组织化学技术
组织化学技术5免疫组化
Ab滴片技术 —— 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。 ［注意］ 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能 干片。 要领：甩净组织周围的水。 4．PBS洗涤技术 （1）洗涤的目的 ①保证离子浓度和PH值。 ②减少非特异反应（平时Ab不可靠很纯）
Ab滴片图示：
方法：洗三次，每次5分钟。 Ab孵育技术 必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。
02
应用：特别适用于含抗原量较少的组织。
03
包埋后染色：
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组织标本经过固定脱水及树脂包埋、制
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成超薄切片后，再进行免疫组化染 色。由
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于是以贴在网上的超薄切片进行免疫染色，
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故又称载网染色（on grid staining ）。
优点： ① Ultrastructure 保存良好。 超薄切片易穿透，可标记细胞任何 部位。 方法简便，（+）结果高度可重复性。 同一张切片上可进行多重免疫染色。 缺点： ① 抗原活性可能减弱或消失。 树脂中的组织不易进行免疫反应。
2
液，室温5~30分钟，随时镜检（DAB用时
3
新配）
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自来水洗净。
5
用Mayer 苏木精或0.5％甲基绿，复染胞
6
核（可不染）。
7
常规脱水、透明、封固、镜检。
8
结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。
9
（四）免疫组化染色基本技术及注意事项 1．实验计划 ① 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。 如Ab—I鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则 不能用其他动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若 PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。 ② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差 异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否 则无可比性。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术第一篇：免疫组织化学技术基础免疫组织化学技术是一种利用免疫学原理对细胞或组织进行化学定位的技术。
该技术可以用于鉴定细胞或组织中某种特定抗原的存在及分布情况，从而为病理诊断、学术研究和药物研发等提供有力的支持。
一、免疫组织化学技术的原理免疫组织化学技术的原理是利用抗体与其靶分子间的特异性结合反应，来实现对目标物的检测和定位。
抗体可以识别并结合到人体或动物体内的大部分蛋白质，包括生物芯片检测、ELISA检测、Western blotting等技术所用的基质和抗原。
在免疫组织化学技术中，针对某种抗原的特异性抗体先与组织样本中的特异性抗原发生特异性结合，然后通过检测抗体所标识的色素或荧光物等发射的信号，加以可视化。
例如，用特异性抗体和明胶酶-抗明胶酶复合物在组织样本上进行化学染色，从而定位并可视化样本中的抗原。
二、免疫组织化学技术的步骤1. 样本制备：第一步是样本的制备，包括切片、固定和脱水等处理。
固定组织样本是为了保持其形态和结构，因此往往使用福尔马林等固定剂进行固定。
在制片时，细胞或组织切割成相对较薄的切片，一般为5-10 μm。
切割后，通常漂洗去除固定剂，然后脱水，通常采用乙醇浓度逐渐递增的方法进行。
最后，将切片放置于有机媒介中，如去石蜡等。
2. 抗原修复：切片离体后，抗原结构可能会发生改变，因此需要进行抗原修复。
抗原修复可以通过热处理、酶解或酸解等方式进行。
热处理方法包括水浴、压力釜等；酶解包括蛋白酶和肝素酶等；而酸解则是利用酸将组织溶解并解离抗原。
