组织化学技术

染色的目的，是将染料配制成溶液，将组织切片 浸入染色剂内，经过一定的时间，使组织或细胞及其 他异常的成分染上不同深浅的颜色，产生不同的折射 率，便于在光学显微镜下进行观察。因此，染色在组 织形态学，特别是病理形态诊断、科研和教学工作中， 都具有非常重要的意义和实用价值。
二、 染色的原理
染色就是染色剂和组织细胞相结合的过程。有关
两者结合的原理，有不同的学说，一般认为其过程是
化学反应和物理现象。
（一）染色的化学反应 在组织细胞内，一般有酸性和碱性区别，酸性物 质部分能与溶液中的阳离子结合，碱性物质部分能与 溶液中的阴离子结合。在细胞核中，特别是核内染色 质，一般有酸性物质组成（其中主要有核酸），故与 碱性染料的亲和力很强，易于染色，以氧化苏木素代 表的碱性染料中有染色作用的是阳离子。在细胞浆中 则由碱性物质组成，所以胞浆与酸性染料有较强的亲 和力，以伊红染料为代表的酸性染料中有染色作用的 是阴离子。
(2) Van Gieson染液 甲液：1％酸性品红水溶液 乙液：苦味酸饱和水溶液(约1．2％)
10ml 90ml
分别配制临用时加以混合，不能久用。 (3) l％盐酸-乙醇 70％乙醇 99ml 纯盐酸 1ml
4、染色步骤 （1）组织固定于10%甲醛液中，常规脱水包埋。 （2）组织切片脱蜡至水。 （3） 用Weigert铁苏木精液染5～10min。流水稍洗。 （4）1％盐酸－乙醇迅速分化。流水冲洗5～10min。 （5）用Van Gieson液染1～2min。 （6）倾去染液，直接用95％乙醇分化和脱水， （7）无水乙醇脱水 ，用滤纸吸干。二甲苯透明， 中性树胶封固。
5、结果
胶原纤维呈红色，肌纤维、胞质及红细胞黄色，胞 核蓝褐色。
肝硬化增生的胶原纤维
（二） 网状纤维染色 1、网状纤维染色的形态特点 网状纤维是网状结缔组织内的一种纤维。它由 网状细胞产生，网状细胞是星状多突的细胞，核大， 着色较浅，核仁明显，胞质较丰实，胞突彼此连接形 成细胞网架。网状纤维细而有分支，穿行于细胞体和 突之间，共同构成网状支架。这种纤维用HE染色一 般不易辨认。若用银氨溶液浸染能使纤维变成黑色， 故又称嗜银纤维。
程中更有Βιβλιοθήκη Baidu格的要求，使用后的玻璃器皿在一般清洗后，还要求用
硫酸清洗液浸泡。
硫酸清洗液配制：
重铬酸钾 自来水 80g 1000ml
浓硫酸（工业用） 120ml
新配制的清洁液为红褐色，反复使用一段时间后，慢慢变成绿 色，说明清洁液已失败，不能继续使用应重新配制。
玻璃器皿的清洗方法 ： ① 任何玻璃器皿都必须用自来水冲洗，然后把残余药液或染液 洗去。 ② 用毛刷沾洗衣粉擦干净。 ③ 自来水冲洗，蒸馏水洗2次。 ④ 把晾干的器皿轻轻置入清洁液浸泡数日。 ⑤ 取出器皿，用自来水把器皿内外彻底冲洗干净，最后用蒸馏 水洗2次。 ⑥ 把玻璃器皿倒置于有孔架上自然晾干或温箱中烤干，最后存 放橱内备用。
四、染色中的基本原则
（一）染色前的处理：
1、脱蜡至水 凡是石蜡切片必须经过二甲苯脱 蜡，各级乙醇至水洗的过程。
2、除去汞盐沉淀物 对于用升汞固定或含有升汞混合 固定液的切片，切片脱蜡后需脱汞处理。
4、脱甲醛色素 甲醛固定组织时间较长及温度较高 情况下，甲醛易氧化自行分解产生甲酸，导致组织 成酸性，此时可能有甲醛色素产生。此种色素无光 泽，不溶于水、乙醇、二甲苯等。
网状纤维的应用比较广泛，用来判定病变组织支 架的破坏情况，组织、脏器网状支架的存在与塌陷、 完整与破坏、网状纤维的分布及走行，有多少、粗细、 疏密或有无断裂形态变化。
2、网状纤维染色的原理 网状纤维的染色方法很多，但是染色原理基本相 同，有以下方面。 （1）氧化 氧化的作用是使网状纤维具有选择性，不 经氧化的切片，网状纤维均不能较好地显示出来，常 用的氧化剂是高锰酸钾。 （2）漂白 一般采用2%草酸，使漂白后无色。
相对的特异性。
