物的设计，扩增目标DNA片段后，将其插入到表达载体中，实现目标基因的表达。

2.3 突变分析PCR技术可以用于突变分析，通过引物的设计，扩增包含突变位点的DNA片段，然后通过测序或其他分析方法确定突变的存在与否。

2.4 分子诊断PCR技术在分子诊断中广泛应用。

全自动医用PCR分析系统

调研报告全自动医用PCR分析系统【概述】自从1983年Mullis发明聚合酶链式反应（PCR）以来，PCR技术很快成为科研、临床诊断的热点技术。

但是传统PCR技术在应用中一是不能准确定量，二是容易交叉污染，产生假阳性。

实时荧光定量PCR（FQ-PCR）是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。

它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累定时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、实时性和准确性等特点。

全自动医用PCR分析系统，就是以实时荧光定量PCR为基本技术、在计算机的辅助下而发展起来的高度自动化的PCR 分析系统。

【基本原理】实时荧光定量PCR的基本原理是荧光共振能量转移原理（FRET）。

当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。

在探针5’端标记一个报告基团（R），在3’端标记一个淬灭基团（Q），两者距离很近时（7~10nm），报告基团发出的荧光能被淬灭基团所吸收，并依赖其较高的信噪比和良好的辨别能力进行定量检测。

实时荧光定量PCR的几个重要参数分别为：①荧光域值（threshold）：以PCR 反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3 - 15个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。

②Ct 值：也称循环阈值，C 代表Cycle，t代表threshold。

Ct 值是指样品管的荧光信号达到某一固定阈值的PCR 反应循环数。

在PCR 循环过程中，即荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。

在实际操作中，这个时刻也就是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值的时刻，可见Ct 值取决于阈值。

FQ-PCR产品及其临床检测意义

HBeAg
★ 是重要的免疫耐受因子，大部分情况下其存在表示患者处于高感染低应答期。 ★ HBeAg与HBV DNA有良好的相关
性。
★ 阳性标本HBV DNA检出率90％左右。
4.HBsAg和HBeAg均(＋)，HBV-DNA(－)
可能有以下原因： (1) 干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。 (2) PCR所用引物相应的DNA序列发生突变，此引物与突变DNA不能配对结合。 (3) 病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离HBV DNA很少或缺乏。
HBV治疗方案: 血清高病毒载量: 拉咪呋啶血清低病毒载量: 干扰素
HBV拉米夫定耐药检测 2例 YVDD 5例 YVDD+YIDD 1例 YMDD+YVDD 13例 YMDD+YIDD+YVDD 2例 • 达安临检乙肝血清40例 YMDD 22例 YVDD 2例 YMDD+YVDD 16例
4. 用于传染病发病的监控、预测与预防。
5. 建立新的病原体分子诊断标准。 6. 新的药物及疗法的研究与开发。
二遗传病（内源核酸）
1. 等位基因检测： α，β地中海贫血；杜氏肌营养不良症 2. 遗传多态性分析： apoE遗传多态性分析
可区分apoE基因3 个不同的等位基因,即ε2 ,ε3
和ε4
临床应用
FQ-PCR产品及其临床检测意义
细胞膜
细胞核 DNA
转录
mRNA
4 基因诊断
翻译
蛋白质
3 免疫学诊断 2 生化诊断
1 形态学诊断
基其因它诊诊断断的方物法质的基区础别及与
临床诊断
FQ-PCR
荧光定量PCR原理 Fluorescence Quantitative PCR

PCR的基本原理及临床应用

PCR的基本原理及临床应用PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是一种能够在体外快速产生大量特定DNA片段的技术。