3. 抗体标记：抗体标记是免疫组织化学技术的核心步骤。
选择具体的抗体，可以选择单克隆或多克隆抗体等。
接着，抗体常被标记为一种检测信号(如与酶或荧光物质结合)。
免疫荧光技术通常是通过荧光标记的二抗或荧光标记的可溶解复合物来可视化。
荧光地染色颜色有多种不同的方式，如荧光素-醌染料、荧光素-异硫氰酸染料等，可以根据不同的研究目的选择不同的荧光染色方法。
组织化学技术6-原位杂交
3．杂交（Hybridization ）—ISHH的 关键
杂交是将染液滴于，加盖盖玻片（防止高温蒸发） 盖玻片周围处理： ① 加液体石蜡封固（注意，易污染） ② 橡皮泥封固（清洁） ★ 杂交液—含有标记的探针和硫酸葡聚糖 （配方查工具书）。 ★ 硬塑料盒（盛少量5×SSC或2×SSC）→ 确保载玻湿度。
※ 探针的类型
1）按标记物 ① 放射性探针 ② 非放射性探针
2）按核酸性质
① ② ③ ④
DNA探针 RNA探针 cDNA探针 寡核苷酸探针
（三）原位杂交组织化学技术的基本方法 由于核酸探针的种类和标记物的不同， 故具体应用技术方法上有差异，但基方 法和应用原则大致相同。大致可分为： ① 杂交前准备 a 固定 b 取材 c 玻片和组织处理 d 增强核酸探针穿透性 e 减低背景
4. 杂交后处理（post hybridization treatment）
—— 不同温度的盐溶液的冲洗
5.显示（Visualization） （1）原则 ：根据核酸探针标记物的种类 分别进行放射自显影或利用 酶检系统进行不同显色处理 （2）半定量的测量 1）放射自显影 a） 人工检测银粒的数量和分布差异 b ） 图象分析仪
冲洗条件：
1） 低严格度 Tm—35℃～ Tm—40℃ 高 盐或低甲酰浓度。 2）中严格度Tm—20℃～Tm—40℃。 3）高严格度Tm—10℃～ Tm—15℃低盐和 高甲酰浓度。
（6）硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）和 甲酰胺 1）硫酸葡聚糖：促进杂交率等 2）甲酰胺：调节杂交反应温度
优点：完全、方便、省时，敏感性和质 量控制较好，可检测人基因组DNA的单拷贝基因，背景反差好。 1991年 Couton建立将非放射性标记技术 更多为亲和复合物标记技术 （Affinity-complex Labelled Probes， ACLP）。 发展趋势：实验室常规技术和临床日常应 用的诊断技术。
细胞(组织)化学和免疫化学染色技术
细胞（组织）化学和免疫化学染色技术细胞化学（cytochemistry）或组织化学（histochemistry），是细胞学（cytology）或组织学与生物化学（biochemistry）相结合的一门科学。
细胞化学染色（cytochemical staining）是在血细胞的原位上研究其化学成分的性质，包括蛋白、脂类、糖类、无机盐和酶等，在保持细胞形态的基础上进行化学的定位、定性及半定量的观察，是血液病形态学诊断中的一个重要手段。
细胞免疫化学（immunocytochemistry）又称免疫细胞化学或免疫组织化学（immunohistochemistry）染色，是鉴定某些细胞或组织的病态细胞（如微小巨核细胞）和白血病的重要的辅助性检验技术。
一、涂片细胞化学和免疫化学染色技术（一）细胞化学染色1.铁染色正常骨髓中存在一定量的贮存铁，以含铁血黄素的形式贮存，多分布在巨噬细胞内，称为贮存铁。
骨髓中幼红和晚幼红细胞含有铁颗粒，为细胞内铁，含内铁的细胞称为“铁粒幼细胞”，少数成熟红细胞也含有小的铁颗粒，称为“铁粒红细胞”。
以上铁质均可用普鲁士蓝反应加以显示。
（1）原理：骨髓内含铁血黄素的铁离子和幼红细胞内的铁颗粒，在盐酸环境下与亚铁氰化钾作用，生成蓝色的亚铁氰化铁沉淀（普鲁士蓝反应），定位于含铁粒的部位。
（2）试剂：铁染色液（临用时配制）：200g/L亚铁氰化钾溶液5份加浓盐酸1份混合；复染液：1g/L沙黄溶液。
（3）操作：取新鲜含骨髓小粒的骨髓涂片，于铁染色架上，滴满铁染色液；室温下染色30分钟，流水冲洗，复染液复染30秒；流水冲洗，晾干后镜检。
（4）结果判定1）细胞外铁：细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小珠状或团块状，细胞外铁主要存在巨噬细胞胞质内，有时也见于巨噬细胞外。
“-”为涂片骨髓小粒全无蓝色反应；“+”为骨髓小粒呈浅蓝色反应或偶见少许蓝染的铁小珠；“++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的片状或弥散性阳性物；“+++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的密集小块或成片状；“++++”为骨髓小粒铁粒极多，密集成片。
