WB实验基本步骤
WB实验步骤详解
WB实验步骤详解Western blotting（简称WB）是一种常用的蛋白质检测技术，通过将蛋白质分离、转移和检测，可以用来确定特定蛋白质的存在和表达水平。
本文将详细介绍WB实验的步骤，以帮助读者了解该技术的操作流程。
1. 细胞培养和蛋白提取。
首先，需要培养细胞并收集细胞样本。
将细胞样本离心，去除培养基，然后用PBS洗涤细胞。
接下来，加入细胞裂解液并振荡离心，收集上清液，即为蛋白提取物。
2. 蛋白质浓度测定。
使用BCA或Bradford方法测定蛋白提取物的浓度，以确保后续实验中使用的蛋白质量一致。
3. SDS-PAGE凝胶电泳。
将蛋白提取物加入蛋白负载缓冲液，然后加入SDS-PAGE凝胶槽中。
进行电泳分离蛋白质，根据蛋白质大小和电荷不同，蛋白质会在凝胶中形成不同的条带。
4. 蛋白质转印。
将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到膜上，通常使用半湿式或全湿式转印。
将蛋白质从凝胶转移到膜上，使得蛋白质可以与抗体结合。
5. 阻塞。
将膜放入含有蛋白质的溶液中，如5%脱脂奶粉或蛋白质阻塞缓冲液中，阻塞非特异性结合位点。
6. 一抗孵育。
加入第一抗体，孵育过夜。
第一抗体与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。
7. 洗涤。
用TBST或PBS洗膜，去除未结合的抗体。
8. 二抗孵育。
加入HRP标记的二抗，孵育1小时。
二抗与第一抗体结合，形成复合物。
9. 洗涤。
用TBST或PBS洗膜，去除未结合的二抗。
10. 显色。
加入ECL显色液，使得膜上的蛋白质产生发光反应。
将膜放入暗室中，用X光片曝光，然后用显影液显影。
11. 图像获取和分析。
将X光片放入X光片扫描仪中，获取蛋白质条带的图像。
使用图像分析软件，如ImageJ，分析蛋白质的相对表达水平。
以上就是WB实验的详细步骤，每一步都至关重要，需要严格按照操作规程进行。
希望本文能够帮助读者更好地理解WB实验的操作流程，并在实验中取得准确、可靠的结果。
wb实验原理及步骤
wb实验原理及步骤
WB实验是WesternBlot实验的缩写，是一种常用的蛋白质检测方法。
该实验可以通过检测目标蛋白在蛋白样本中的存在和数量来确定其表达水平。
以下是WB实验的原理及步骤：
一、实验原理
WB实验基于蛋白质的电泳分离和免疫学检测。
首先将蛋白质样本通过SDS-PAGE电泳分离，然后将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接着使用一种特异性抗体与目标蛋白结合，最后通过酶标记的二抗和显色底物来检测目标蛋白。
二、实验步骤
1. 样品制备：将待检测的蛋白样本加入SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离。
2. 转移：将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
3. 阻断：将聚丙烯酰胺凝胶膜与含有蛋白质的阻断液进行接触，以防止非特异性结合。
4. 抗体反应：将目标蛋白结合的特异性抗体添加到聚丙烯酰胺凝胶膜中，并在室温下或4℃下进行孵育。
5. 二级抗体反应：添加酶标记的二级抗体，与特异性抗体结合。
6. 显色检测：加入显色底物，通过显色反应确定目标蛋白在样品中的存在和数量。
以上是WB实验的原理及步骤，该实验在生物医学研究中广泛应用，为疾病的诊断和治疗提供了有力的支持。
wb实验步骤
一、培养的贴壁动物细胞的蛋白质抽提步骤1、从贴壁细胞培养瓶中小心倾去培养液。
2、预冷的PBS清洗贴壁的细胞2次，小心倾去PBS。
3、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF和5 μl磷酸酶混合液）。
4、细胞瓶中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（107个细胞中加入1ml抽提试剂；5×106个细胞中加入0.5ml抽提试剂），轻轻摇动5分钟。
5、用一预冷的橡胶和塑料细胞刮将培养瓶壁上贴壁细胞刮下来，转移细胞悬浮液到离心管中，冰浴下摇动15分钟进行裂解。
6、裂解液于预冷的离心机中14，000xg离心15分钟。
弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。
二、培养的悬浮动物细胞的蛋白质抽提步骤1、2500xg离心10分钟沉淀悬浮的细胞，弃去上清液2、预冷的PBS悬浮沉淀细胞，2500xg离心10分钟沉淀细胞，去上清。
3、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF和5 μl磷酸酶混合液）。