它在遗传学研究、医学诊断、犯罪指认等领域起到了重要的作用。

本文将探讨PCR的基本原理以及其在临床应用中的意义。

PCR的基本原理是通过采用酶的体外扩增技术，使得DNA的某一特定片段在体外得到迅速、精确的扩增。

PCR主要涉及三个步骤：变性、引物结合和扩增。

首先，将待扩增的DNA加热到94-96°C，使其变性为单链的DNA。

接着，通过降温至50-65°C，引物与目标DNA片段特异性结合。

最后，在72°C下，加入聚合酶，使DNA链得以延伸合成。

PCR作为一种灵敏度高、特异性强的技术，广泛应用于临床诊断领域。

临床应用中，PCR能够对各种疾病进行快速、准确的检测，因此在疾病预防、治疗和监测中发挥着关键作用。

下面将分别探讨PCR在各个领域的应用。

在遗传学研究中，PCR被广泛应用于基因定位、基因组测序以及DNA指纹等方面。

通过PCR技术，可以快速扩增出基因特定区域的DNA片段，进而进行基因型鉴定和突变检测。

此外，PCR还可用于研究人类种群遗传变异、基因表达差异以及基因修饰等方面，为遗传学研究提供了有力的手段。

在医学诊断中，PCR的应用范围更加广泛。

例如，PCR可用于检测感染疾病的病原微生物，如病毒、细菌、霉菌等。

通过扩增病原微生物的特定基因片段，可以迅速、准确地确定感染的种类和病原量，从而指导临床治疗方案的选择。

另外，PCR还可用于早期癌症的检测，通过分析癌细胞所特有的突变基因的存在与否，提高早期癌症的检出率，对癌症的早期治疗起到重要的作用。

此外，PCR在犯罪学领域也发挥着重要的作用。

通过扩增被检物体内特定的DNA片段，可以进行DNA指纹比对，用以法医学上的犯罪指认和疑案侦破。

PCR技术具有高度特异性和敏感性，即便是仅有微量的DNA样本，也能通过PCR技术得到足够的扩增产物，用以鉴定人员的身份，确保司法公正。

运用FQ-PCR技术监测亚甲蓝光化学法对血浆乙型肝炎病毒的灭活效果

ｐａｍｅａｉｓｉｓＨＵｌａｈｐｔｉＢｖｕｓｔｒＡＮＧＨｕＬ１ａ — ｉ，ａ，ｏｅＸＵＣｕｎｂｎｅａ．ｅａｔｅｔｆＬｂｒｔｙＸｉｊｈａ —ｉ，ｔ１Ｄｐｒｍｎａｏａｏｏｒ
黄华李小捷徐传彬张丽莉黄强
【要】目的通过荧光定量ＰＲ（ｌｏｅｃｎｕｎｉｔｅＰＲ，Ｑ－Ｃ技术对血浆病毒灭摘ＣｆｒｓｅｔｑａｔａｉＣＦＰＲ）ｕｔｖ
活前后乙型肝炎病毒ＤＮＡ（Ｖ— Ａ）度进行测定，断亚甲蓝（）化学法灭活乙型肝炎病ＨＢＤＮ浓判ＭＢ光毒的效果，临床判断病毒灭活效果提供直接和客观依据。方法用４份已证实为ＨＢＤ为Ｖ— ＮＡ阳性的血浆，可见光（３Ｏ０ＵＸ照射不同时间（、、０１、０ｎ后，Ｆ－Ｃ分别测定这些ｍ浆经＞０Ｌ）０５１、５３ｍｉ）用ＱＰＲ
ｄｔｃｅｙｔｅｍｅｈｄｏＱ－ＣＲｎｏａｅｔｎｒａｅａｌｓｔｖｌａｅｔｅｅｆｃｆＨＢｅｅｔｄｂｈｔｏｆＦＰａｄｃｍｐｒｄｗｉｈｕｔｅｔｄｓｍｐｅＯｅａｕｔｈｆｅｔｏＶ
的ＨＢＤＮＶ— Ａ浓度，与未用ＭＢ处理的血浆作比较，并判断随照射时间不同，Ｖ被灭活的效果。ＨＢ
结果４份ＨＢＤＶ－ＮＡ阳性患者的血浆未经处理时，病毒核酸浓度分别为５６０、． × ｌ１８其． ×１３２Ｏ、．