组织化学技术教程PPT课件
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案例一：乳腺癌组织化学染色分析
总结词
乳腺癌组织化学染色分析是研究乳腺癌的重要手段， 通过染色技术观察癌细胞形态和组织结构变化，有助 于诊断和预后评估。
详细描述
乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，组织化学染色分析可 以帮助医生了解癌细胞的分化程度、恶性程度以及转 移情况。在染色过程中，常用的染色方法包括HE染色 、免疫组化染色和特殊染色等。通过观察癌细胞核增 大、核沟、核沟蛋自质等特征，可以判断癌细胞的恶 性程度和分化程度。此外，组织化学染色还可以用于 检测癌细胞转移和浸润的情况，为临床治疗提供依据 。
组织化学技术教程
目录
• 组织化学技术概述 • 组织化学技术的基本原理 • 组织化学技术的实际应用 • 组织化学技术的挑战与未来发展 • 案例分析
01 组织化学技术概述
定义与特点
定义
组织化学技术是一种利用化学反应来 检测组织或细胞内特定化学物质的方 法。
特点
高灵敏度、高特异性、可定量分析、 可定位分析等。
20世纪初
随着新技术的不断涌现，组织 化学技术得到迅速发展，并逐 渐应用于医学领域。
20世纪中叶
随着免疫组织化学和原位杂交 技术的出现，组织化学技术进 入了一个新的发展阶段。
21世纪
随着Байду номын сангаас白质组学和基因组学研究 的深入，组织化学技术在生命科
学领域的应用越来越广泛。
02 组织化学技术的基本原理
组织样本的获取
解决方案
针对这些挑战，可以采取优化实验条件、改进抗体标记技术、发展新型荧光染料 和探针等措施，提高检测的灵敏度和特异性。同时，加强样本处理和数据分析方 法的研究，提高实验结果的可靠性和可重复性。
免疫组织化学技术的特点
免疫组织化学技术的特点免疫组织化学技术是一种在生物学和医学领域中广泛应用的重要方法，它能够在细胞和组织水平上对特定蛋白质、抗原等生物分子进行定位、定性和定量分析。
这项技术具有许多独特的特点，为疾病的诊断、治疗和科学研究提供了有力的支持。
一、高特异性免疫组织化学技术的核心在于抗体与抗原的特异性结合。
所使用的抗体是针对特定抗原表位设计和制备的，因此能够高度特异性地识别和结合目标抗原。
这意味着在复杂的细胞和组织环境中，该技术可以准确地检测到我们感兴趣的特定分子，而不会与其他相似或无关的分子发生交叉反应。
这种特异性使得免疫组织化学能够在细胞和组织中精准地定位特定的蛋白质、激素、受体等生物标志物，为疾病的诊断和研究提供准确的信息。
例如，在肿瘤诊断中，通过使用针对肿瘤特异性抗原的抗体，可以明确肿瘤细胞的来源和类型，区分良性和恶性肿瘤，以及确定肿瘤的分化程度和侵袭性。
对于神经退行性疾病，如阿尔茨海默病，特定的抗体可以检测到大脑组织中异常积累的蛋白质，如β淀粉样蛋白和tau 蛋白，为疾病的诊断和研究提供重要依据。
二、高灵敏度免疫组织化学技术具有很高的检测灵敏度。
即使目标抗原在样本中的含量很低，通过适当的抗体标记和检测方法，也能够被检测到。
这对于检测微量的生物分子，尤其是在疾病早期或病理变化轻微的情况下，具有重要意义。
现代免疫组织化学技术不断发展和改进，采用了更加灵敏的检测系统，如增强化学发光法、荧光染料标记等，能够进一步提高检测的灵敏度。
同时，优化的样本处理和抗原修复方法也有助于充分暴露抗原，提高检测的准确性和灵敏度。
在临床实践中，高灵敏度的免疫组织化学技术可以帮助早期发现肿瘤的微小转移灶，监测疾病的进展和治疗效果。
在科研领域，它能够检测到细胞内低丰度的蛋白质表达变化，揭示生命活动中的细微调节机制。
三、定位准确免疫组织化学技术能够在细胞和组织的微观结构中准确地定位目标抗原。
通过将抗体与显色剂或荧光标记物结合，可以直观地观察到抗原在细胞内的分布位置，如细胞核、细胞质、细胞膜等。
免疫组织化学技术名词解释
免疫组织化学技术名词解释免疫组织化学技术是一种应用于组织学研究和病理诊断中的实验技术，用于检测和定位特定抗原在组织中的表达和分布。
免疫组织化学技术结合了免疫学和组织学的原理和方法，使得我们能够在组织切片中检测到特定抗原，并通过染色的方式将其可视化。
1. 免疫染色：免疫组织化学技术的核心是免疫染色。
免疫染色是通过将特异性的抗体与待检测物质结合，并标记上染色物质，从而实现对抗原的检测和定位。
常用的染色物质包括标记着色剂如酶、荧光物质和金颗粒等。
2. 抗原：抗原是一类能够诱导机体产生抗体的物质。
在免疫组织化学技术中，抗原可以是蛋白质、多肽或者是其他小分子化合物。
