膜片钳技术与离子通道药理学
膜片钳技术与离子通道药理学
膜片钳在药理学研究中的应用
膜片钳技术不仅对于细胞生物学领域的 发展以及对于阐明各种疾病的机制具有革 命性意义，而且开辟了一条探索药物作用 机制和发展新的更为有效药物的途径。正 如 诺 贝 尔 基 金 会 在 颁 奖 时 所 说 :“Neher 和 Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理, 为研制新的更为特效的药物开辟了道路” 。
药理学研究： 研究的药物，阻断剂、激动剂 或其它调制因素对通道活动的影响情况。
综合分析得出最后结沦．
膜片钳技术的优点
膜片钳技术实现了小片膜的孤立和高阻封 接的形成，由于高阻封接使背景噪声水平 大大降低，相对地增宽了记录频带范围， 提高了分辨率。另外,它还具有良好的机械 稳定性和化学绝缘性。而小片膜的孤立使 对单个离子通道进行研究成为可能。
膜片钳技术与离子通道药理学
（Patch clamp techniques & Ion channel pharmacology）
马腾飞
药理教研室
1991 Nobel基金会的颁奖评语：
膜片钳技术点燃了细胞和分子水平 的生理学研究的革命之火，为细胞生理 学的研究带来了一场革命性的变化，它 和基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学 研究带来了巨大的前进动力。
OUTLINE
1、细胞电生理学 2、膜片钳技术及其应用 3、离子通道药理学
细胞电生理学 Electrophysiology
离子、离子通道
细胞兴奋
生物电信号
细胞电生理学
测量
细胞电生理学：揭示细胞的生理过程，用电 生理方法记录生物电活动
膜的“流动镶嵌模型”
细胞膜和离子学说建立（Hodgkin，et al . 1946年 ）
膜片钳实验室基本设备
2023年细胞生理学和膜片钳技术解析
膜片钳技术
• 膜片钳技术：从一小片(约几平方微米) 膜 获取电子学方面信息的技术，即保持跨膜 电压恒定——电压钳位，从而测量通过膜 离子电流大小的技术。通过研究离子通道 的离子流， 从而了解离子运输、信号传递 等信息。
基本原理
• 利用负反馈电子线路, 将微电极尖端所吸附 的一个至几个平方微 米的细胞膜的电位固 定在一定水平上,对通 过通道的微小离子电 流作动态或静态观察, 从而研究其功能。
• Voltage clamp （ 电 压 钳 技 术 ） 由 Cole 和 Marmont 发明，并很快由Hodgkin和Huxley完 善，真正开始了定量研究，建立了H－H模型 （膜离子学说),是近代兴奋学说的基石。
• 1948年，Katz利用细胞内微电极技术记录到了 终 板 电 位 ； 1969 年 ， 又 证 实 N － M 接 触 后 的 Ach以“量子式”释放，获1976年Nobel奖。
通道蛋白——离子通道
• 环核苷酸门控通道 气味分子与G蛋白偶联型受体结合，激活腺苷酸环化酶，
产生cAMP，开启cAMP门控阳离子通道（cAMP-gated cation channel），引起钠离子内流，膜去极化，产生神经 冲动，最终形成嗅觉或味觉。 • 机械门控通道
一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏 感的离子通道，前者几乎存在于所有的细胞膜，研究较多 的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等，后 者仅发现于内皮细胞和心肌细胞 • 水通道 2003年诺贝尔化学奖： Pete Agre、 Roderick MacKinnon
• 1976年，德国的Neher和Sakmann发明Patch Clamp（膜片钳）。并在蛙横纹肌终板部位记 录到乙酰胆碱引起的通道电流。
离子通道药理学
3．内向整流钾通道（inward rectifier K+ channels）
这类钾通道都具有内向整流特性，其中 比较重要的有三种：内向整流钾通道 （KIR），ATP敏感的钾通道(KATP)及 乙酰胆碱激活的钾通道（KAch）。
（1）内向整流钾通道（inward rectifier K+ channels）：该通道在心肌细胞称为 KIR（Kir2.1），其电流为Ik1。在心肌 细胞（心室肌），KIR通道也参与AP的 3相复极，但主要维持4相静息电位，防 止由于Na+-K+泵的作用使膜超极化大于 钾平衡电位（EK）。
（3）起博电流（pacemaker channels, If）
If是非特异性阳离子电流，即由一种 以上单价阳离子，如K+和Na+共同携带 的离子电流。是窦房结、房室结和希浦 系统的起搏电流之一。 If电生理特性：①If是由膜超极化激 活的随时间而逐渐增加的内向电流，其 阈电位在-50~-70mV左右；②If对Cs+敏 感，0.5mM Cs+几乎将If完全阻滞； ③肾 上腺素（Adr）促进 If的激活，If电流增 加，这是交感神经刺激加快心率的离子 基础之一；④If受乙酰胆碱（Ach）的调 节，Ach可抑制If，使心率减慢，故一般 认为副交感神经或迷走神经减慢心率的 机制是因为Ach抑制If的结果。Ach的作 用与Adr正相反。