4、加入含抑制剂的预冷蛋白质抽提试剂（107个细胞中加入1ml抽提试剂；5×106个细胞中加入0.5ml抽提试剂）5、轻轻摇动混和15分钟进行裂解。
6、裂解液于预冷的离心机中14，000xg离心15分钟。
弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。
三、哺乳动物组织的蛋白质抽提步骤1、组织称重，切小块放入管中。
2、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF和5ul磷酸酶混合液）。
3、加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（250mg组织中加入1ml抽提试剂）。
4、用匀浆器每次30秒低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1分钟，至组织完全裂解。
5、裂解液于预冷的离心机中14，000xg离心15分钟。
上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。
WB实验步骤
WB实验步骤WB实验是一种分离和检测蛋白质的常用实验技术。
以下是WB实验的详细步骤，共分为六个主要步骤。
步骤一：蛋白质提取1.1收集实验所需样本，例如细胞或组织。
如果是细胞样本，可以通过细胞培养离心将细胞沉淀下来。
如果是组织样本，可以通过切割及别的方法收集组织样本。
1.2加入合适的蛋白质提取缓冲液，如RIPA缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂，以保护蛋白质的完整性。
1.3震荡或旋转混合样本，使细胞或组织彻底裂解。
1.4将样本在低温下离心，以去除细胞残渣和细胞核等。
1.5收集上清液，其中含有溶解的蛋白质。
步骤二：蛋白质浓度测定2.1 使用BCA蛋白质定量试剂盒或Bradford蛋白质定量试剂盒等试剂，根据试剂盒说明书，测定蛋白质的浓度。
2.2根据蛋白质的浓度调整提取的蛋白质样本的浓度，以保证后续实验的准确性。
步骤三：SDS-电泳3.1准备一定比例的分离凝胶和浓缩凝胶。
通常使用8%-12%的聚丙烯酰胺凝胶。
3.2预运行凝胶，将上清液和蛋白质样本与蛋白负载缓冲液混合，使其达到相同的体积分数，并加入还原剂和SDS。
3.3将混合样品加载到凝胶孔中，根据需要分别加载蛋白质标准，以便确定蛋白质样品的分子量。
3.4设置合适的电泳电压，使蛋白质在凝胶中进行电泳，直至蛋白质通过凝胶前进行分离。
3.5 可以通过染料（如Coomassie blue G-250染色）或银染等方法，可视化分离的蛋白质带。
步骤四：蛋白质转移4.1准备一块聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维膜（NC）作为蛋白质的转移载体，并根据凝胶大小和所需的转移时间切割。
4.2将预运行的蛋白质凝胶和转移载体置于转移装置中，确保凝胶和载体之间没有气泡。
4.3加入冷却的转移缓冲液，确保完全润湿载体，并移除空气泡。
4.4设置合适的转移电流和时间，以将蛋白质从凝胶中转移到膜上。
4.5转移结束后，将膜从转移装置中取出，并立即进行后续处理。
步骤五：免疫检测5.1将膜与阻塞缓冲液溶液处理，以防止非特异性结合。
WB实验基本步骤
WB实验基本步骤WB实验是一种用于检测和分离目标蛋白质的常用技术，它结合了SDS-和免疫学技术。
以下是WB实验的基本步骤：1.样品制备：首先，需要从细胞，组织或培养物中提取目标蛋白质。
提取方法根据样品的性质而异，可以利用细胞裂解和离心来获取细胞和组织提取物，或者将培养物离心并用PBS洗涤来获取培养物提取物。
提取的样品通常需要加入蛋白酶抑制剂和磷酸盐缓冲液以保持目标蛋白质的完整性。
2. 蛋白质浓度测定：使用BCA、 Lowry或Bradford等标准浓度测定方法，测量目标蛋白质在样品中的浓度。
这是为了确保在加载样品到SDS-胶上时，每个样品都包含相等的蛋白质量。
3. SDS-电泳：将样品加入含有SDS和还原剂的Laemmli试剂，然后通过堆积凝胶（通常是12%）和分离凝胶（通常是4-20%梯度凝胶）分离蛋白质。
SDS在SDS-中提供负电荷，使蛋白质带有均等的负电荷，并且还原剂将蛋白质中的二硫键还原为单硫键，使其线性化。
加载的样品和分子量标尺（如预制的蛋白质标尺）通过电流进行电泳，直到达到所需的分离程度。
4.蛋白转移：将胶上的蛋白质转移到聚丙烯酰胺(PVDF)或硝酸纤维素（NC）膜或其他适用于蛋白质转移的膜上。
通常使用半湿式转移方法，其中将凝胶的胶异型架和转移膜浸泡在转移缓冲液中，并将电流应用于构成电泳腔的两侧。