通过特异性的抗体和抗原的结合来实现对抗原的检测和定位。
3. 抗体：抗体是机体特异性免疫应答产生的一类蛋白质分子。
抗体能够与特定抗原结合，并通过诱导免疫反应来清除抗原。
在免疫组织化学技术中，通过标记抗体对待检测抗原进行检测和定位。
4. 免疫组织化学染色法：免疫组织化学染色法是一种检测并定位抗原的方法。
根据标记抗体的不同，可以分为酶标法、免疫荧光染色法和免疫金染色法等。
其中，酶标法是最常用的方法之一，通过将酶标记的抗体与待检测抗原结合，然后通过酶的催化作用使染色物质可视化。
5. 免疫组织化学实验步骤：免疫组织化学技术包括多个实验步骤，一般包括组织固定、切片、抗原恢复、阻断、一抗和二抗结合、洗涤、染色和显微镜观察等。
每个步骤都需要严格的操作和控制条件，以保证实验的可靠性和准确性。
6. 免疫组织化学应用：免疫组织化学技术广泛应用于医学研究和病理诊断中。
在医学研究领域，免疫组织化学技术可以用于研究疾病的发生和发展机制、寻找新的生物标志物以及评估药物的疗效等。
在病理诊断中，免疫组织化学技术可以用于帮助确定肿瘤类型、检测特定蛋白的异常表达以及判断预后等。
7. 免疫组织化学技术的优点和局限性：免疫组织化学技术具有高度的特异性和灵敏度，可以实现对细胞和组织水平上抗原的定量和定位。
组织化学技术教程
组织化学发展到今天，它的技术多 而复杂，但基本技术是容易掌握的。从 样品的取材、固定剂的选择、切片的制 备、孵育反应、各种溶液的配制以及光 镜组织化学技术和电镜组织化学技术等， 每项技术都有明确的要求和规范的操作 程序。进行没项工作，应事先做好准备， 按技术程序进行，可做一定的预备实验， 效果稳定后，再开始实验研究，这样才 能达到预期的科研效果。
⑹ 样品大小适当，光镜样品一般在1.0cm以内， 免疫组织化学样品大约在 : 2cm×1.5cm×0.3cm[厚度控制在0.3cm]。 cm3小块。
二、 固定
1．固定的目的要求 固定是将组织尽可能保持原有生活状态以 适用于某些研究程序的一种方法。固定有 如下几方面的目的。 ⑴ 不仅保持组织生前的形态结构，还要保持
⑶ 灌流故定法
灌流故定法是通过血管的途径，将固定 液灌注到所要固定的器官组织内，将生活的 细胞在原位及时的固定后，在摘取样品的方 法。这种方法的特点是：快速、固定充分， 但是对固定液的温度、压力及取材时间有严 格的要求。
⑷ 培养细胞和外周血细胞固定法
培养细胞核外周血细胞的固定方法比较 特殊，对培养细胞通常取盖片入37℃的 Hanks液中，漂洗两次(每次3—5min)，洗除 血清后，再置于甲醛缓冲固定液内10— 30min。.如果进行电镜观察就以2%戊二醛 固定或采取双重固定法。
60℃＝1h ；石蜡Ⅱ（60℃）2 h。
⑹ 包埋：铁板架包埋或其他容器，有时要求快 速冷却。
⑺ 切片和贴片：在切片机上切片，置水槽中展 片、捞片和贴片。
⑻ 染色 ——HE染色 步骤： 1） 二甲苯5～10分钟，脱去切片中的石蜡。 2）降浓度梯度酒精脱水
（100%→95%→90%→80%→70%）。 每级脱水2～3分钟以除二甲苯。
免疫组织化学
免疫组织化学免疫组织学是研究细胞、组织和器官在发生免疫反应时所发生的化学变化的科学。
通过采用组织化学和免疫组织化学技术可以观察和研究免疫系统中各个细胞分子、细胞膜和细胞内物质在免疫反应中的变化情况，从而了解和诊断疾病。
一、组织化学技术1.石蜡切片技术石蜡切片技术是通过对组织进行处理后包埋在石蜡中，再将石蜡切片来观察组织状态的技术。
这种技术可以非常清晰地显示细胞和细胞膜，同时被用于对组织进行染色和特定化学分析。
2.冻切片技术冻切片技术是将组织冷冻并且快速切片来观察组织状态的一种技术。
这种技术用于光镜下检测细胞活性和免疫反应时的病理学变化以及细胞的病态化变化。
3.光镜检查光镜检查是针对石蜡切片和冻切片进行的检查，对病理学变化等细节进行更加细致的观察。
二、免疫组织化学技术1.免疫荧光技术免疫荧光技术是通过对组织中某些成分进行标记，利用特定的荧光染料来显示出细胞、分子及其他细节结构的技术。
这种技术主要用于开展多种体外免疫试验。
2.酶标记技术酶标记技术也称为酶免疫分析技术或酶联免疫试验技术，利用酶或其他分子标记的抗体来对组织进行特定分析的技术。
这种技术可以应用于抗体定性、半定量和全定量测定。
三、应用通过免疫组织化学技术，可以对各种组织进行检查。
例如，可以用来检查肿瘤细胞，对具体癌细胞和癌细胞分子进行定位和识别。
除此之外，免疫组织化学技术还可以用于疾病的诊断和治疗。
例如，对于免疫性关节炎，可以通过对炎症反应区域进行研究发现疾病过程中先后发生的变化，从而掌握疾病过程，为提高治疗效果提供依据。
同时，通过免疫组织化学技术可以对新的治疗方法进行评估。