三、离子通道的分子结构及门控机制
1．电压门控离子通道的分子结构
钠、钙和钾电压门控通道在分子结构上有许多相似之处，离子通 道蛋白是多亚基（subunits）构成的复合体。其中，构成孔道部分的 是α亚基。各种电压依赖的离子通道的α亚基均在膜上形成四个跨膜 区（D1-D4）,钠、钙通道的四个跨膜区由共价键连接成四倍体位于 同一肽链，整个亚基只有一个N-末端和一个C-末端。钾通道的α亚 基只有一个跨膜区，功能性钾通道是四个α亚基由非共价键连接而 成的四聚体。每个跨膜区由6个呈α螺旋式的跨膜片段 （transmembrane segmants, S1-S6）及其间的连结肽链所组成。连接 S5-S6的肽链部分贯穿于膜内，是形成亲水性孔道而有选择性地让离 子通过的部分，称为孔道区（pore region）或P区。另一个重要的肽 段是S4 , S4共带4～8个正电荷，当膜电位变化时，S4螺旋构型即发 生变化，通道开放，故S4被称为电压门控性离子通道的电压感受器 （voltage sensor）。
南京药理学膜片钳电生理技术原理
南京药理学膜片钳电生理技术原理
南京药理学膜片钳电生理技术是一种电生理研究技术，主要用于研究神经细胞或肌细胞的离子通道、离子泵等生理学特征。
该技术通过精细的电极制备和膜片吸附技术，可以在微小范围内对细胞膜上的离子通道做直接测量，从而探测细胞膜电位和电流。
该技术的原理是在一条微细的玻璃电极制成的药理学膜片上吸附悬浮的细胞，使细胞的膜紧贴于药理学膜片的通道上。
然后使用电生理技术进行实验，测量当细胞膜上某个离子通道开放时，离子的电流就会通过药理学膜片钳的电极进入记录器中，从而获得离子通道的电流、电位等信息。
同时，通过改变细胞膜上的离子浓度或加入药物，可以研究离子通道的特性，如激动、抑制、选择性等方面的生理学特征。
南京药理学膜片钳电生理技术在研究神经和肌肉等细胞膜上离子通道的生理学特征方面具有广泛的应用，如研究钙离子、钠离子、钾离子等离子通道的生理学特征，探索离子通道的结构及其功能解析等方面。
膜片钳技术及其在星形胶质细胞钾离子通道研究中的应用
等－进一步完善 了该项技术 ， ４ 使小片膜孤立并使吸 管与细胞膜之间的连接更 为紧密， 形成 电隔离和机 械 隔离 ， 减少 记录 的背景 噪音水平 ， 对拓宽 记录频 相
位又可记录膜电流。这种膜片用以研究细胞外物质 对细胞膜上所有通道 的作用 ， 可在 同一细胞上观察
几 种不 同通 道 的情况 。
１ ２ １ 细胞 贴 附式 （ｅｌ ｔ ｃ ｅ ａ ｈ 。。 ｃｌａ ａｈ ｄｐ ｔ ） ｔ ｃ
发育、 突触传递、 组织修复与再生、 神经免疫等方面 ， 都起 着 十分重 要 的作 用 … 。研究 还 表 明星 形胶 质 细胞与疼 痛 也 有着 非 常 密 切 的关 系 － 。 细胞 膜 上 ２ Ｊ
带 范 围 ， 高 了时间 、 间及 电流分辨 率 。 提 空
１ ２ 膜 片钳技 术记 录方式 ．
膜 片钳 技术 目前 已发 展 出许多适 合不 同需 要 的 记 录形式 －６。根 据 不 同 的研 究 目的 ， 选 择 不 同 ５ ． Ｊ 可 的膜 片构型 。主要 有 以下几种 类型 。
高阻 封接形成 后 ， 将微 管 电极 轻轻 提起 ， 再 使其 与 细胞分离 ， 电极 端形成 密封 小泡 ， 在空气 中短 暂暴
露几 秒钟后 ， 泡 破 裂再 回 到 溶 液 中就 得 到 “ 面 小 内
床 医学 的广泛重 视 ， 现就 膜 片钳 技 术及 其 在 星形 胶 质 细胞 钾 离子通道 研究 中 的应用 进行综 述 。 １ 膜片钳 技术
是用玻 璃微 电极 吸管 的尖端 ， 过 抛光 处 理后 使 其 经
膜外侧面接触浴槽液。这种膜片多用予研究细胞外 物质 、 药物 等对单 通道 的作用 ， 录到 的是单 通道 电 记
流。
膜片钳实验与技术
汇报人：
通过施加电压或 药物刺激可以观 察到离子通道的 开放或关闭状态 从而了解离子通 道的电学特性和 药理学特性。
膜片钳实验原理的 应用广泛可用于研 究药物对特定离子 通道的作用机制和 效果以及研究细胞 生理和病理过程中 的离子通道变化。
准备实验器材：包括膜片钳放大器、微电极、细胞、溶液等
制作细胞膜片：使用微操纵器将微电极置于细胞膜表面形成封 接
膜片钳技术的未 来发展方向
神经科学：研究神经元电活动与行为之间的关系 药理学：筛选和验证药物作用靶点及效果 生理学：研究细胞生理功能及信号转导机制 病理学：探究疾病发生发展过程中细胞电生理变化
PRT THREE
膜片钳技术是通 过玻璃微电极记 录细胞膜单一离 子通道活动的技 术。
膜片钳实验原理 基于膜片钳夹持 技术能够将细胞 膜的某一离子通 道单独夹持在玻 璃微电极之间。
膜片钳技术将进一 步应用于研究神经 元功能和药物作用 机制
膜片钳技术有望在 基因治疗和细胞疗 法等领域发挥重要 作用