电流通过凝胶和蛋白质，使蛋白质转移到膜上。
5. 蛋白质定位：使用染色方法（如Ponceau S染色或Coomassie蓝染色）将膜上的蛋白质定位。
这个步骤是为了检查蛋白转移的效果以及加载的标尺和样品之间的分离效果。
染色后，可以测量标尺和目标蛋白质的迁移距离，以及标尺和样品之间的大小分离。
6.阻塞膜：将转移膜浸泡在阻塞缓冲液中，通常是在蛋白质标识位点不与抗体结合的蛋白质（如牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉）中。
阻塞的目的是防止未结合的抗体与非特异性蛋白质位点结合。
7.一抗孵育：将目标蛋白质的特异性抗体孵育于阻塞转移膜的缓冲液中。
WB实验步骤详解
WB实验步骤详解WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和鉴定蛋白质的实验技术。
在WB实验中，通常将目标蛋白质从混合蛋白样本中分离出来，然后通过电泳将其分离在聚丙烯酰胺凝胶上，并利用蛋白质转印技术将蛋白质迁移到膜上。
最后，使用特异性抗体进行免疫染色来检测目标蛋白质。
下面是WB实验的详细步骤：1.提取蛋白质：首先，从细胞、组织样本中提取蛋白质。
这个步骤可以使用不同的方法，例如细胞裂解、组织切碎和离心等。
提取的蛋白质可以用于整个WB实验的下一步。
2.蛋白质电泳分离：将提取的蛋白质样本与样品缓冲液混合，然后加载到聚丙烯酰胺凝胶上。
通常使用的凝胶是SDS-（聚丙烯酰胺凝胶电泳），该凝胶根据蛋白质的分子量将其分离开来。
样品加载完毕后，通电进行电泳分离。
较小的蛋白质会迁移到凝胶的上部，较大的蛋白质会停留在凝胶的下部。
3.转印：将电泳分离后的蛋白质转移到膜上。
通常使用的膜是聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜。
在转印之前，通常将凝胶浸泡在转移缓冲液中以增强转印效果。
然后，将凝胶与膜、滤纸层堆叠在一起，将其放置在转印装置中，施加电流进行蛋白质转印。
4.阻断：将转印完成的膜孔洞中的非特异性结合位点进行阻断。
阻断是为了防止以后的抗原-抗体反应受到非特异性结合的干扰。
最常用的阻断剂是1%-5%的非脂牛奶粉或5%-10%的牛血清蛋白。
5.抗体孵育：使用特异性的抗体来检测目标蛋白质。
首先将抗体稀释在主抗体稀释液中，然后将其加到阻断后的膜上进行孵育。
通常在4℃下过夜孵育，使抗体与目标蛋白质结合。
选择合适的抗体对于获得准确的结果非常重要。
6.辅助抗体孵育：将特异性抗体之外的次级抗体添加到膜上，用于识别已结合的主抗体。
这些次级抗体通常与酶（如辣根过氧化物酶）或荧光染料标记进行共轭，以便于标记的抗体的检测。
次级抗体与主抗体结合形成复合物。
7.检测：使用特定的检测方法来显示已结合的抗体。
这些方法可以使用酶标法（如辣根过氧化物酶反应和色素显色）或荧光技术（如荧光染料）。
WB实验基本步骤
WB实验基本步骤实验是科学研究中非常重要的一部分，能够帮助研究者验证假设、获取数据并进行分析和解释。
在进行实验之前，需要制定一系列的实验步骤，以确保实验的可重复性和准确性。
下面是进行实验的基本步骤：1.确定研究目标：在进行实验之前，需要明确研究的目标和问题。
这将有助于确保实验的设计和方法能够回答所关心的科学问题。
2.设计实验：在设计实验时，需要确定实验的要素和因素。
要素是实验中所控制的变量，而因素是实验中独立变量的变化范围。
此外，还需要确定实验的结构和方法，并制定测试假设。
3.收集材料和设备：根据实验的设计和方法，需要收集所需的材料和设备。
这些可能包括化学品、实验器具、仪器设备等。
4.准备实验样品：根据实验设计的要求，准备实验所需的样品或生物材料。
这可能包括净化、培养、标记、制备等步骤。
5.设定实验条件：为了确保实验结果的准确性，需要设定适当的实验条件。
这包括温度、湿度、光照等环境因素，以及时间、浓度、pH值等实验操作条件。
6.进行实验：根据实验设计和方法，进行实验操作。
这可能包括混合试剂、加热、冷却、测量、记录数据等步骤。
7.数据记录和分析：在实验过程中，记录关键数据和观察结果。
这些数据将被用于后续的数据分析和解释。
数据分析可以使用统计学方法，如平均值、标准差、方差等。
8.结果解释和讨论：分析实验数据后，需要解释和讨论实验结果。
将实验结果与已有的知识进行比较和解释，得出结论，并对实验结果的限制和不确定性进行评估。
9.撰写实验报告：根据实验结果，撰写实验报告。
在实验报告中，需要包括实验目的、方法、结果、讨论、结论等内容。
报告应该清晰、有条理，并提供足够的背景和上下文信息。
10.评估和改进实验：评估实验的过程和结果，并根据评估结果进行改进。
这可能包括修改实验设计、调整实验方法、修正数据分析等。