意义： （1）特染能显示在常规染色切片中不明显的部分， 如革兰氏染色、细菌染色。 （2）区别HE染色中不能鉴别的组织病变，如VG染色 区别胶原纤维和平滑肌。 （3）显示某些常规染色中不能着色的物质，如网染 才能显示网状纤维，常规HE染色是染不出来的。 因此，特殊染色也是制片染色中不可缺少的组成部分， 它在病理诊断常着辅助作用，也为科研提供依据。
HE染色：苏木素－伊红染色
自动染色机
HE染色：苏木素－伊红染色
自动封片机
冰冻切片的快速染色法
1 2 3 4 5 6 7 8 水洗 5s； 苏木精染色 2min；（新鲜） 水洗 5s； 分化 0.1%HCl酒精分化1～2s （至变红）； 水洗 5s蓝化； 伊红染色 20s ； 水洗 5s； 95%乙醇Ⅰ 35s；95%乙醇Ⅱ 35s；100%乙醇Ⅰ35s；100%乙 醇Ⅱ35s； 9 透明 二甲苯Ⅰ 5s；二甲苯Ⅱ 5s； 10 封片 中性树胶封片。
3、苦味酸-酸性品红（VG） 染液试剂配制
(1) Weigert铁苏木精染液 甲液：苏木精 1g 无水乙醇 100ml 乙液：30％三氯化铁液 4ml 蒸馏水 95m1 纯盐酸 lml 甲、乙两液须分瓶盛放。甲液配制后数天即可用， 不宜配制过多，保存时间过长时染色不良，平时应密 封保存。乙液配制后立即可用。临用前将甲、乙两液 等量混合。
5~10min 5~10min 30se~1min 30se~1min 30se~1min 30se~1min 30se~1min 30se~1min 10se~15min 30sec~1min 30sec 5~10min 2~5min 1min 30~1min 30~1min 30~1min 30~1min 30~1min 1min 1min 1min 1min
组 织 化 学 技 术
切片染色方法可以显示不同细胞和组织 形态，以及细胞和组织中某些化学成分含量 的变化。
一、染色的目的
任何冰冻切片、石蜡切片等如果不经过染色，在 显微镜下只能看到细胞及其它组织成分的轮廓，即使
由于组织内部各种物质的折射指数不同，从光线的明
暗上能观察到一些组织结构，但也是极其简单有限的， 远不能满足观察和借以诊断的目的。
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思考题：
HE染色法的程序如何? 请简要说明。
特 殊 染 色 技 术
一、特殊染色的概念及意义
为了显示组织或细胞中的正常结构或病理过程中 出现的异常物质、病变、病原体等，需要选用相应的
显示这些成分的染色方法进行染色，这是常规染色不
能显示的，故称特殊染色。特殊染色为常规染色（即
苏木素、伊红）的必要补充，又称选择性染色，只有
（五）多种染色 选用两种以上的染料的染色，如
Masson三色染色法。
胶原纤维呈蓝色，肌纤维胞质 呈红色，细胞核呈蓝褐色。
（六）进行性染色：又称渐进性染色，将组织成分着色自 浅至深，当达到所需要的强度时，终止染色。一般所采用 的染液溶度较低，染色过程中应该不时在镜下观察进行控 制，这样才能得到染色强度适中的效果。 退行性染色：又称退性染色，先将组织浓染过度，使 其超过所需的程度，然后再用某些溶液脱去多余的染色剂， 以达到适当的深度，并使不应着色的组织、细胞的某些成 分脱去色度，这个步骤称为“分化”。而最终使应该着色 部分达到适宜程度。如常规HE染色中的苏木素染核与盐 酸水分化过程就是退行性染色。
HE染色分化液和返蓝液的配制
HE染色分化液：
0.5％盐酸乙醇液：蒸馏水300 ml与95％ 乙醇700 ml混合后加入浓盐酸5 ml混匀。
HE染色返蓝液：
0.5％氢氧化氨液：在1000毫升蒸馏水中 溶入5毫升浓氢氧化氨混匀 。
HE 染 色 法 程 序
1、二甲苯 2、二甲苯 3、无水酒精 4、无水酒精 5、95%酒精 6、95%酒精 7、90%酒精 8、80%酒精 9、Harris 苏木素 10、自来水洗 11、1%盐酸酒精 12、流水冲洗 10~15min 或温水洗 13、1%伊红染色 14、80%乙醇洗去多余的染色 15、90%酒精 16、95%酒精 17、95%酒精 18、100%酒精 19、100%酒精 20、石碳酸二甲苯 21、二甲苯 22、二甲苯 23、二甲苯 24、中性树胶封固