膜片钳技术将与新 型技术相结合提高 实验效率和精确度
膜片钳技术将为研 究生物电信号和离 子通道提供更深入 的见解
挑战：高精度的测量和控制技术 挑战：细胞类型特异性标记和分离技术 展望：结合新技术实现更高效和准确的膜片钳实验 展望：拓展膜片钳技术在生物医学领域的应用范围
膜片钳技术用于筛 选潜在药物候选物
膜片钳技术用于研 究药物对神经元信 号转导的影响
膜片钳技术用于研 究药物对心血管系动化与智能化：提高实验效率和准确度 新型材料的应用：提高膜片钳技术的稳定性和可靠性 跨学科融合：与其他领域的技术相结合拓展应用范围 标准化与规范化：推动膜片钳技术的普及和推广
PRT FIVE
膜片钳技术在心血管及药理学研究中的应用
．６９８．中国心血管病研究２００７年９月第５卷第９期Ｃｈｉｒ№ｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｒｄｉｏｖａｓｃ“胁Ｒｅｖ如＂，Ｓｅ，ｔｅ舶ｅｒ２０Ｄ７，Ｖ０１．５，Ⅳ０．９膜片钳技术在心血管及药理学研究中的应用李妙龄曾晓荣（审校）国家教育部重点项目资助（０３１０９）作者单位：６４６０００四川Ｉ省，泸州医学院心肌电生理学研究室中图分类号Ｒ３３１．３＊８文献标识码Ａ文章编号１６７２—５３０１（２００７）０９－０６９８－０３膜片钳技术…是～种以记录通过细胞膜上的各种离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的或多个的离子通道活动的技术。
通过微电极与细胞膜之间形成紧密接触，采用电压钳或电流钳技术对生物膜上离子通道的电活动进行记录。
可测量１ＤＡ的电流灵敏度，１／ｓ．ｍ的空间分辨率和１０ｕｓ的时间分辨率，为从分子水平了解生物膜离子通道的开启和关闭、动力学选择性和通透性等膜信息提供了直接的手段。
膜片钳技术的发展不过２０多年时间【２】，但却广泛的应用于心血管生理学、病理生理学及药理学的研究中，使人们对心血管系统生理调节、分子水平的病理学改变及药物的作用机制有了更深的认识和研究手段，解决了大量的理论和实际问题。
膜片钳技术应用的影响是深远的，它是一类应用范围非常广泛的电生理学技术，它给电生理学和细胞生物学以及神经生理学的发展乃至整个生物学研究带来了～场新的革命。
随着它的进一步发展，膜片钳与分子生物学、激光共聚焦等技术的结合应用拓宽了它的应用前景。
本文拟对膜片钳的基本原理和其在心血管及药理学研究中的应用作一综述。
１膜片钳技术基本原理膜片钳技术是用一尖端光洁，直径约１ｐ，ｍ的玻璃微管电极与细胞膜表面在负压吸引下紧密接触，引成千兆欧封接，将吸附在微电极尖端开口处的那小片膜与其余部分的膜在电学上完全隔离开来，使小片膜中只包含一个或数个通道蛋白质分子，在此基础上固定电位，这样便可研究单个离子通道的活动【３】。
对这一小片膜上的离子通道的离子电流进行检测记录，故称为小片膜电压钳位技术（简称膜片钳）。
膜片钳技术
膜片钳技术摘要：80年代初发展起来的膜片钳技术(patch clamp technique)为了解生物膜离子单通道的门控动力学特征及通透性、选择性膜信息提供了最直接的手段。
该技术的兴起与应用，使人们不仅对生物体的电现象和其他生命现象更进一步的了解，而且对于疾病和药物作用的认识也不断的更新，同时还形成了许多病因学与药理学方面的新观点。
关键字：膜片钳细胞膜电位膜片构型通道膜片钳技术是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。
它和基因克隆技术（gene cloning）并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。
膜片钳技术发展历史1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。
1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。
1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。
1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。
Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。
膜片钳技术基本原理与特点膜片钳技术本质上也属于电压钳范畴，两者的区别关键在于：①膜电位固定的方法不同；②电位固定的细胞膜面积不同，进而所研究的离子通道数目不同。
电压钳技术主要是通过保持细胞跨膜电位不变，并迅速控制其数值，以观察在不同膜电位条件下膜电流情况。
因此只能用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道活动。
膜片钳技术及其在神经科学研究中的应用
膜片钳技术及其在神经科学研究中的应用膜片钳技术是一种在神经科学研究中广泛应用的技术，它可以用来记录和操纵神经元的电活动，为研究神经系统的功能和疾病提供重要的工具。