荧光定量PCR的原理及使用

荧光定量PCR的原理及使用荧光定量PCR(FQ-PCR)是新近出现的一种定量PCR检测方法。

其基本特点是：1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。

2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。

3、动态实时连续荧光检测，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速。

下面介绍常用的几种检测方法：1、双链DNA内插染料某些染料如SYBR Green Ⅰ能选择性地与双链DNA结合，同时产生强烈荧光。

在PCR过程中SYBR Green Ⅰ可与新合成的双链DNA结合，产生的荧光信号与双链DNA成正比。

SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。

当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。

因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。

SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。

2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。

3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。

4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。

要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。

在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。

2、TaqMan探针技术原理TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。

由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。

FQ-PCR技术的原理及应

平台PCR仪介绍
ABI 7500 fast
使用96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直观 ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动） Rn= Normalization = Reporter / Referenc
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。
与普通PCR的区别的区别与普通
普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。
实时定量PCR技术：
实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。
定量PCR的数学原理
斜率与扩增效率
荧光定量PCR化学原理
非特异性荧光标记： 1、SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan
1、SYBR Green 法
SYBR Green 熔解曲线分析
SYBR Green法优缺点
优点: 对DNA模板没有选择性适用于任何DNA 使用方便--不必设计复杂探针非常灵敏便宜相Leabharlann 定量：参照因子Calibrator
相对定量分析方法1
-Ct
前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100 ％且偏差在 5％以内 1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：

PCR原理

荧光定量PCR技术简介P ost By：2009-4-20 9:19:00荧光定量PCR技术简介荧光定量PCR（也称TaqMan PCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通P CR相比，FQ-PCR具有许多优点。

本文拟就该技术的特点、原理和方法以及应用作一简要叙述。

1 特点FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR 扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。

如一般PCR产物都需通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会。

而FQ-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。

实验一般使用PE公司研制的ABI7100型PCR扩增仪。

该仪器具有以下特点：①应用广泛：可用于DNA和RNA的PCR产物定量、基因表达研究、病原体检测及PCR条件的优化等。

②独特的定量原理：采用荧光标记探针，经激光激发后荧光量随PCR循环而累积，从而达到定量目的。

③工作效率高：内置9600型PCR扩增仪，电脑控制1～2小时全自动同步完成96个样品的扩增及定量。

④无须凝胶电泳：无须对样品进行稀释和电泳，只须通过特殊探头在反应管内直接检测。

⑤无管道内污染：采用独特全封闭反应管及光电传导系统，无须顾及污染。

⑥结果重现性好：定量动态范围高达五个数量级。

所以自从此项技术研制成功以来，受到许多科研工作者的重视并在多个领域得到应用。

2 原理和方法FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。

PCR技术的原理与应用

PCR技术的原理与应用PCR（聚合酶链反应）是一种分子生物学技术，其原理是通过反复循环的DNA扩增过程将特定的DNA序列扩增至大量，从而能够在短时间内快速复制出特定的DNA片段。