以上是进行实验的基本步骤，每一步都至关重要，以确保实验的可靠性和有效性。
通过遵循这些步骤，研究者可以进行有条理、准确的实验，并为科学研究提供有价值的贡献。
wb的简化步骤
wb的简化步骤
WB即Western blot，是一种综合性的免疫学检测技术。
其简化步骤如下：
1. 提取膜蛋白或者总蛋白（主要使用RIPA蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，低温操作）。
2. 制胶（玻璃要洗干净，缓慢铺胶）。
3. 跑电泳（电泳液可以使用干粉直接加双蒸水的，也可以使用SDS、甘氨酸和Tris配制。
上层胶80V+30min，下层胶120V+90min）。
4. 转膜（转膜使用的纤维膜价格较贵，一般分为0.22um、0.47um两种。
小分子蛋白要求孔径小一些，一般300mA+70min，但若发现蛋白在胶上有残留，可适当延长时间）。
5. 封闭（2h BSA或者5%脱脂奶粉，用PBST或TBST配制）。
6. 孵育抗体（4°C过夜，一抗二抗，二抗2h）。
7. 显影（使用ECL）。
WB操作复杂，实验过程中需要严格按照操作步骤进行，同时注意细节和条件的优化，以确保实验结果的准确性。
如果有需要更详细的步骤，可以查询相关的实验手册或者咨询相关的实验技术人员。
wb实验基本步骤.doc
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WB实验是一种常见的实验方法，主要用于检测特定蛋白质在样本中的含量和分子量，通常用于生物化学、免疫学和分子生物学等领域的研究。
以下是WB实验的基本步骤：
1、制备蛋白提取液：首先需要将要检测的细胞、组织等样本分别加入不同的缓冲液中进行细胞破碎和蛋白提取，以获得纯度较高的蛋白提取液。
2、电泳：将提取的蛋白质样品通过电泳进行分离，通常会使用SDS-PAGE凝胶进行分离。
将不同分子量的蛋白质分别移动到凝胶上的不同位置，以便之后的检测。
3、转移：将凝胶上的蛋白质转移到聚乙烯膜或硝酸纤维素膜上，通常使用电泳转移法，将蛋白质从凝胶中转移至聚乙烯膜或硝酸纤维素膜上，以便后续的抗体检测。
4、阻断：用牛血清白蛋白或者干奶粉等物质对转移膜进行阻断，避免后续的抗体与非目标蛋白质结合。
将药液涂抹在膜上，使其涂满，然后放在室温或冰箱中进行阻断。
5、抗体反应：将目标蛋白质的抗体与转移膜中的蛋白质结合，用于识别其中的目标蛋白质。
将稀释好的抗体液滴到转移膜上，可以进行全膜反应或局部反应，稍作震荡和轻轻摇晃。
6、显色：将荧光素和遥光素添加到转移膜上，用于显示蛋白质的分布位置和含量。
将荧光素和遥光素稀释好涂在膜上，等待5~10分钟后进行观察。
7、数据分析：通过使用图像分析软件对转移膜蛋白质条带进行测量，得到蛋白质的含量和分子量等数据。
尽可能准确地确定目标蛋白质的含量和分子量等信息。
WB实验步骤详解
WB实验步骤详解WB实验是一种常用的生化实验方法，用于检测和分析蛋白质的表达水平和相互作用。
下面将详细介绍WB实验的步骤。
1.细胞裂解首先，将感兴趣的细胞收集并放入细胞裂解缓冲液中，通过机械剪切或超声波处理使细胞完全破裂，并释放细胞内的蛋白质。
常用的细胞裂解缓冲液包括RIPA缓冲液或NP-40缓冲液。
2.蛋白质提取将裂解后的细胞溶液离心，将上清液转移到新的离心管中。
通过离心去除细胞碎片等固体物质。
上清液中含有溶解的蛋白质，可以用于后续的分析。
3.电泳分离制备SDS-凝胶，将蛋白质样品加入凝胶孔中。
电泳分离过程中，蛋白质会按照其分子量大小在凝胶中移动。
较小的蛋白质移动较快，较大的蛋白质移动较慢。
4.转膜将分离后的蛋白质从凝胶上转移到聚合物膜上，一般使用半湿式或干转膜法。
湿式转膜使用蛋白质转移缓冲液进行转膜，在电场作用下将蛋白质从凝胶中转移到膜上。
干转膜则是将分离后的凝胶与膜一同放在压力箱中，在应用压力的同时进行转膜。
5.封闭在转膜后的聚合物膜上加入封闭缓冲液，使膜表面被封闭，防止非特异性结合。
6.第一次抗体孵育将感兴趣的蛋白质的抗体加入孵育缓冲液中，并将聚合物膜放入缓冲液中孵育。
第一次抗体与目标蛋白质特异性结合。
7.洗脱孵育后，使用洗涤缓冲液洗去未结合的一次抗体。
8.第二次抗体孵育将与目标蛋白质结合的一次抗体加入孵育缓冲液中，并将聚合物膜放入缓冲液中进行孵育。
第二次抗体能够识别一次抗体，并与之特异性结合。
9.洗脱孵育后，使用洗涤缓冲液洗去未结合的第二次抗体。
10.显色将显色试剂加入滤膜中，使蛋白质与试剂反应发生染色反应。
常用的显色试剂有染色剂DAB（二氨基联苯酚）或ECL（增强型化学发光）试剂。
11.影像获取使用实验室常用的成像设备，如X光片胶片、化学发光成像设备或荧光成像设备，将染色后的滤膜拍摄下来或记录下来。
可以通过影像获取软件进行蛋白质带的密度分析。