本文将介绍膜片钳技术的原理和应用，并探讨其在神经科学研究中的重要性。
膜片钳技术是一种通过在神经元的细胞膜上形成一个微小的孔洞，并利用微电极记录神经元内外的电位差的方法。
这种技术可以精确地记录神经元的动作电位，从而了解神经元的兴奋性和抑制性。
膜片钳技术的原理基于电生理学的基本原理，即神经元的电活动是由离子通道的开关控制的。
通过在神经元膜上形成一个微小的孔洞，可以通过微电极记录到神经元内外的电位差，从而了解离子通道的开关状态和神经元的电活动。
膜片钳技术在神经科学研究中有广泛的应用。
首先，它可以用来研究神经元的膜电位和动作电位。
研究人员可以通过在神经元膜上形成一个微小的孔洞，并利用膜片钳记录到神经元内外的电位差，从而了解神经元的电活动。
这对于研究神经元的兴奋性和抑制性非常重要，有助于理解神经元的工作原理和信息传递过程。
膜片钳技术还可以用来研究离子通道的功能。
离子通道是神经元膜上的蛋白质通道，它们控制着离子在神经元膜上的通透性，从而调节神经元的电活动。
通过利用膜片钳技术，研究人员可以记录到离子通道的电流，并分析离子通道的开关状态和功能特性。
这对于研究离子通道的结构和功能非常重要，有助于揭示离子通道与神经系统功能和疾病之间的关系。
膜片钳技术还可以用来研究突触传递和突触可塑性。
突触是神经元之间的连接点，通过突触传递神经信号。
膜片钳技术可以用来记录到突触传递的电位变化，并研究突触的功能特性和可塑性。
这对于理解神经系统的信息传递和学习记忆等高级功能非常重要。
在神经科学研究中，膜片钳技术的应用还包括单细胞蛋白质表达、药物筛选和基因编辑等方面。
通过将膜片钳技术与其他技术结合，研究人员可以进一步探索神经系统的功能和疾病机制，为神经科学研究提供更加全面和深入的理解。
穿孔膜片钳技术在离子通道电流研究中的应用
Effects of puerarin on L type calcium channel in CA 1pyramidal neurons in hippocampus of adult ratsT ang Yu,L uo Ro ng jing ,Zho u L e quan(Depar tment o f Physio lo gy ,T he Basic M edical Co llege ,Guang Zhou U niver sity o f T CM ,G uang Zho u 510405)Abstract Objective:T o o bser ve the effect o f P uer arin on L t ype calcium channel in CA1py ramidal neur ons in hippocampus of a dult r ats aft er g iving sever al concentr ations.Methods:T he pyr amidal neuro ns in hippocampal CA1r egion w ere dissociated acutely from SD adult r ats by the enzymatical and auto matical w ay.T he cell suspension was then placed into a 35mm petr i dish .A fter allo w ing the cell to settle ,select ing the cell that acco rd w ith o ur ex perimental conditio ns.T hen r eco rding the io nic channel activity at the same holding vo ltag e by the cell at tached o f patch clamp techniques.Results:No significant effect w ere seen in L type calcium chan nel in CA 1pyr amidal neur ons w ith the low concentr ations of puera rin(1 2,2 4mmo l L -1).A t a g iv en holding v oltage ,significant change w as obser ved in the o pen time of the L t ype calcium channel after inf using P uer arin(4 8,9 6,19 2mmol L -1).O pen time was 11 773 4 838ms for contro l ,7 948 2 513ms for concentr ation o f 4 8mmol L -1(P <0 05,n=5),and 4 5330 828ms (9 6mmol L -1,P <0 05v s co nt rol ),then 3 042 0 792ms(19 