PCR技术具有高度敏感性、高选择性和高效性的特点，被广泛应用于基因工程、医学诊断、犯罪学鉴定等领域。

第一步是变性，在高温下（通常为94-98°C），将加热的DNA双链分离成两条模板链，形成单链DNA。

第二步是退火，降低温度使引物（特异性序列）与单链DNA的末端结合。

引物主要由两条DNA寡核苷酸组成，其中一条与待扩增的DNA序列的正向链完全互补，另一条与反向链完全互补。

引物结合后，会在DNA链上形成一个引物-模板复合物，这个过程通常需要较低的温度（通常为50-60°C）。

第三步是延伸，提高温度(通常为72°C)，引物上的酶（聚合酶）会在复合物上开始从引物的3'端启动DNA合成。

聚合酶在复制过程中加入新的核苷酸，使DNA链延长。

这个过程一直持续到达到DNA链的末端，形成两个完全互补的DNA片段。

然后，变性、退火和延伸这三个步骤会循环进行多次，使扩增产物呈指数级增加，从而扩增出特定的DNA片段。

1.基因工程和分子生物学研究：PCR技术可以用于合成DNA序列，构建重组DNA、基因组测序等。

通过与其他技术的结合，如限制性内切酶切割、DNA连接、酶切酶浸出等，可以构建表达载体、突变体、基因敲除等，进一步研究基因功能和调控机制。

2.临床诊断：PCR技术可以用于检测和鉴定病原体的DNA，例如病毒、细菌和寄生虫等。

通过扩增目标DNA序列，可以快速、灵敏地检测感染性疾病，如HIV感染、结核病、肺炎等。

此外，PCR技术还可以用于肿瘤标记基因的检测、身份鉴定等医学领域。

3.古生物学研究：PCR技术可用于从古代DNA中扩增目标DNA序列，从而恢复古代生物的遗传信息。

通过对古代DNA的研究，可以获得有关过去物种和群体结构演化的重要信息。

实时荧光定量PCR的原理及应用研究进展

FQ-PCR 在医学检测中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断,只要有限的核酸序列清楚,运用 FQ-PCR 技术,检测任何病原体。目前,对一些培养周期长或缺乏稳定可靠的检测手段的病原体,可以考虑用 FQ-PCR 检测,为临床诊断提供依据。FQ-PCR 对病原体的检测克服了免疫学检测的“窗口期”问题,可判断疾病是否隐性或亚临床状态。 FQ-PCR 技术可以应用于肿瘤的研究及诊断。癌基因表达增加和突变在许多肿瘤早期和良性阶段就出现,FQ-PCR 技术不但能有效的检测基因的突变,而且能准确监测癌基因表达量,可据此进行肿瘤的早期诊断、分型和预后判断[6]。检测外周血中肿瘤细胞是判断肿瘤患者复发、转移和疗效的一种有价值指标。应用 FQ-PCR 技术检测外周血或骨髓中存在的肿瘤细胞, 是近年来发展起来的新方法, 具有灵敏度高、特异性强的优点。荧光定量 PCR 技术用于遗传病 DNA 基因诊断, 如检测血液中微量的遗传物已获得成功。对孕妇产前或产后进行基因诊断,有利于基因治疗。荧光定量 PCR 技术也可应用于对单基因病和新基因突变病如血友病、镰刀状贫血病、纤维囊性病以及舞蹈病症等的诊断。 2.3 FQ-PCR 技术在环境微生物检测中的应用
根据荧光类型,FQ-PCR 可分为染料类、探针类和引物标记三种。染料法中以 SYBR Green I 染料应用最广泛。 SYBR Green I 能与所有双链 DNA 小沟结合。在 PCR 反应体系中,加入过量 SYBR 荧光染料, SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。探针法是在待扩增区域结合上 DNA 探针，在 PCR 过程中,具有 5′→3′外切酶活性的 Taq 酶延伸引物链到 DNA 探针时,将 DNA 探针逐个降解,释放出荧光报告基团,这样 PCR 体系中荧光的强度与 PCR 产物量之间呈正比,可通过测定荧光强度而对 PCR 产物定量。引物标记是直接对引物进行荧光标记从而使荧光标记基团直接掺入 PCR 扩增产物的方法。

pcr技术的基本原理及其应用

PCR技术的基本原理及其应用1. PCR技术简介PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，它能够在体外扩增特定DNA序列。

PCR技术的出现革命性地改变了分子生物学研究的方式，广泛应用于基因测序、遗传变异检测、疾病诊断、法医学等领域。

PCR技术的核心原理是通过模板DNA、特异性引物和DNA聚合酶进行多轮循环扩增，产生大量目标DNA。

2. PCR技术的基本步骤PCR技术主要包括以下几个步骤：2.1 反应液的配制PCR反应液的主要组成包括模板DNA、引物、dNTPs（四个脱氧核苷酸），缓冲液和DNA聚合酶。

反应液的配制需要严格控制成分的比例和浓度，以保证反应的准确性和高效性。

2.2 热循环条件的设定PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。

通过不同温度的变化来控制这三个步骤，就可以实现DNA的扩增。

一般的PCR反应条件为：98°C变性5分钟，然后循环30-40次以下三步骤：变性95°C 30秒，退火55-65°C 30秒，延伸72°C 1分钟，最后72°C延伸10分钟。