在病理诊断（活检）、教学、科研工作中都被广泛 应用，对细胞学的观察也具有重要价值。
HE染色主要显示各种组织正常成份和病变的一般 形态结构，病理组织学的基本知识大部分都是从观察 HE染色切片中获得的。
苏木精染色液的配制
伊红染色液的配制
(1)先将20 g伊红Y溶于500 ml蒸馏水中，用玻棒 搅拌至其完全溶解后再加入1000 ml蒸馏水并搅 匀，液体呈深红色。 (2)加入500 ml 95％乙醇并搅匀，此时液体由深 红色转变为荧光绿色。 (3)加入1ml冰乙酸并搅匀，密封瓶口室温储存备 用。
3. 吸附作用 吸附作用是固体物理的特性，它能从周 围溶液中吸住一些细小的物质微粒，这些微粒可能是 溶于溶液中的化合物，也可能是只在溶液中单独存在 的离子，如染液中分散的色素粒子进入被染物质的间 隙内，由于分子的引力作用，色素粒子被吸附而染色。
三、染色术语的概念
（一）普通染色
染色）。 （二）特殊染色 特殊染色就是为了显示特定的组织结 构或其他的特殊成分，是常规染色的必要补充，也是
二、特染注意事项 1、染色方法的成败，应该在温度、浓度、时间和PH值等 方面找原因。
2、注意特染的应用范围，如某种病变应用什么方法染色才
能达到目的，一般先在HE切片所见的要求去选择适当的特 染方法，一种或多种。 3、必须掌握各种特殊染色的结果，避免导致错误的结论或 严重的误诊，如在网染时把胶原纤维误以为网状纤维。
三、常用的特染
（一）胶原纤维染色（VG 染色）
1、胶原纤维的分布、组成成分
胶原纤维是结缔组织中的三种纤维之一，分布最 为广泛，含量最多。主要分布于真皮、腱、韧带、骨、 透明软骨、动脉、肠壁、子宫和基底膜等。胶原纤维 具有韧性大，抗拉力强的特点。胶原纤维主要由纤维
母细胞合成。
2、胶原纤维染色应用 胶原纤维染色在病理诊断上主要用于鉴定梭形、 纤维形细胞肿瘤的组织来源；常常要在纤维、平滑肌 和神经三者之中作出选择。还能使用于其他的情况下， 如观察动脉硬化的心脏，在HE切片中，心肌内散在的 小疤痕灶和心肌均被染作红色，而作胶原纤维染色可 将胶原组织和心肌明显地区分开来。早期肝硬化用胶 原纤维染色，也可使小叶之间少量增生的胶原纤维突 出地显示出来。
在组织制片技术中，常规制片最广
泛应用的是苏木精和伊红染色，又称为常规染色（HE
染色技术中不可缺少的部分。它在病理诊断中起到辅
助作用。
（三）单一染色 选用一种染料进行的染色，如用铁
苏木素染睾丸生精细胞等。 （四）复染色 用两种不同性质的染料进行染色的方 法，如用苏木素和伊红分别使细胞核及胞质染成两种 颜色。
（二）染色后的处理
1、染色后的脱水 2、染色后的透明
（三）染色封固剂 组织制片需随时检查和保存，故要有盖玻 片封固。通常用中性树胶，此封固剂质量稳定， 已普遍应用。
常 规 染 色 技 术
常规染色即苏木精-伊红染色（Haematoxylin and eosin，HE）是病理技术中最常用的一种方法。 HE染色在医学领域中的组织学、生物学、病理学 及其细胞检查中，是必不可少的最基本染色方法。
(二) 染色的物理作用 1. 毛细作用及渗透作用 组织有许多小孔，染料 因渗透作用进入组织，它与组织没有牢固的结合， 所以是单纯的物理作用，不能称为直接染色作用。 因所谓染色必需是染料留贮于组织内与组织有较稳 固的结合。
2. 吸收或溶液作用 组织吸收染料，作牢固的结合， 组织的着色与溶液颜色相同，但不是和干燥染料的颜 色相同。如复红溶液为红色，所染组织也为红色，而 干燥的复红带绿色。
4、尽量要阳性切片作对照，便于选择特染方法，并与HE
切片作对照。
5、特染的组织，在其固定、脱水时所用的器皿都必须化 学清洗。
（1）新购玻璃器皿：应先用洗衣粉浸泡洗刷，自来水冲洗后再用 1—2%盐酸水溶液浸泡数小时后，用自来水冲洗干净，必要时可用 少量蒸馏水洗2次。 （2）每次使用后的玻璃器皿都必须及时彻底清洗干净，以供下次 实验之用，如轻视这一步骤，可用的玻璃器皿不够干净，则会影响 染色效果，甚至导致染色失败，特别在酶组化和银离子反应操作过