2mmol L -1,P<0 05v s contro l ).T he open pr obability was0 0011 0 0001in contro l ,decr ease to 0 00053 0 00018(4 8mmol L -1,P <0 05v s co nt ro l ),and 0 00032 0 00013(9 6mmol L -1,P<0 05vs co nt rol ),then went dow n 0 00021 0 00009(19 2mmo l L -1,P <0 05v s contr ol ).Conclution:P u er arin can inhibit L -t ype calcium in CA 1py ramidal neuro ns,decrease the open time ,reduce the o pen pro bability.W hich implies that Puerar in t akes part in tr eatment o f ischemia st oke in clinic partly due to the inhibition of L ty pe calcium channel in neuro n.Key Words:puerar in;L type calcium channel;patch clamp cell at tached recor ding ;CA 1pyr amidal neurons实验技术穿孔膜片钳技术在离子通道电流研究中的应用*李鹏云 曾晓荣!杨 艳 蔡 芳(泸州医学院心肌电生理学研究室,泸州,四川646000)摘 要 目的:传统的全细胞膜片钳技术在离子通道电流的记录中存在机械稳定性差,对细胞的损伤大,以及胞内液的被渗析影响与细胞内信号转导和离子通道调控有关的第二信使物质的正常运行。
膜片钳技术原理及相关基本知识
膜片钳技术可以用于研究内分泌系统的电生理特性，了解激素分泌的 调节机制。
其他领域的应用
肿瘤学研究
膜片钳技术可以用于研究肿瘤细胞的 电生理特性，了解肿瘤的发生和发展 机制。
免疫学研究
膜片钳技术可以用于研究免疫细胞的 电生理特性，了解免疫反应的调节机 制。
THANKS
感谢观看
膜片钳技术可以用于药物筛选， 快速筛选出具有潜在治疗作用的 药物。
膜片钳技术可以用于研究药物对 离子通道的影响，了解药物的副 作用和不良反应。
生理学领域的应用
心血管系统研究
膜片钳技术可以用于研究心血管系统的电生理特性，了解心脏和血 管的电活动和功能。
呼吸系统研究
膜片钳技术可以用于研究呼吸系统的电生理特性，了解呼吸肌的电 活动和功能。
膜片钳技术的应用领域
生理学研究
研究细胞膜离子通道的电生理 特征和功能，揭示生理状态下
细胞膜电活动的规律。
药理学研究
研究药物对离子通道的作用机 制和效果，为新药研发提供实 验依据。
神经科学研究
研究神经元和神经网络的电活 动和信息传递机制，揭示神经 系统的工作原理。
疾病机制研究
研究疾病状态下细胞膜离子通 道的异常变化，为疾病诊断和
数据采集
使用膜片钳系统记录细胞膜 电位变化，通过放大器和记 录器获取数据。
数据筛选
排除异常或噪声数据，确保 数据质量。
数据转换
将原始数据转换为适合分析 的格式，如电压值或电流值 。
数据分析方法
统计分析
对数据进行统计分析，如平均值、标准差、相 关性等。
频谱分析
对数据进行频谱分析，以了解信号的频率成分。
膜片钳技术适用于多种细胞 类型，包括神经元、肌肉细 胞、上皮细胞等，具有广泛 的应用范围。
膜片钳技术及其应用实例
2、CdCl2和NiCl2对小鼠生精细胞Ca2+电流的作用比较
激活曲线： 分析细胞膜电位的 变化引起激活离子 通道数的变化。半 数激活电压 (-49.430.62)mV， 斜率因子 (6.050.55)mV， 在-65mV到-10mV 通道开放。
Normalizedcurentamplitude/conductane
小鼠生精细胞T型Ca2+通道复活特征
5
二、膜片钳技术
1976年 德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann 在青蛙肌细胞上记录记录到ACh激活的单通道离子电流 1980年 Sigworth等用负压吸引，得到10-100GΩ的高 阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声 1981年 Hamill和Neher等引进了膜片游离技术和全细 胞记录技术 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问 世，奠定了膜片钳技术的里程碑。
4、硝苯地平(nifedepine)对小鼠生精细胞T型钙电流的作用
不同浓度硝苯地平对小鼠 粗线期精母细胞T型Ca2+电 流的作用
在本试验条件下，我们记录到的小鼠生精细胞内向 电流经过通道电生理学特性和药理学特性两个角度 鉴定，证实记录到的为T型Ca2+电流，无L型Ca2+通道 电流成分。并结合精子发生特点，提示精子顶体反 应时Ca2+的内流主要由胞膜T型Ca2+通道完成。