例如，对药物的抑制和消灭癌细胞和癌细胞分子进行研究，有助于设计合适的治疗方案。
总之，免疫组织化学技术是一种非常强大的工具，能够帮助人们更好地理解生物学、医学等领域的疾病过程，并且有助于评估治疗方案和开发新药物。
免疫组织化学技术的特点
免疫组织化学技术的特点免疫组织化学技术（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究方法。
这一技术在生物学、医学等领域发挥着重要作用，具有诸多显著的特点。
首先，免疫组织化学技术具有高度的特异性。
这是因为抗体与抗原的结合是高度特异性的，就像一把钥匙开一把锁。
每种抗体只会与特定的抗原结合，从而能够准确地识别和定位目标分子。
例如，在肿瘤诊断中，针对特定肿瘤标志物的抗体能够精确地识别肿瘤细胞中相应的抗原，帮助医生判断肿瘤的类型和分期。
这种特异性使得免疫组织化学技术能够在复杂的组织环境中准确地检测到目标分子，减少了假阳性和假阴性结果的出现。
其次，免疫组织化学技术具有较高的敏感性。
即使目标抗原在组织中的含量很低，通过使用高亲和力的抗体和灵敏的检测系统，也能够被检测到。
这对于早期疾病的诊断和微量生物标志物的检测尤为重要。
例如，在某些神经退行性疾病的早期阶段，相关蛋白的表达水平可能仅有轻微的变化，但免疫组织化学技术能够敏锐地捕捉到这些细微的变化，为疾病的早期诊断提供依据。
再者，免疫组织化学技术能够实现原位检测。
这意味着可以在组织细胞的原有位置上观察抗原的分布和定位。
相比于其他一些检测方法需要将组织细胞破碎提取成分进行分析，原位检测能够更好地保留组织的形态结构和细胞之间的关系。
这对于研究细胞的功能、细胞之间的相互作用以及疾病的病理机制具有重要意义。
比如，在研究肾脏疾病时，可以通过免疫组织化学技术观察特定蛋白在肾小球、肾小管等部位的分布情况，从而深入了解疾病对肾脏结构和功能的影响。
此外，免疫组织化学技术还具有多标记能力。
可以同时使用多种不同的抗体标记不同的抗原，从而在同一张切片上同时检测多个目标分子。
这有助于更全面地了解组织细胞的生理和病理状态。
例如，在研究肿瘤微环境时，可以同时标记肿瘤细胞标志物、免疫细胞标志物以及细胞外基质成分，从而综合分析肿瘤与周围微环境的相互作用。
组织化学与细胞化学技术
（一）直接法
是以荧光标记抗体直接与被检标本内的抗原反应。 依据荧光出现的位置及强弱对被检细胞做出判别。该法的 优点为简单特异。但其缺点也很明显即敏感性较低另需制 备大量特异性的荧光抗体。
（二）间接法
间接法采用抗球蛋白试验原理，先制成荧光素标记抗抗 体。检测中先将特异性抗体与被检标本作用一定的时间 后，充分洗去未结合的游离特异性抗体，然后添加荧光素 标记抗抗体使之形成被检抗原－抗体－荧光素标记抗抗体 复合物，由此显示特异荧光并因复合物上带有较多荧光 标志物，所以其敏感性比直接法要高。
neutrophil alkaline phosphatase ,(NAP)
1.原理
细胞内碱性磷酸酶在碱性环境下水解磷酸萘酚，使 之释放出萘酚，后者与重氮盐偶联形成有色沉淀物。 定位于酶活性所在处。
2.参考范围 ：
中性粒细胞碱性磷酸酶活力正常范围2%～56%, 积分 4～80 分 /100个中性粒细胞
组织化学技术: 应用化学、物理、生物化学、免疫学或分子生物
学的原理和技术与组织学相结合而产生的技术，能在 组织切片定性、定位地显示某种物质的存在与否以及 分布状态。还可进一步用显微分光光度计或图象分析 仪测定光镜切片中该物质反应的强度，获得定量的信 息。
细胞化学技术: 应用组织化学技术于游离细胞的样品(如细胞涂 片)，则称细胞化学技术。
一 组织细胞化学染色
组织细胞化学染色是将形态和功能相结合的细胞科 学。它是在保持完整的细胞形态和细胞结构的前提下, 运用化学反应将被检细胞内的各类化学成分和细胞结构 及生理活性物质原位地显示。因而对于探索化学成分、 生理功能、新陈代谢及细胞生理和病理改变有着重要的 意义。
组织细胞染色的范围一般可分为：蛋白质类（氨基 酸)、核酸类、多糖类、脂类、盐类或金属类，采用的 方法通常为化学结合物理溶解显示及酶-底物反应。
组织化学技术的基本要求
组织化学技术的基本要求一、组织材料的要求。
1. 新鲜性。
这就好比做菜，材料得新鲜。
组织要是不新鲜，里面的化学成分可能就变了。
就像刚摘的苹果和放了好久有点烂的苹果，肯定不一样。
对于组织化学来说，新鲜的组织能更好地反映出原本的化学物质状态。
要是组织放太久，细胞可能都死翘翘了，里面的酶呀、蛋白质呀之类的物质可能就分解或者变性了，那做出来的结果就不准确啦。
2. 完整性。
组织得完整，不能是缺胳膊少腿的。
比如说你要研究一个器官的组织化学，要是取组织的时候把一部分弄丢了，那就像拼图少了几块，得到的结果就不是整个器官的真实情况了。