12.数据分析使用数据分析软件，对得到的数据进行定量分析和比较。
WB实验步骤详解
WB实验步骤详解Western blotting (WB)是一种用于检测蛋白质的技术，它可以分析蛋白质的大小、数量和结构。
WB通常用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达水平，以及蛋白质的修饰状态。
本文将详细介绍WB实验的步骤，以帮助读者更好地理解和掌握这一技术。
步骤一，细胞或组织的裂解。
WB实验的第一步是将细胞或组织裂解，以释放蛋白质。
通常使用RIPA缓冲液或其它含有蛋白酶抑制剂的裂解液来裂解细胞或组织。
裂解液中的蛋白酶抑制剂可以防止蛋白质在裂解过程中被降解，保证蛋白质的完整性。
步骤二，蛋白质的分离。
裂解后的细胞或组织中含有大量的蛋白质，需要将这些蛋白质分离出来。
通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来分离蛋白质。
SDS-PAGE可以根据蛋白质的大小将其分离成不同的条带，方便后续的检测。
步骤三，将蛋白质转移到膜上。
分离后的蛋白质需要转移到膜上，以便进行免疫印迹检测。
通常使用半湿式或全湿式电泳转印系统将蛋白质转移到聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜上。
转印的时间和电压需要根据蛋白质的大小和数量来确定。
步骤四，膜的封闭。
转移完蛋白质后，需要将膜进行封闭，以防止非特异性结合。
封闭通常使用5%脱脂奶粉或蛋白质封闭剂进行，可以有效地减少非特异性结合，并提高抗体对目标蛋白的特异性识别。
步骤五，抗体的孵育。
封闭后的膜需要与特异性的一抗进行孵育。
一抗可以是针对目标蛋白的单克隆或多克隆抗体。
孵育时间和温度需要根据抗体的性质来确定，通常在4°C下孵育一晚上。
步骤六，膜的洗涤。
孵育完一抗后，需要对膜进行洗涤，以去除未结合的抗体和非特异性结合。
洗涤液通常是含有Tween-20的PBS或TBST缓冲液，需要进行多次洗涤以确保膜的干净。
步骤七，二抗的孵育。
洗涤完膜后，需要与特异性的二抗进行孵育。
二抗通常是与酶或荧光素结合的抗体，可以识别一抗并发出特定的信号。
孵育时间和温度需要根据二抗的性质来确定。
步骤八，膜的洗涤。
wb实验流程及注意事项
wb实验流程及注意事项
WB实验是一种常见的免疫学实验，其流程大致如下：
1.制备细胞悬液：将需要研究的细胞通过离心、洗涤等操作制成含有约1×10^6个/ml的单细胞悬液。
2.孵育细胞：将细胞悬液加入含有10%腹水的RPMI1640培养基中（也可添加适量的FBS）进行孵育，通常孵育时间为24-48小时。
3.收获细胞：将孵育后的细胞通过离心等方式收获，以备进行下一步操作。
4.制备干标准物：将抗体或其他试剂制成干标准物（包括一系列浓度档次），通常冷冻保存备用。
5.制备稀释液：将PBS或其他缓冲液配成不同浓度的稀释液，可用于对干标准物的稀释。
6.加入样品：将步骤3中的细胞悬液加入96孔板中，加入相等体积的稀释液。
7.加入干标准物：将制备好的干标准物加入96孔板中，加入相等体积的稀释液。
8.孵育：将加入样品和干标准物的96孔板进行孵育，通常为2-3小时，使细胞与抗体结合。
9.洗涤：用PBS或其他缓冲液进行洗涤，去除未结合的试剂。
10.加入二抗：加入与干标准物匹配的二抗，并进行孵育。
经过一定时间，细胞与试剂结合形成免疫复合物。
11.用底物发光：加入底物，进行化学发光反应，根据发光量推算出样品中对应物质的浓度。
注意事项：
1.所有试验所用材料要保持洁净，尤其是培养皿和吸管，以避免污染。
2.在制备稀释液和样品时要准确称量，避免误差，同时要注意样品的体积和浓度，保证实验的可靠性。
3.在操作过程中，要规范操作流程，严格遵守实验规程，注意自身安全。
4.试剂保存要避免高温和阳光照射，同时要注意过期时间。
5.实验过程中要及时记录数据，以便后续分析。
WB实验步骤
1.蛋白提取1.细胞转移至生化室，PBS洗两遍，倒去PBS；2.离心机4℃预冷3.配置裂解液SDS+PMSF(100：1)，大瓶：80uL，中瓶：60uL，小瓶：40uL；4.Z字形滴加裂解液，4℃存放20min5.刮取裂解细胞，移至EP管中（冰盒上操作）；6.激光打碎细胞；7.4℃，10000转/min离心30min；8.将上清移至另一EP管，记录体积；9.配置BCA液200uL，A液:B液=50:110.取2个比色杯：23uL ddH2O+2uL上清+200uL BCA液；11.比色杯置37℃温箱30min，570nm测OD值；12.剩余上清加5*SDS混匀，上清：SDS=4:1，水开后，开锅煮10min；13.室温冷却，置-20℃冰箱备用OD值=0.0011x+0.3657蛋白浓度=x/1000*12.5 ug/ul上样量=20/蛋白浓度2.SDS-PAGE电泳1)配胶A.