紫外线诱变育种

紫外线诱变选育α-淀粉高产菌株

一、实验目的

1.学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。

2.通过诱变技术筛选出高产ɑ-淀粉酶的菌株。

二、实验原理

紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，一般为1-3min，死亡率控制在50％-80％为宜。被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。同时，对于细菌细胞的生理状态则要求培养至对数期为最好。本实验以紫外线处理产淀粉酶的枯草杆菌，通过透明圈法初筛，选择淀粉酶活力高的生产菌株。

三、实验材料

1.菌种产淀粉酶枯草芽孢杆菌

2.器材装有15W或30W紫外灯的超净工作台、电磁力搅拌器（含转子）、低速离心机、培养皿、涂布器、10m L离心管、（1、5、10m L）吸管、250m L三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球

3.培养基和试剂

①无菌水、75%酒精

②0.5％碘液碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200m L，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。

③选择培养基可溶性淀粉2g，牛肉膏1g，N a C l0.5g，琼脂2g，蒸馏水100m L，p H6.8～

7.0，121℃灭菌20m i n。

④肉汤培养基牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，N a C l0.5g，蒸馏水100m L，p H7.2～7.4，121℃灭菌20m i n。

四、实验步骤

1.菌体培养取枯草芽孢杆菌一环接种于盛有20m L肉汤培养基的250m L三角瓶中，于37℃振荡培养12h，即为对数期的菌种。

2.菌悬液的制备取5m L发酵液于10m L离心管中，以3000r/m i n离心10m i n，弃去上清液。加入无菌水9m L，振荡洗涤，离心10m i n，弃去上清液。加入无菌水9m L，振荡均匀。

3.诱变处理将菌悬液倾于无菌培养皿中（内放一个磁力搅拌棒），置电磁力搅拌器上于超净工作台紫外灯下（距离30c m）照射0.5-1m i n。

4.取0.1-0.2m L诱变后菌悬液于选择培养基平板上，用涂布器涂匀。置37℃暗箱培养48h。

5.在长出菌落的周围滴加碘液，观察并测定透明圈直径（C）和菌落直径（H），挑选C/H

值最大者接入斜面保藏。

五、注意事项

1.紫外线对人体的细胞，尤其是人的眼睛和皮肤有伤害，长时间与紫外线接触会造成灼伤。故操作时要戴防护眼镜，操作尽量控制在防护罩内。

2.空气在紫外灯照射下，会产生臭氧，臭氧也有杀菌作用。臭氧过高，会引起人不舒服，同时也会影响菌体的成活率。臭氧在空气中的含量不能超过0.1％-1％。

六、结果与讨论

1.利用紫外诱变育种，应注意哪些因素?

2.为什么诱变育种后要挑选C/H值最大者接入斜面保藏?紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。dna和rna

的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，dna分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响dna的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。

诱变在暗箱中进行。先将一定数量的种子用紫外线照射一段时间，然后再将种子培育出来，观察种子生长状况，发现产生了需要的性状后将该植株保留。注意：前期进行诱变的种子数量一定要多，因为种子发生突变的概率很小。

发酵工业是利用某种特定的微生物在一定的环境中进行新陈代谢，从而获得某种产品。现代发酵工业要求纯种培养，不仅斜面、种子和培养基以及发酵罐、管道等须经严格灭菌除去各种杂菌，而且在需氧发酵中通入的空气也需经过除菌处理。只有这样，才能确保生产不受杂菌污染，从而保证生产菌的旺盛生长。染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者导致倒罐，甚至停产。工业发酵中污染杂菌造成的损失是十分惊人的，所以必须认真对待除菌。

发酵时感染杂菌，可引起下列后果：

1) 产生菌和杂菌同时在培养基中生长，结果丧失了生产能力；

2) 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比产生菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主了；

3) 杂菌会污染最终产品，如生产单细胞蛋白时，从发酵液中分离出的细胞夹杂有杂菌；

4) 杂菌所产生的物质，使目的产物的提取发生困难；

5) 杂菌降解了所需要的产物；

6) 发酵时如污染噬菌体，可使产生菌发生溶菌现象。

二染菌的检查、原因分析和防治措施

1 染菌的检查与判断

1) 显微镜检查：通常用革兰氏染色法。先用低倍镜观察生产菌的特征，然后再用高倍镜观察是否有杂菌存在。根据生产均与杂菌的特征区别，判断是否染菌。必要时，可进行芽孢染色和鞭毛染色。

2) 平板划线培养或斜面培养检查法

3) 肉汤培养检查法：此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。

此外，还可以从发酵过程的异常现象来判断是否染菌，如溶解氧、pH值、排气中CO2含量和菌体酶活力等变化来判断。

2 发酵染菌率和染菌原因分析

发酵染菌率：指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比。发酵染菌率是在发酵罐中发生的染菌率，种子罐培养时发生的染菌若不接入发酵罐、不导致发酵染菌的不在计算之列。

由于各种发酵的菌种、培养基、产品性质、发酵周期、生产环境条件、设备和管理技术水平等不同，染菌率有很大差别。

3 杂菌污染途径及预防

杂菌污染途径及预防

1) 种子带菌。原因主要有：培养基及用具灭菌不彻底；菌种在移接过程中受污染；菌种在培养或保藏过程中受污染等。

2) 无菌空气带菌。杜绝无菌空气带菌，必须从空气净化流程和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。

3) 培养基和设备灭菌不彻底导致染菌。原因主要有：原料性状影响灭菌效果；实罐灭菌时未能充分排出罐内空气；培养基连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底而污染；设备、管道存在“死角”。

4) 设备渗漏引起染菌。发酵设备、管道、阀门、的长期使用，由于腐蚀、磨擦和振动等原因，往往造成渗漏。

5) 操作失误和技术管理不善也会引起染菌。如移种时或发酵过程罐内压力跌零，使外界空气进入而染菌；泡沫顶盖而造成污染；压缩空气压力突然下降，使发酵液倒流入空气过滤器而造成污染等等。

对噬菌体的防治措施