WB实验基本步骤

实验基本步骤

提取细胞蛋白

↓

BCA定量

↓

制备蛋白胶(SＤS-PAGE胶)

↓

蛋白样品变性

↓

电泳

↓

转膜

↓

封闭

↓

一抗

↓

ＴBＳT洗涤

↓

二抗

↓

TBST洗涤

↓

显影

↓

结果分析

试剂配制

１。PBS磷酸盐缓冲溶液1L

磷酸二氢钾0、24g

磷酸氢二钠 1.44ｇ

氯化钠 8ｇ

氯化钾 0。2g

加入50０mｌ纯水,调PH=7、2

定容至1L,高压蒸汽灭菌

２。PBST(PBS+０、05%吐温—2０) 5０0ｍｌPBS+0。２5ml吐温-２0

3。电转液50０mｌ

Ｔris １。5g

甘氨酸 7。2ｇ

４０0ｍl水溶解

加入100ml甲醇,置于4℃冰箱预冷

４.电泳液(1Ｘ)

1０x稀释,５０ｍl1０ｘ电泳液+450ml纯水

5.TBS

6。TBST(TBＳ+0。05%吐温－20)

5０ｍlＴBS+４50ｍl纯水+0.25ml吐温-2０

7、封闭液

ＴＢＳT1X＋５%奶粉

4０ml封闭液=4０mlTBST＋２g奶粉,40℃预热

ＷB实验

一、蛋白样品制备

准备:一管细胞,PBＳ(４℃预冷),PMSF(1０0ｍM),移液枪(1０00ul,１0ul),1、5ｍlEＰ管2个,高速冷冻离心机4℃预冷

1.于—2０℃冰箱中取出一管细胞样品,吸去培养液

2.加入1mｌ4℃预冷得PBS(0、0１M ｐＨ７。２～７、3)。用移液枪轻轻吹成悬浮液后4℃,８0００r离心５ｍin,然后弃去上清、重复以上操作一次,共洗细胞两次以洗去培养液。

3、按1ml裂解液加10 μlＰMSＦ(100 mM),摇匀置于冰上。(ＰMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。) ４.在样品中加入3００ul含PMＳF得裂解液,吹匀,于冰上裂解30 ｍｉn,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动、

5.裂解完后,于4℃下1２000 rpm离心5 miｎ。

7.将离心后得上清分装转移倒0。5 ml得离心管中放于－20℃保存、

二、蛋白含量得测定(BCＡ定量)

准备:96孔板,移液枪(10０0uｌ,10ul,２00ul),ＢCA工作液(A+Ｂ),５０mlＥＰ管,１xPＢS,BＳA标准液

1.将９6孔板分好区域,若不够分则只做两个重复,(外围一圈得孔最好不用)

2.算好孔数(总得)每孔加２0０ｕlBCA工作液(Ａ+B),(A液:B液＝50:1,一般配多些,如６０孔,A液12000ｕl,B液2４0ｕl)

3.将样品稀释到一定倍数才能定量,(10倍,20倍,30倍),每孔需要20uｌ样品(2uｌ样品+１8ulPBS,即稀释10倍),

做三个重复则需要60ｕl,一般配80ul

4.配蛋白标准样品,将2ｍｇ/ｍl得蛋白标准溶液稀释至0。5ｍg／ml,若配200ul得0、5mg／ml蛋白标准溶液则需要50ul得2ｍg/ml得蛋白标准溶液与150uｌPBS溶液

5.将稀释好得样品加入孔板中(标记得区域),接着标准品按０,1,2,4,8,12,１6,20ul加到标号得区域,之后在加标准样品得孔内,将孔内溶液用PBS补足到20ｕl

6.每孔加200ｕl配好得工作液,平行加,不能上下加,以减少误差

7.将加好得96孔板放在３7℃下孵育３0分钟

8.孵育完后,放在酶标仪轻微震荡３－10s,中速,吸光值59５nｍ,进行比色测定,记录标准曲线及样品吸光值数据后,以蛋白含量(ml)为横坐标,吸光值为纵坐标作标准曲线。(R2 >0.98才有用,酶标仪操作:两个箭头图标,1就是结果,2就是保存)

9.计算蛋白含量(注意定量样品已经稀释了1０倍)

蛋白质定量标准曲线加样量

序号 1 2 3 4 5 6 ７8

标准蛋白量/ul (０。

5mg/ml)

背景液(PＢS)/uｌ２0

标准液浓度ｍg/ml 0 ０.0２5 0、05 0。１0、2 ０。3 ０。4 0。5 三、SDS－PAGE电泳

1。配胶(12％,可以提前配好)

准备:玻璃板,梳子,AP(解冻,现拿现用),聚丙烯酰胺(4℃冰箱冷藏)

(1)玻璃板验漏5min

(2)按表配置分离胶

(3)灌胶,加酒精封压,凝３0min(注意不要有气泡)

(４)按表配浓缩胶,倒掉酒精,用吸水纸吸去酒精,灌胶,插梳子(注意不要有气泡),凝３0mｉn

(５)取胶,用水冲洗一下浓缩胶,加少量水放入一次性手套中4℃冰箱保存备用

2。样品处理

准备:ＰＢS,移液枪,1。５mlＥP管

(1)稀释样品:一般每孔上样5ul,即1mg／ml浓度得样品,测完蛋白含量后,将样品用PＢＳ稀释至1mｇ/mｌ(注意ｌoadｉngbｕffer得加入也得算入)

(2)取出上样样品1５ul至1、５ｍl离心管中,加入6×SDＳ上样缓冲液3ul至终浓度为1×。(上样总体积一般不超过15 μl,加样孔得最大限度可加２0 μl样品。)

(3)将样品在10０℃煮5 miｎ震荡使蛋白完全变性(注意仪器操作)

3。电泳

准备:电泳液５０0ｍｌ(现配),蛋白胶,１0ｕｌ移液枪(枪头),样品,Ｍａrkeｒ,冰盒,电泳装置

(1)将SＤS—PＡＧＥ胶放入电泳槽中,加足够得电泳液。(短玻璃板面向内,长玻璃板面向外、若只跑一块胶,那槽另一边要垫一块塑料板且有字得一面面向外。电泳液至少要漫过内测得短玻璃板、注意先检漏。) (2) 上样、用移液枪贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡、将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。(加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次,以免交叉污染、)

(3)先设置80V,开始电泳,样品溴酚蓝跑至分离胶后增至120Ｖ电压,电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜、(此时准备好电转液)

四、转膜

准备:电转液(现配４℃冰箱冷藏),镊子,滤纸,PＶDF膜(0。45uｍ),电转装置,冰盒