物品准备：选择1mm制胶玻璃板、间隔片、梳子等物品，洗净晾干，确保灌胶时不产生气泡（多备一块板），夹板，底部用封口胶封闭；B.制备分离胶：在小瓶内配置适当浓度的分离胶10ml，将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中并为浓缩胶留有足够空间（绿色横隔下缘），加入异丙醇隔离空气，静置40min聚合；C.制备浓缩胶：分离胶聚合后倾倒出上层异丙醇，滤纸吸干，按需配置5%浓缩胶，最后加TEMED，注入浓缩胶，并插上梳子静置40min，应小心避免气泡；2)样品处理：在收集的蛋白样品中加入适量5*SDS上样缓冲液，沸水加热3-5分钟，以充分变性蛋白；3)上样：将100ml 5*电泳缓冲液自来水稀释成500ml，加至电泳槽，浸过玻璃板，吹散上层泡沫，用微量加样器吸取样品，缓慢加入样品（上样量一般不超过20uL），样品两侧加入3.5uL Marker（不要吸进气泡）4)电泳：插入电击，注意正负极（红对红，黑对黑），打开电泳仪开关，设置参数，S1：70V，0.04A，30min；S2：110V，0.02A，1h；电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳。
WB实验步骤
【WB实验步骤】1.配胶:(1) 根据所需检测蛋白分子量的大小, 配制合适浓度的凝胶。
P53=53KD (1:1000), P21=21KD, Bcl2=28KD, Caspase3=17KD (1:1000)，GAPDH=36kDa (1:5000), β-actin=43kDa50KD以下的分子量选用12%的分离胶(15ml)分离胶加至薄玻板下方约1cm, 分离胶的上方轻轻地来回均匀加蒸馏水，有助于将分离胶压平，1小时后将蒸馏水倒去，用滤纸吸干，准备加浓缩胶(积成胶)。
聚丙烯酰胺浓缩胶(6ml):(2)(3)等待胶凝固的过程中煮蛋白：在提取的蛋白质样品中加入5×SDS上样缓冲液（5×SDS上样缓冲液:蛋白上清液=1:4），100℃煮6min，瞬离，冰上静置备用，保存于-20℃。
2.电泳：向泳道中加入上述已加热变性的蛋白样品50μg, 同时在合适的泳道加入蛋白Marker。
80V稳压运行40min后,再用120V 稳压电泳至蛋白Loading Buffer移动到凝胶下缘(约55min)。
要用大电泳仪，可以从80V浓缩胶自动转到120V跑分离胶。
放板子的时候，高的厚玻璃板要放在外面一侧。
3.转膜：将转膜缓冲液置于-20°C冰箱预冷1小时，PVDF膜放入甲醇中浸泡30s后去离子水洗涤干净，转入转膜缓冲液中平衡5min。
从黑面开始按照海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵按正确顺序装入转膜夹后，将整个转膜系统置于冰上，100V稳压转膜1.5h (注意电流不要超过300mA，以免发热过度)。
4.封闭：转膜结束后，取出PVDF膜。
正面朝上，将其放入PBST配制的5%的脱脂牛奶中，置于摇床上封闭1h。
封闭之前，可根据分子量大小将膜切开：在实验台上铺一层保鲜膜，包住PVDF 膜，用尺对齐，然后将PVDF膜切开。
5.一抗孵育：按照抗体说明书，用5%的PBST配制的脱脂牛奶稀释抗体至所需浓度。
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
wb实验的基本步骤
wb实验的基本步骤WB 实验呀，就像是一场精心编排的舞蹈！首先呢，得准备好“舞台”，也就是把蛋白样品制备好。
这就好比是挑选合适的舞者，得让他们状态满满呀！把细胞啊或者组织啥的处理好，提取出我们需要的蛋白，这一步可得细心点儿，别把“好苗子”给弄丢了或弄坏了哟。
然后呢，就是电泳啦！这就像是让舞者们排好队，按照各自的特点和能力依次展现自己。
通过电场的作用，让不同大小的蛋白分离开来，各就各位。
接下来可重要啦，转膜！这就好像是把舞台上的舞者们“转移”到另一个地方继续表演。
把蛋白从凝胶上转到膜上，让它们能更好地被检测和识别。
之后就是封闭啦！这相当于给舞台拉上帷幕，把那些可能干扰表演的“闲杂人等”挡在外面，让我们的主角蛋白们能安心表演。
再然后呢，就是加一抗啦！这就像是给舞者们穿上特定的服装，让我们能一眼认出他们。
一抗会特异性地识别我们感兴趣的蛋白。
孵育一抗之后，得洗去那些没结合上的，这就像给舞者们清理一下身上的灰尘啥的。
接着加二抗！这二抗就像是给舞者们加上了闪闪发光的配饰，让他们更加显眼。
二抗能和一抗结合，起到放大信号的作用呢。
再经过一番孵育和洗涤，就可以显色啦！哇，这就像是舞者们终于在聚光灯下开始了精彩的表演，呈现出美丽的图案或信号。