2.3 扩增产物的检测PCR反应结束后，通过电泳检测扩增产物。

利用电泳技术，可以将扩增产物按照大小分离，从而确认特定DNA序列是否被扩增成功。

3. PCR技术的应用PCR技术在各个领域都有广泛的应用，以下是几个主要的应用方向：3.1 基因测序PCR技术被广泛应用于基因测序中，可以对目标DNA片段进行扩增，为后续测序提供充足的模板。

同时，PCR反应也可以用于检测测序结果的准确性。

3.2 遗传变异检测PCR技术可以对基因的变异进行检测。

通过引物的设计，可以扩增出特定基因片段，然后通过电泳检测，确认是否存在特定的遗传变异。

3.3 疾病诊断PCR技术在疾病诊断中有着广泛的应用。

通过检测某些特定基因的变异，可以帮助医生对遗传性疾病进行准确的诊断和预测。

3.4 法医学应用PCR技术在法医学中常被用于DNA鉴定。

PCR技术的原理、操作及应用

104
103 102 阈值
PCR技术的优点技术的优点
优点: 特异敏感快速、简便易自动化等
PCR技术的局限性技术的局限性
为了构建特定引物，使特定DNA序列的选择性扩增，必须有一个庞大的已知序列的数据库。聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的因素需要优化反应条件。 PCR技术扩增产物的长度有限。
1. 病毒核酸RNA提取 2. RT-PCR反应或者Real-time RT-PCR反应 3. UV紫外灯检测或者电脑上直接读取结果
流感病毒核酸提取 1
试验材料 QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit (或QIAGEN公司的QIAmp Viral RNA Mini Kit，操作类似) β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol） 70% 乙醇无菌及DNA,RNA酶的1.5ml 离心管 10µl、20µl、200µl、1000µl加样器和枪头可调13K微型冷冻离心机待检流感病毒200µl
Real-time PCR的操作 3 的操作
结果判定 1、质控标准 1.1阴性对照的检测结果为阴性。 1.2阳性对照的Ct值应小于等于28.0。否则，此次实验视为无效。 2、结果判断 2.1 Ct值无数值的样本为阴性样本。 2.2 Ct值≤30.0的样本为阳性。 2.3Ct值大于30.0的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。
PCR技术的操作 1 技术的操作
以流感病毒的RT-PCR和Real-time RT-PCR检测为例说明PCR技术的操作步骤主要仪器：PCR仪，Real-time PCR仪，微量移液器，高速冷冻离心机，电泳仪和电泳槽，凝胶电泳观察仪或成像系统，生物安全柜等。
PCR技术的操作 2 技术的操作

FQ-PCR技术在小儿患者巨细胞病毒感染检测中的应用

FQ—PC R技术在小儿患者巨细胞病毒感染检测中的应用刘金禄卢成何晓峰李采青(河北北方学院附属第一医院微生物科，河北张家口075000)【摘要】目的：探讨荧光定量检测在小儿患者巨细胞病毒(H C M V)感染中的诊断价值。

方法：对102例t bJ l,患者，取尿液用荧光定量PC R(FQ-PC R)技术检测。

结果：102例标本中28例阳性，阳性率为27．5％。

结论：荧光定量PC R检测方法具有快速、灵敏、特异等优点，在H C M V感染的早期诊断、治疗方案选择以及疗效观察方面具有广泛的应用前景。

【关键词】巨细胞病毒；H C M v-D N A；荧光定量聚合酶链反应【中图分类号]R373．4【文献标识码】B doi：10．3969／j．i ssn．1673—1484．2010．06．006A ppl i cat i on of FQ-PC a i n C h ecki n g H C M V-D N Ai n C hi l dr en w i t i t H C M V I nf e ct i onL I U Ji n-l u，LU C heng，H E X i ao-f e ng，et a lM i crobi ol ogi c al D epar t m e nt，The Fi r st A f f i l i at ed H ospi t al，H ebe i N ort h U ni ver si t y，Z hangj i akou．075000，H ebei。

Chi na[～gST R A C r l O bj ect i ve：T o i nve st i gat e t he di a gnost i c eva l uat i on of F l uor e sce nc e quan t i t at i ve PC R i n chec—ki n g H C M V i n chi l dr en w i t h H C M V i nf ee t i on．M et hods：T he ur i ne sa m pl e s of102ca se s w er e t est ed by FQ-PC R as sa y．R es ul t s：A m ong102pat i en t s，28cas e a ppe a red posi t i ve，an d t he pos i t i ve r at e w a s27．5％．C om：i u-si on：As H C M V det er m i ned by FQ-PC R as sa y i s qui ck、sensi t ive、speci f i c and quant i t at i ve，i t s app l i cat i on i s pr osp ect i ve i n di a gnosi s，choi ce of t r ea t m ent a nd t he obser va t i on of ef f ect s i n chi l dr en w i t h H C M V i nf ect ion．【l(EY W o剐D S】H C M V，H C M V-D N A，FQ-PC R人巨细胞病毒(H C M V)属于疱疹病毒群，是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒。

pcr技术原理方法及应用

pcr技术原理方法及应用PCR技术原理方法及应用PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种重要的分子生物学技术，可以在体外扩增DNA片段，被广泛应用于基因工程、医学诊断、疾病研究等领域。