膜片钳技术在药学研究中的应用
膜片钳技术在药学研究中的应用前言德国物理学家Neher和Sakmann[1.2]建立的膜片钳技术（patch clamp technique）是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的（或多数的）离子通道活动的技术，已被广泛应用。
作为先进的细胞电生理技术，它一直被奉为研究离子通道的“金标准”。
应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在，并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机制等进行深入的研究。
基因组学、蛋白质组学研究表明，以离子通道为靶标的药物研究在未来具有很大的发展空间。
关键词膜片钳技术；药学研究；应用Abstract [ ]The patch-clamp technique , a dominant technique in cellular electrophysiology , is always being regarded as the gold standard for ion channel research.. Application of the patch-clamp technique can demonstrate the existences of ion channels and provide valuable information for ion channels, including their electrophysiological properties , molecular structures and the mechanism of drug action .Genomics and proteomics research has showed that the development of drugs for ion channel target would be very promising in future.Key words Patch-clamp technique ; Study on Medicinal chemistry ; Application80年代初发展起来的膜片钳技术（patch clamp technique）为了解生物膜离子单通道的门控动力学特征及通透性、选择性膜信息提供了最直接的手段，该技术的兴起与应用，使人们不仅对生物体的电现象和其它生物现象有更进一步的了解，而且基因组学、蛋白质组学研究表明，以离子通道为靶标的药物研究在未来具有很大的发展空间。
细胞电生理学与膜片钳技术资料
膜片钳技术实现膜电位固定的关键 是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间 形成高阻（ 10ＧΩ ）密封,使电极尖端开 口处相接的细胞膜片与周围环境在电学 上隔离,并通过外加命令电压钳制膜电位。
由于玻璃微电极尖端管径很小,其下膜面 积仅约1μｍ2,离子通道数量很少,一般只有一 个或几个通道,经这一个或几个通道流出的离 子数量相对于整个细胞来讲很少 , 可以忽略 , 也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静 息电位的影响可以忽略 , 那么 , 只要保持电极 内电位不变,则电极下的一小片细胞膜两侧的 电位差就不变,从而实现电位固定。
• 为研究化学门控性通道性质，我国学者秦 达 意 采 用 oil-gate concentration jump method ，配合膜片钳记录和分析离子通 道在各种化学条件下的开放与关闭以及激 活与失活的动态过程。
选择性（selectivity） 门控性（gating）
研究技术：
膜片钳技术和分子克隆技术
通道蛋白——离子通道
• 配体门控通道 阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体 阴离子通道：甘氨酸和γ－氨基丁酸受体
乙酰胆碱受体
通道蛋白——离子通道
• 电压门控通道：钾、钠、钙离子通道
电压门控钾离子通道
通道蛋白——离子通道
磷脂双层的 屏蔽作用
Na-K 泵
离子的跨膜分布
[K+]o << [K+]i [Na+]o >> [Na+]i
离子通道
(ion channels)
离子通道是细胞膜上的一种特殊整合蛋白，对某 些离子（K+、Na+、Ca2+等）能选择通透，其功能是细 胞生物电活动的基础。
膜片钳实验技术入门---基本原理与操作
膜⽚钳实验技术⼊门---基本原理与操作膜⽚钳实验技术⼊门------基本原理与操作关兵才李国华刘理望按：本⽂乃于2003年根据较旧型号的仪器写成，后被《机能实验科学》（郑先科主编，北⼤医学版，2006）收⼊。