而且如果组织被破坏了，细胞结构乱七八糟的，那化学反应在这个组织里就没法正常进行了，就像在一个到处是坑洼的马路上开车，肯定不顺畅呀。
3. 代表性。
这个组织得能代表你要研究的东西。
比如说你想知道整个人肝脏的组织化学情况，你不能就取肝脏边缘的一点点组织，那可能和肝脏中心部分的组织化学特征不一样呢。
得选取能反映整个肝脏特性的部分，就像你要了解一个班级的学习情况，不能只问成绩最好的一个同学，得问不同层次的同学才能有代表性一样。
二、试剂的要求。
1. 纯度。
试剂纯度就像人的品德一样，越纯越好。
如果试剂里混了很多杂质，那就像在一群好人里混进了几个坏蛋。
这些杂质可能会干扰化学反应，本来你想让试剂和组织里的某种物质发生特定反应，结果杂质先和试剂反应了，或者和组织里的物质发生了其他反应，那你得到的结果就全乱套了。
就像你本来要给朋友送一束玫瑰表达爱意，结果中间混了一把杂草，那就不是那个意思了。
2. 特异性。
试剂得有特异性，就是说它要像一把专门开某一把锁的钥匙。
比如说你要检测组织里的一种特定的酶，那试剂就得只和这种酶反应，不能和其他类似的酶或者物质瞎反应。
如果试剂特异性不强，就像一把万能钥匙，到处能开点锁，那你就搞不清楚到底是和你要检测的物质反应了，还是和其他东西反应了，结果就不可靠了。
三、操作技术的要求。
1. 准确性。
组织化学技术
组织化学技术组织化学技术篇一：组织化学组织与细胞化学一、填空题：体视学里是主要的填空题。
二、名词解释1、异染现象染料离子以某种方式使它对所吸收的波长有所改变，因而观察到被染的组织显示与该染料本身颜色不一样，此现象为异染现象。
2、诱发荧光和自发荧光诱发荧光：自发荧光：由于紫外线的照射，标本中的荧光物质吸收光能后，呈现出不同颜色的荧光，这是自发荧光。
3、原位杂交组织化学和免疫组织化学原位杂交组织化学（In situ hybridization histochemistry，ISHH）是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统通过组织化学或免疫组织化学在核酸原有的位置进行细胞内定位。
免疫组织化学（immunohistochemistry）: 将化学反应中呈色反应与免疫学抗原抗体反应结合起来，用标记的特异性抗体（或抗原）对细胞及组织内抗原（或抗体）的分布进行组织或细胞内原位检测的一门技术。
4、点计数（P116）估计面积和面积分数的方法，称为点计数。
5、形态计量术形态计量术(morphometry)是运用数学和统计学原理对组织和细胞内各种成分的数量、体积、表面积等的相对值与绝对值的测量,其中以研究组织和细胞内某种结构的三维立体结构的研究称体视学(sterology)。
6、DAB系统7、各向同性和各向异性指物体的物理、化学等方面的性质不会因方向的不同而有所变化的特性，即某一物体在不同的方向所测得的性能数值完全相同。
材料在各方向的力学和物理性能呈现差异的特性。
8、饲养细胞在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞(Feeder cell)。
9、完全抗原、半抗原和不完全抗原完全抗原:兼有免疫原性和反应原性的物质称完全抗原。
大多数蛋白质是良好的完全抗原。
半抗原:只有反应原性而无免疫原性的物质称半抗原或不完全抗原，绝大多数低分子量的多糖和所有的类脂均属半抗原。
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组织化学技术切片染色方法可以显示不同细胞和组织形态，以及细胞和组织中某些化学成分含量的变化。
一、染色的目的任何冰冻切片、石蜡切片等如果不经过染色，在显微镜下只能看到细胞及其它组织成分的轮廓，即使由于组织内部各种物质的折射指数不同，从光线的明暗上能观察到一些组织结构，但也是极其简单有限的，远不能满足观察和借以诊断的目的。
染色的目的，是将染料配制成溶液，将组织切片浸入染色剂内，经过一定的时间，使组织或细胞及其他异常的成分染上不同深浅的颜色，产生不同的折射率，便于在光学显微镜下进行观察。
因此，染色在组织形态学，特别是病理形态诊断、科研和教学工作中，都具有非常重要的意义和实用价值。
二、染色的原理染色就是染色剂和组织细胞相结合的过程。
有关两者结合的原理，有不同的学说，一般认为其过程是化学反应和物理现象。
（一）染色的化学反应在组织细胞内，一般有酸性和碱性区别，酸性物质部分能与溶液中的阳离子结合，碱性物质部分能与溶液中的阴离子结合。
在细胞核中，特别是核内染色质，一般有酸性物质组成（其中主要有核酸），故与碱性染料的亲和力很强，易于染色，以氧化苏木素代表的碱性染料中有染色作用的是阳离子。