在整个过程中，每一步都不能马虎呀！就像跳舞，一个小失误可能就会影响整个表演效果。
蛋白样品制备不好，后面的步骤都可能白费力气；电泳没做好，蛋白就不能很好地分离；转膜不顺利，那就看不到完整的蛋白信息；封闭不彻底，干扰太多可不行；一抗二抗没选对，那可就找不到我们的目标蛋白啦。
所以啊，做 WB 实验可真得像对待一场重要演出一样认真和仔细呢！每一个环节都得用心去做，这样才能得到准确而可靠的结果呀。
大家在做的时候可千万别偷懒哦，不然最后出来的“舞蹈”可就不精彩啦！这就是 WB 实验的基本步骤啦，大家记住了吗？。
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实验基本步骤
提取细胞蛋白
↓
BCA定量
↓
制备蛋白胶(SＤS-PAGE胶)
↓
蛋白样品变性
↓
电泳
↓
转膜
↓
封闭
↓
一抗
↓
ＴBＳT洗涤
↓
二抗
↓
TBST洗涤
↓
显影
↓
结果分析
试剂配制
１。
PBS磷酸盐缓冲溶液1L
磷酸二氢钾0、24g
磷酸氢二钠 1.44ｇ
氯化钠 8ｇ
氯化钾 0。
2g
加入50０mｌ纯水,调PH=7、2
定容至1L,高压蒸汽灭菌
２。
PBST(PBS+０、05%吐温—2０) 5０0ｍｌPBS+0。
２5ml吐温-２0
3。
电转液50０mｌ
Ｔris １。
5g
甘氨酸 7。
2ｇ
４０0ｍl水溶解
加入100ml甲醇,置于4℃冰箱预冷
４.电泳液(1Ｘ)
1０x稀释,５０ｍl1０ｘ电泳液+450ml纯水
5.TBS
6。
TBST(TBＳ+0。
05%吐温－20)
5０ｍlＴBS+４50ｍl纯水+0.25ml吐温-2０
7、封闭液
ＴＢＳT1X＋５%奶粉
4０ml封闭液=4０mlTBST＋２g奶粉,40℃预热
ＷB实验
一、蛋白样品制备
准备:一管细胞,PBＳ(４℃预冷),PMSF(1０0ｍM),移液枪(1０00ul,１0ul),1、5ｍlEＰ管2个,高速冷冻离心机4℃预冷
1.于—2０℃冰箱中取出一管细胞样品,吸去培养液
2.加入1mｌ4℃预冷得PBS(0、0１M ｐＨ７。
２～７、3)。
用移液枪轻轻吹成悬浮液后4℃,８0００r离心５ｍin,然后弃去上清、重复以上操作一次,共洗细胞两次以洗去培养液。
3、按1ml裂解液加10 μlＰMSＦ(100 mM),摇匀置于冰上。
(ＰMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
) ４.在样品中加入3００ul含PMＳF得裂解液,吹匀,于冰上裂解30 ｍｉn,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动、
5.裂解完后,于4℃下1２000 rpm离心5 miｎ。
7.将离心后得上清分装转移倒0。
5 ml得离心管中放于－20℃保存、
二、蛋白含量得测定(BCＡ定量)
准备:96孔板,移液枪(10０0uｌ,10ul,２00ul),ＢCA工作液(A+Ｂ),５０mlＥＰ管,１xPＢS,BＳA标准液
1.将９6孔板分好区域,若不够分则只做两个重复,(外围一圈得孔最好不用)
2.算好孔数(总得)每孔加２0０ｕlBCA工作液(Ａ+B),(A液:B液＝50:1,一般配多些,如６０孔,A液12000ｕl,B液2４0ｕl)
3.将样品稀释到一定倍数才能定量,(10倍,20倍,30倍),每孔需要20uｌ样品(2uｌ样品+１8ulPBS,即稀释10倍),
做三个重复则需要60ｕl,一般配80ul
4.配蛋白标准样品,将2ｍｇ/ｍl得蛋白标准溶液稀释至0。
5ｍg／ml,若配200ul得0、5mg／ml蛋白标准溶液则需要50ul得2ｍg/ml得蛋白标准溶液与150uｌPBS溶液
5.将稀释好得样品加入孔板中(标记得区域),接着标准品按０,1,2,4,8,12,１6,20ul加到标号得区域,之后在加标准样品得孔内,将孔内溶液用PBS补足到20ｕl
6.每孔加200ｕl配好得工作液,平行加,不能上下加,以减少误差
7.将加好得96孔板放在３7℃下孵育３0分钟
8.孵育完后,放在酶标仪轻微震荡３－10s,中速,吸光值59５nｍ,进行比色测定,记录标准曲线及样品吸光值数据后,以蛋白含量(ml)为横坐标,吸光值为纵坐标作标准曲线。
(R2 >0.98才有用,酶标仪操作:两个箭头图标,1就是结果,2就是保存)
9.计算蛋白含量(注意定量样品已经稀释了1０倍)
蛋白质定量标准曲线加样量
序号 1 2 3 4 5 6 ７8
标准蛋白量/ul (０。
5mg/ml)
背景液(PＢS)/uｌ２0
标准液浓度ｍg/ml 0 ０.0２5 0、05 0。
１0、2 ０。
3 ０。
4 0。
5 三、SDS－PAGE电泳
1。
配胶(12％,可以提前配好)
准备:玻璃板,梳子,AP(解冻,现拿现用),聚丙烯酰胺(4℃冰箱冷藏)
(1)玻璃板验漏5min
(2)按表配置分离胶