本文将从PCR技术的原理、方法和应用三个方面进行介绍。

一、PCR技术原理PCR技术的核心原理是DNA的体外扩增，它包括三个基本步骤：变性、引物结合和延伸。

PCR反应体系中的DNA双链经过高温变性，使其解开成两条单链DNA。

这一步骤通常在94-96摄氏度进行，使DNA链变性并断开氢键。

接下来，引物（PCR反应中的两个短链DNA片段）与目标DNA 序列的两端互补结合。

引物是通过设计与目标DNA序列互补的两条单链DNA，它们分别位于目标DNA序列的两端。

引物的结合位置是PCR反应的关键，它决定了扩增的DNA片段的起始和终止位置。

然后，反应中的DNA聚合酶（Taq聚合酶）在适当的温度下，将引物作为模板，合成新的DNA链。

这一步骤通常在72摄氏度进行。

Taq聚合酶是从热波菌属中分离得到的一种DNA聚合酶，它具有耐高温的特点，能够在高温下进行DNA合成。

这三个步骤在一个PCR循环中重复进行，每个循环的结果是目标DNA序列的指数级增加。

几十个循环后，可以从初始数量很少的DNA样本中扩增出大量目标DNA片段。

二、PCR技术方法PCR技术具体的操作方法如下：1. 准备PCR反应液：PCR反应液通常包括DNA模板、引物、dNTPs（四个脱氧核苷酸）、T aq聚合酶和缓冲液等。

2. 设计引物：根据目标DNA序列的特点，选择合适的引物。

引物应具有足够的互补性，以确保在PCR反应中能够特异性结合目标DNA序列。

3. 设置PCR反应条件：根据目标DNA序列的长度和GC含量，设置合适的PCR反应温度和时间。

4. 进行PCR反应：将PCR反应液加入PCR管或96孔板中，放入PCR仪中进行反应。

通常，PCR反应的循环次数为25-40次。

荧光探针定量PCR技术原理及应用

荧光探针定量PCR技术原理及应用PCR技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增，实现目的基因的检测。

荧光探针定量PCR（FQ-PCR）是一种新的基因定量检测技术，国外文献多用“实时定量PCR（real time quantitative PCR）”或“TaqMan PCR(以美国PE公司商标命名) ”。

该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针，巧妙地把核酸扩增（PCR）、杂交及光谱技术结合在一起，从而实现了对目的基因的准确定量检测，正发展成为临床实验诊断的常规技术。

1.原理FQ-PCR的工作原理[1-3]是利用Taq酶的5’→ 3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针。

该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光报告基团FAM（6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518mm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基诺丹明,荧光发射峰值在582nm处)，两者之间构成能量传递结构。

当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所激发出的荧光信号被3’端淬灭基因吸收或抑制，不出现荧光信号变化。

当PCR反应体系中有目的基因存在，就会扩增出特异核酸片段，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交。

当PCR进入延伸（复制）期，Tap酶从引物3’端开始,随新链延伸沿DNA模板移动，当移动到探针结合的位置时，其5’→ 3’端外切酶活性作用，将探针切断（切口平移效应）。

荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的淬灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来（图1）。

PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。

由于被释放的荧光基团数目和PRC产物是一对一的关系，因此用荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。

由于荧光信号是代表扩增产物的有效特异信号，无需进行有效和无效信号分离，实现了仪器实时检测(图2)，为新的PCR定量原理创造了条件。

qfpcr的原理及应用

qfpcr的原理及应用1. 引言qfpcr（Quantitative Fluorescent PCR，定量荧光聚合酶链反应）是一种常用的基因分析技术，广泛应用于基因表达分析、基因突变检测、疾病诊断等领域。