在细胞浆中则由碱性物质组成，所以胞浆与酸性染料有较强的亲和力，以伊红染料为代表的酸性染料中有染色作用的是阴离子。
(二) 染色的物理作用1. 毛细作用及渗透作用组织有许多小孔，染料因渗透作用进入组织，它与组织没有牢固的结合，所以是单纯的物理作用，不能称为直接染色作用。
因所谓染色必需是染料留贮于组织内与组织有较稳固的结合。
2. 吸收或溶液作用组织吸收染料，作牢固的结合，组织的着色与溶液颜色相同，但不是和干燥染料的颜色相同。
如复红溶液为红色，所染组织也为红色，而干燥的复红带绿色。
3. 吸附作用吸附作用是固体物理的特性，它能从周围溶液中吸住一些细小的物质微粒，这些微粒可能是溶于溶液中的化合物，也可能是只在溶液中单独存在的离子，如染液中分散的色素粒子进入被染物质的间隙内，由于分子的引力作用，色素粒子被吸附而染色。
三、染色术语的概念（一）普通染色在组织制片技术中，常规制片最广泛应用的是苏木精和伊红染色，又称为常规染色（HE 染色）。
（二）特殊染色特殊染色就是为了显示特定的组织结构或其他的特殊成分，是常规染色的必要补充，也是染色技术中不可缺少的部分。
它在病理诊断中起到辅助作用。
（三）单一染色选用一种染料进行的染色，如用铁苏木素染睾丸生精细胞等。
（四）复染色用两种不同性质的染料进行染色的方法，如用苏木素和伊红分别使细胞核及胞质染成两种颜色。
（五）多种染色选用两种以上的染料的染色，如Masson三色染色法。
胶原纤维呈蓝色，肌纤维胞质呈红色，细胞核呈蓝褐色。
（六）进行性染色：又称渐进性染色，将组织成分着色自浅至深，当达到所需要的强度时，终止染色。
一般所采用的染液溶度较低，染色过程中应该不时在镜下观察进行控制，这样才能得到染色强度适中的效果。
退行性染色：又称退性染色，先将组织浓染过度，使其超过所需的程度，然后再用某些溶液脱去多余的染色剂，以达到适当的深度，并使不应着色的组织、细胞的某些成分脱去色度，这个步骤称为“分化”。
而最终使应该着色部分达到适宜程度。
如常规HE染色中的苏木素染核与盐酸水分化过程就是退行性染色。
（一）染色前的处理：1、脱蜡至水凡是石蜡切片必须经过二甲苯脱蜡，各级乙醇至水洗的过程。
2、除去汞盐沉淀物对于用升汞固定或含有升汞混合固定液的切片，切片脱蜡后需脱汞处理。
4、脱甲醛色素甲醛固定组织时间较长及温度较高情况下，甲醛易氧化自行分解产生甲酸，导致组织成酸性，此时可能有甲醛色素产生。
此种色素无光泽，不溶于水、乙醇、二甲苯等。
（二）染色后的处理1、染色后的脱水2、染色后的透明（三）染色封固剂组织制片需随时检查和保存，故要有盖玻片封固。
通常用中性树胶，此封固剂质量稳定，已普遍应用。
常规染色技术常规染色即苏木精-伊红染色（Haematoxylin and eosin，HE）是病理技术中最常用的一种方法。
✓HE染色在医学领域中的组织学、生物学、病理学及其细胞检查中，是必不可少的最基本染色方法。
✓在病理诊断（活检）、教学、科研工作中都被广泛应用，对细胞学的观察也具有重要价值。
✓HE染色主要显示各种组织正常成份和病变的一般形态结构，病理组织学的基本知识大部分都是从观察HE染色切片中获得的。
(1)先将20 g伊红Y溶于500 ml蒸馏水中，用玻棒搅拌至其完全溶解后再加入1000 ml蒸馏水并搅匀，液体呈深红色。
(2)加入500 ml 95％乙醇并搅匀，此时液体由深红色转变为荧光绿色。
(3)加入1ml冰乙酸并搅匀，密封瓶口室温储存备用。
HE染色分化液：0.5％盐酸乙醇液：蒸馏水300 ml与95％乙醇700 ml混合后加入浓盐酸5 ml混匀。
HE染色返蓝液：0.5％氢氧化氨液：在1000毫升蒸馏水中溶入5毫升浓氢氧化氨混匀。
HE 染色法程序自动染色机1 水洗5s；2 苏木精染色2min；（新鲜）3 水洗5s；4 分化0.1%HCl酒精分化1～2s （至变红）；5 水洗5s蓝化；6 伊红染色20s ；7 水洗5s；8 95%乙醇Ⅰ35s；95%乙醇Ⅱ35s；100%乙醇Ⅰ35s；100%乙醇Ⅱ35s；9 透明二甲苯Ⅰ5s；二甲苯Ⅱ5s；10 封片中性树胶封片。
80：思考题HE染色法的程序如何? 请简要说明。
特殊染色技术一、特殊染色的概念及意义为了显示组织或细胞中的正常结构或病理过程中出现的异常物质、病变、病原体等，需要选用相应的显示这些成分的染色方法进行染色，这是常规染色不能显示的，故称特殊染色。
特殊染色为常规染色（即苏木素、伊红）的必要补充，又称选择性染色，只有相对的特异性。
意义：（1）特染能显示在常规染色切片中不明显的部分，如革兰氏染色、细菌染色。
（2）区别HE染色中不能鉴别的组织病变，如VG染色区别胶原纤维和平滑肌。
（3）显示某些常规染色中不能着色的物质，如网染才能显示网状纤维，常规HE染色是染不出来的。