因新旧仪器基本原理和操作步骤⼤同⼩异，现对原⽂略作修改和标注，供同学们参考。
【实验⽬的】1. 了解膜⽚钳技术的基本原理和操作。
2. 初步学习电压依赖性离⼦通道电流的基本记录⽅法。
【实验原理】⼀、膜⽚钳技术原理简介膜⽚钳(patch clamp)是⼀种主要⽤于检测细胞膜离⼦通道活动的电⽣理技术，按⼯作⽅式可区分为电压钳(voltage clamp)和电流钳是最基本的⼯作⽅式，即对细胞膜电位进⾏⼈为控制，如将膜电位钳制于某⼀固定⽔平，或在此基础上再施以阶跃(step)式或斜坡式(ramp)电压刺激，同时记录跨膜电流，从⽽分析细胞膜通道的活动。
电流钳即⼈为控制经微电极对细胞进⾏注射的电流（等于离⼦通道电流与细胞膜电容电流之和），同时记录膜电位及其变化。
若注射电流为零即常⽤的零位钳流，⽤于测量细胞膜静息电位，若注射⽅波脉冲刺激电流，⽤于诱发、观测动作电位。
另外，膜⽚钳技术还常⽤于观测细胞膜电容, 从⽽推测分泌细胞的活动情况。
下⾯主要介绍其电压钳⼯作⽅式的基本原理。
（注：在电⽣理资料中，因通常将细胞外液和记录系统的“地”点相连作为参考点即零电位点，所以电位和电压两个概念经常混⽤。
）根据膜⽚钳实验中受检细胞膜的型式（configuration）不同，⼜可将膜⽚钳分为全细胞式(whole-cell)、细胞贴附式(cell-attached 或on-cell)、内⾯朝外式(inside-out)、外⾯朝外式(outside-out)等四种模式。
(⼀)全细胞式1．电压钳制和电流记录的实现图9-9为全细胞式膜⽚钳⼯作原理⽰意图。
图9-9 全细胞膜⽚钳实验原理⽰意图A1：运算放⼤器；A2：单倍增益差动放⼤器；R f：反馈电阻；V p：电极电位（A1反向输⼊端电位）；V c：A1同向输⼊端电位；C in：输⼊端杂散电容；C p：电极电容；Rs：串联电阻；C m：细胞膜电容；R m：细胞膜电阻；E m：细胞膜内在电位(指钳压时的细胞膜诸通道状态决定的内在Goldman-Hodgkin-Katz平衡电位)；V o：A2输出端电位；V-offset：偏移电位补偿电位；C c：⽤于电容补偿的电容；V c(app)：表观钳制电压即欲施加于受试膜⽚的电压；图中⊕和表⽰求和电路将充有电解质溶液的玻璃微电极（glass microelectrode或 recording pipette）利⽤负压紧密吸附于细胞表⾯，形成吉欧即千兆欧（109Ω）级⾼阻封接，进⼀步对微电极内施加负压、将放⼤器（以下简称运放）A1在深度负反馈⼯作状态下的“虚短路（virtual short circuit）”原理实现，即只要A1⼯作于线性范围内，其反向输⼊端的电位V p总是等于同向输⼊端的电位V c，这两个输⼊端之间虽⾮短路却类似于短路。
细胞膜膜片钳位技术与离子通道药理学
细胞膜膜片钳位技术与离子通道药理学
汪海;刘传缋
【期刊名称】《国际药学研究杂志》
【年(卷),期】1992(19)2
【摘要】细胞膜膜片钳位技术是80年代初才完善起来的一项生物高技术,具有
1pA电流测量灵敏度、10μs时间分辨率,可直接记录细胞膜离子单通道的活动,研究其“开”、“闭”动力学、离子通透性及选择性。
本文介绍细胞膜膜片钳位技术在离子通道药理学研究中的应用。
【总页数】4页(P65-68)
【作者】汪海;刘传缋
【作者单位】军事医学科学院
【正文语种】中文
【中图分类】R966
【相关文献】
1.离子通道研究技术的最新进展——全自动膜片钳技术 [J], 曹小于;郑婉云;鲁燕滨;黄超
2.全细胞膜片钳技术在视网膜神经元电压门控离子通道研究中的应用 [J], 丁宁
3.一种检测细胞膜离子通道功能的新技术--膜片钳术 [J], 周丽萍;罗荣敬
4.离子通道实验中膜片钳位仪参数的设置及应用 [J], 刘智飞;曾晓荣
5.膜片钳技术及其在星形胶质细胞钾离子通道研究中的应用 [J], 黄燕;王增贤
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OUTLINE
1、细胞电生理学 2、膜片钳技术及其应用 3、离子通道药理学
细胞电生理学 Electrophysiology
离子、离子通道
细胞兴奋
生物电信号
细胞电生理学
测量
细胞电生理学：揭示细胞的生理过程，用电 生理方法记录生物电活动
膜的“流动镶嵌模型”
细胞膜和离子学说建立（Hodgkin，et al . 1946年 ）
药理学研究： 研究的药物，阻断剂、激动剂 或其它调制因素对通道活动的影响情况。
综合分析得出最后结沦．
膜片钳技术的优点
膜片钳技术实现了小片膜的孤立和高阻封 接的形成，由于高阻封接使背景噪声水平 大大降低，相对地增宽了记录频带范围， 提高了分辨率。另外,它还具有良好的机械 稳定性和化学绝缘性。而小片膜的孤立使 对单个离子通道进行研究成为可能。
Patch-clamp(膜片钳)技术
探头
膜片钳放大器 模数转换
单细胞
样品池
计算机
电极 电极 K+ Na+ Ca2+
+--+尖端所吸附 的一个至几个平方微 米的细胞膜的电位固 定在一定水平上,对通 过通道的微小离子电 流作动态或静态观察, 从而研究其功能。