(3)灌胶,加酒精封压,凝３0min(注意不要有气泡)
(４)按表配浓缩胶,倒掉酒精,用吸水纸吸去酒精,灌胶,插梳子(注意不要有气泡),凝３0mｉn
(５)取胶,用水冲洗一下浓缩胶,加少量水放入一次性手套中4℃冰箱保存备用
2。
样品处理
准备:ＰＢS,移液枪,1。
５mlＥP管
(1)稀释样品:一般每孔上样5ul,即1mg／ml浓度得样品,测完蛋白含量后,将样品用PＢＳ稀释至1mｇ/mｌ(注意ｌoadｉngbｕffer得加入也得算入)
(2)取出上样样品1５ul至1、５ｍl离心管中,加入6×SDＳ上样缓冲液3ul至终浓度为1×。
(上样总体积一般不超过15 μl,加样孔得最大限度可加２0 μl样品。
)
(3)将样品在10０℃煮5 miｎ震荡使蛋白完全变性(注意仪器操作)
3。
电泳
准备:电泳液５０0ｍｌ(现配),蛋白胶,１0ｕｌ移液枪(枪头),样品,Ｍａrkeｒ,冰盒,电泳装置
(1)将SＤS—PＡＧＥ胶放入电泳槽中,加足够得电泳液。
(短玻璃板面向内,长玻璃板面向外、若只跑一块胶,那槽另一边要垫一块塑料板且有字得一面面向外。
电泳液至少要漫过内测得短玻璃板、注意先检漏。
) (2) 上样、用移液枪贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡、将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
(加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次,以免交叉污染、)
(3)先设置80V,开始电泳,样品溴酚蓝跑至分离胶后增至120Ｖ电压,电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜、(此时准备好电转液)
四、转膜
准备:电转液(现配４℃冰箱冷藏),镊子,滤纸,PＶDF膜(0。
45uｍ),电转装置,冰盒
注意:拿滤纸与膜时一定要戴手套或用镊子,因为手上得蛋白会污染膜。
1.在加有转移液得盘里放入转膜用得夹子、两块海绵垫
2.滤纸浸入电转液中,ＰVDF膜在甲醇中润湿成半透明,小心将膜放入４℃电转液中平衡至少5min。
３.将夹子打开使黑得一面保持水平。
在上面垫一张海绵垫,用玻棒来回擀几遍以擀走里面得气泡、(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。
)在垫子上垫三层滤纸(可三张纸先叠在一起在垫于垫子上),一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中得气泡。
4. 先将玻璃板撬掉才可剥胶,撬得时候动作要轻,要在两个边上轻轻得反复撬、撬一会儿玻璃板便开始松动,直到撬去玻板。
(撬时一定要小心,玻板很易裂。
)除去小玻璃板后,将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作),要避免把分离胶刮破。
小心剥下分离胶盖于滤纸上(做好标记),用手调整使其与滤纸对齐,轻轻用玻棒擀去气泡、将膜盖于胶上,要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。
在膜上盖3张滤纸并除去气泡。
最后盖上另一个海绵垫,擀几下就可合起夹子。
整个操作在转移液中进行,要不断得擀去气泡。
膜两边得滤纸不能相互接触,接触后会发生短路、(转移液含甲醇,操作时要戴手套,实验室要开门以使空气流通。
)
5. 将夹子放入转移槽中(电转移时会产热,浆槽放入冰中),要使夹得黑面对槽得黑面,夹得白面对槽得红面。
一般用100mA转移90min。
6。
转完后将膜用１×丽春红染液染５mｉn(于脱色摇床上摇)、然后用水冲洗掉没染上得染液就可瞧到膜上得蛋白、将膜晾干备用。
(准备封闭液)
六、免疫反应
准备:封闭液,一抗,二抗,ＴBＳＴ
１。
将膜移至含有封闭液得平皿中,室温下脱色摇床上摇动封闭２ｈ。
2.ＴＢST洗4次。
每次５分钟。
3.将膜按照目得蛋白所处位置剪切并做好标记,加入相对应得一抗,室温孵育2h或者4℃过夜
4.室温下孵育1~2 h后,用TBST在室温下脱色摇床上洗四次,每次5min
5。
同上方法准备二抗稀释液并与膜接触,室温下孵育1～2 h后,用TBSＴ在室温下脱色摇床上洗4次,每次
5 min
七、显影
准备:样品胶片,移液枪(２00ｕl),中枪头,吸水纸,显影液(A＋B),薄镊子
1. 将Ａ与B两种试剂在保鲜膜上等体积混合;
2.１miｎ后,取适量显影液于显影仪台面上,将膜用镊子夹起来正反面充分与显影液接触,注意切角在左上,即正面朝上、
应注意得就是:显影需移动胶片时,尽量拿胶片一角,手指甲不要划伤胶片,否则会对结果产生影响。
3.盖上盖子,将胶片进行扫描或拍照。