本文将介绍qfpcr的原理和应用。

2. qfpcr的原理qfpcr是一种敏感、高效、特异性的PCR技术，通过荧光信号的定量测量来评估PCR反应中靶基因的数量。

其原理如下：2.1 PCR反应PCR反应通过模板DNA、引物、酶和荧光探针等组分，在特定的温度梯度下进行。

反应开始时，温度升高至解离DNA双链，使引物能够与模板DNA特异性结合。

然后温度降低，引物与模板DNA结合生成双链DNA。

此后，温度再次升高，酶酶解双链DNA，使引物再次结合模板DNA进行扩增。

PCR反应反复进行若干个循环，产生大量特定序列的DNA。

2.2 荧光信号的测定在qfpcr中，引物和荧光探针都带有荧光染料。

引物的扩增过程中，荧光信号逐渐增加，直到达到阈值。

荧光探针结合到靶基因序列上时，释放出明确的荧光信号。

通过荧光信号的定量测定，可以确定靶基因的数量。

3. qfpcr的应用3.1 基因表达分析qfpcr技术可用于基因表达分析，通过测定特定基因的表达水平来了解某个生物过程中相关基因的调控情况。

研究人员可以通过不同组织或条件下的基因表达水平差异，进一步探究某个基因在生物体内的功能和调控机制。

3.2 基因突变检测qfpcr技术可用于基因突变的检测。

通过设计特异的引物和荧光探针，可在PCR反应中筛查突变位点。

基因突变的检测对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。

3.3 肿瘤检测qfpcr技术在肿瘤检测中得到了广泛应用。

通过测定特定肿瘤相关基因的表达水平，可以帮助医生进行早期肿瘤的筛查和诊断。

此外，qfpcr技术还可以检测肿瘤的突变情况，为个体化治疗提供有力的依据。

3.4 微生物检测qfpcr技术可用于微生物的快速检测。

通过设计特异的引物和荧光探针，可以在PCR反应中检测微生物的DNA序列。

PCR的基本原理及临床应用

PCR的基本原理及临床应用PCR（Polymerase Chain Reaction）聚合酶链反应是一种在分子生物学领域广泛应用的技术。

它通过体外合成方法，在较短的时间内扩增特定DNA片段，从而使得该片段在实验室中能够得到充足的数量。

本文将详细介绍PCR的基本原理及其在临床应用中的意义。

一、PCR的基本原理PCR的基本原理包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。

1. 变性变性是指将待扩增的DNA双链分离为两条单链。

这一步骤一般在94-96摄氏度进行，目的是破坏DNA的双氢键并使其分离。

主要的变性剂是高温和变性缓冲溶液中的酸性条件。

2. 退火退火是指将温度降低，使引物能够与目标DNA序列特异性结合。

引物是通过设计，能够与待扩增的DNA序列的末端互补的短DNA片段。

在合适的温度下，引物与目标序列结合，形成引物-模板DNA复合物。

3. 延伸延伸是指在特定的酶的作用下，引物向下游的方向延伸合成新的DNA链。

在延伸的过程中，酶（一般为热稳定的Taq聚合酶）会在引物的基础上合成一个新的DNA链，产生两条新的DNA链，其中一条与原始模板序列完全一致。

PCR反应这三个步骤将会重复多次，每一次PCR循环会使目标序列数量翻倍。

一般来说，PCR反应会经过20-35个循环，从而在很短的时间内扩增出一大批目标序列。

二、PCR的临床应用PCR技术从20世纪80年代被引入以来，已经在临床医学中得到广泛应用。

PCR的高灵敏度、高特异性和快速性，使得它在许多临床领域具有重要的意义。

1. 诊断性应用在临床诊断中，PCR可用于检测疾病相关基因和病原体的存在。

例如，PCR可以用于检测遗传性疾病的致病基因，例如囊性纤维化、地中海贫血等。

此外，PCR还可用于检测与感染相关的微生物，如病毒、细菌和真菌等。

通过PCR检测，可以快速而准确地确定病原体的类型和数量。

2. 微创手术导航PCR在微创手术导航中有着重要的应用。

通过PCR技术，可以从患者生物组织中提取目标基因，然后通过扩增和检测，确定是否存在特定的突变或异常。

PCR技术的原理与方法

PCR技术的原理与方法PCR定义PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DN A为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA 互补的子链DNA的过程。

是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DN A。

可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。

PCR技术的基本原理一.PCR反应成分：1.模板DNA；2.引物；3.四种脱氧核糖核苷酸；4.DNA聚合酶；5.反应缓冲液、Mg2 等。

二.PCR反应基本步骤：1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。

2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。

3.延伸：中温延伸。

DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）1.变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程。

2.退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。

3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2 存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。

以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。

•PCR扩增的基本方法•PCR反应的成分和作用总体积：一般为25μl～100 μl（一）无Mg2 buffer：由纯水、kcl、Tris组成。

Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。

kcl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。

（二）Mg2 :终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200 μmol/L，注意Mg2 与dNTPs之间的3.延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在70～75℃。