乙酰胆碱受体
通道蛋白——离子通道 电压门控通道：钾、钠、钙离子通道
电压门控钾离子通道
研究技术
Patch-clamp技术 单细胞电流记录
分子生物学技术 基因克隆及蛋白表达
Na+,Ca2+,K+,Cl-等电流 通道蛋白功能测定
离子通道的结构与功能 药物作用机制 新药开发
OUTLINE
1、细胞电生理学 2、膜片钳技术及其应用 3、离子通道药理学
Vibration Isolation Table
Micro-Manipulators Remote Controller
Electrophysiology-Apparatus
DAD-VC system
MicroManipulators
CCD Camera
Electrophysiology-Apparatus
1、生物膜分子结构？ 2、物质转运功能？
脂质双分子层、蛋白质、糖类 单存扩散、易化扩散、主动转运、出入胞
离子通道 (ion channels)
离子通道是细胞膜上的一种特殊整合蛋白，对某 些离子（K+、Na+、Ca2+等）能选择通透，其功能是细 胞生物电活动的基础。
离子通道的特性
(Characteristic of Ion Channels)
Patch clamp-whole cell
细胞吸附膜片
(cell-attached patch mode)
膜片钳记录的各种模式
根据膜片与电极之间的关系，可将膜片记录主 要分为４种模式 。
首 先 建 立 的 单 通 道 记 录 法（ Single channel recording）是细胞吸附式，其后又建立了膜 内面向外和膜外面向外的模式；还有一种是全 细胞记录法（Ｗhole cell recording）的全 细胞式。现在又发展了开放的细胞吸附式膜内 面向外和穿孔囊泡膜外面向外的模式 ，以及 穿孔膜片的模式。
资料分析
一般电学性质：通过I/V关系计算单通道电导， 观察通道有无整流。通过离子选择性、翻转电 位或其它通道激活条件初步确定通道类型。
通道动力学分析：开放时间、开放概率、关闭 时间、通道的时间依赖性失活、开放与关闭类 型(簇状猝发，Burst)样开放与闪动样短暂关闭 (flickering)，化学门控性通道的开、关速率常 数等。
二、门控特性(Gating)：
失活状态不仅是通道处于关闭状态， 而且只有在经过一个额外刺激使通道从 失活关闭状态进入静息关闭状态后，通 道才能再度接受外界刺激而激活开放。
失活
inactivation
开放 状态
激活
activation
open state
通道蛋白——离子通道
配体门控通道 阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体 阴离子通道：甘氨酸和γ－氨基丁酸受体
膜片钳记录
电极拉制：一般采用常规二步法完成，电极尖 端直径在0.5-2.0μm之间，是否涂胶与抛光应根 据经验而定，不必强求。
亿欧姆封接：电极充灌安装后即给持续正压， 在倒置显微镜监视下将电极贴近细胞，以微操 纵器将电极贴于细胞，去掉正压后再稍施负压 吸引，亿欧姆封接便瞬间形成。要保证亿欧姆 封接就必须做到： 1)电极电阻适当；2)电极尖 端清洁；3)电极气路通畅； 4)电极与细胞相贴 宁不及而勿过之； 5)细胞膜清洁，活性好。
膜片钳技术与离子通道药理学
（Patch clamp techniques & Ion channel pharmacology）
马腾飞
药理教研室
1991 Nobel基金会的颁奖评语：
膜片钳技术点燃了细胞和分子水平 的生理学研究的革命之火，为细胞生理 学的研究带来了一场革命性的变化，它 和基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学 研究带来了巨大的前进动力。
膜片钳实验室基本设备
膜片钳放大器 信号转换器 倒置显微镜 微操纵器 防震工作台及静电屏蔽笼 微电极拉制仪及抛光仪 计算机 专用软件 细胞记录槽 恒速灌流泵
Electrophysiology-Apparatus
Faraday cage
Microscope
Amplifiers
CCD Camera
一、离子选择性(selectivity )（大小和 电荷）：
某一种离子只能通过与其相应的通道 跨膜扩散(安静：K>Na 100倍、兴奋： Na>K 10-20倍）；各离子通道在不同状 态下，对相应离子的通透性不同。
失活 状态
Inactive
state
复活
recovery
静息
状态
resting
state
Electrophysiology-Apparatus
Patch clamp
膜片钳记录的基本步骤
可概括为4大部分： 1.液体配制。主要根据研究通道的不同，配制相
应的液体，基本原则是保持2个平衡：渗透压 平衡和酸碱平衡。 2.标本的制备。膜片钳记录标本的制备主要有： 急性分离、细胞培养、脑片或其它组织薄片。 当根据不同的研究要求而相应选择。 3.膜片钳记录 4. 资料分析用相应的计算机软件进行