因此，特殊染色也是制片染色中不可缺少的组成部分，它在病理诊断常着辅助作用，也为科研提供依据。
二、特染注意事项1、染色方法的成败，应该在温度、浓度、时间和PH值等方面找原因。
2、注意特染的应用范围，如某种病变应用什么方法染色才能达到目的，一般先在HE切片所见的要求去选择适当的特染方法，一种或多种。
3、必须掌握各种特殊染色的结果，避免导致错误的结论或严重的误诊，如在网染时把胶原纤维误以为网状纤维。
4、尽量要阳性切片作对照，便于选择特染方法，并与HE 切片作对照。
5、特染的组织，在其固定、脱水时所用的器皿都必须化学清洗。
（1）新购玻璃器皿：应先用洗衣粉浸泡洗刷，自来水冲洗后再用1—2%盐酸水溶液浸泡数小时后，用自来水冲洗干净，必要时可用少量蒸馏水洗2次。
（2）每次使用后的玻璃器皿都必须及时彻底清洗干净，以供下次实验之用，如轻视这一步骤，可用的玻璃器皿不够干净，则会影响染色效果，甚至导致染色失败，特别在酶组化和银离子反应操作过程中更有严格的要求，使用后的玻璃器皿在一般清洗后，还要求用硫酸清洗液浸泡。
重铬酸钾80g自来水1000ml浓硫酸（工业用）120ml新配制的清洁液为红褐色，反复使用一段时间后，慢慢变成绿色，说明清洁液已失败，不能继续使用应重新配制。
玻璃器皿的清洗方法：①任何玻璃器皿都必须用自来水冲洗，然后把残余药液或染液洗去。
②用毛刷沾洗衣粉擦干净。
③自来水冲洗，蒸馏水洗2次。
④把晾干的器皿轻轻置入清洁液浸泡数日。
⑤取出器皿，用自来水把器皿内外彻底冲洗干净，最后用蒸馏水洗2次。
⑥把玻璃器皿倒置于有孔架上自然晾干或温箱中烤干，最后存放橱内备用。
（一）胶原纤维染色（VG 染色）1、胶原纤维的分布、组成成分胶原纤维是结缔组织中的三种纤维之一，分布最为广泛，含量最多。
主要分布于真皮、腱、韧带、骨、透明软骨、动脉、肠壁、子宫和基底膜等。
胶原纤维具有韧性大，抗拉力强的特点。
胶原纤维主要由纤维母细胞合成。
2、胶原纤维染色应用胶原纤维染色在病理诊断上主要用于鉴定梭形、纤维形细胞肿瘤的组织来源；常常要在纤维、平滑肌和神经三者之中作出选择。
还能使用于其他的情况下，如观察动脉硬化的心脏，在HE切片中，心肌内散在的小疤痕灶和心肌均被染作红色，而作胶原纤维染色可将胶原组织和心肌明显地区分开来。
早期肝硬化用胶原纤维染色，也可使小叶之间少量增生的胶原纤维突出地显示出来。
(1) Weigert铁苏木精染液甲液：苏木精1g无水乙醇100ml乙液：30％三氯化铁液4ml蒸馏水95m1纯盐酸lml甲、乙两液须分瓶盛放。
甲液配制后数天即可用，不宜配制过多，保存时间过长时染色不良，平时应密封保存。
乙液配制后立即可用。
临用前将甲、乙两液等量混合。
(2) Van Gieson染液甲液：1％酸性品红水溶液10ml 乙液：苦味酸饱和水溶液(约1．2％) 90ml 分别配制临用时加以混合，不能久用。
(3) l％盐酸-乙醇70％乙醇99ml纯盐酸1ml4、染色步骤（1）组织固定于10%甲醛液中，常规脱水包埋。
（2）组织切片脱蜡至水。
（3）用Weigert铁苏木精液染5～10min。
流水稍洗。
（4）1％盐酸－乙醇迅速分化。
流水冲洗5～10min。
（5）用Van Gieson液染1～2min。
（6）倾去染液，直接用95％乙醇分化和脱水，（7）无水乙醇脱水，用滤纸吸干。
二甲苯透明，中性树胶封固。
5、结果胶原纤维呈红色，肌纤维、胞质及红细胞黄色，胞核蓝褐色。
肝硬化增生的胶原纤维（二）网状纤维染色1、网状纤维染色的形态特点网状纤维是网状结缔组织内的一种纤维。
它由网状细胞产生，网状细胞是星状多突的细胞，核大，着色较浅，核仁明显，胞质较丰实，胞突彼此连接形成细胞网架。
网状纤维细而有分支，穿行于细胞体和突之间，共同构成网状支架。
这种纤维用HE染色一般不易辨认。
若用银氨溶液浸染能使纤维变成黑色，故又称嗜银纤维。
网状纤维的应用比较广泛，用来判定病变组织支架的破坏情况，组织、脏器网状支架的存在与塌陷、完整与破坏、网状纤维的分布及走行，有多少、粗细、疏密或有无断裂形态变化。
2、网状纤维染色的原理网状纤维的染色方法很多，但是染色原理基本相同，有以下方面。
（1）氧化氧化的作用是使网状纤维具有选择性，不经氧化的切片，网状纤维均不能较好地显示出来，常用的氧化剂是高锰酸钾。
（2）漂白一般采用2%草酸，使漂白后无色。
（3）媒染作媒染时多用2%硫酸铁氨（俗称铁明矾）。
这些试剂可增加网状纤维对银氨液的选择性。
（4）浸银也称镀银，且不同的银氨液浸染切片，使银氨配位化合物与网状纤维结合，即带正电荷的二被具有嗜银性物质的网状纤维氨合银Ag（NHs）+2吸附，时间从数秒钟到数分钟。
（5）还原甲醛液是还原剂，能把与网状纤维结合的银氨配位化合物网状纤维还原成棕黑色的金属银。