大肠杆菌

菌落在圆形边缘上和以外的情况
圆形边缘上及以外的菌落不作计数，因为泡棉上不含选择性培养基
“多不可计”的现象
测试片上菌落无法计数时至少有下列现象之一：
(1)很多小菌落 (2)有许多气泡 (3)培养基的颜色变深, 由红色到蓝紫色
断改进，对特定食品的大肠杆菌的检验需求肯定会越来越多，因此在本
次标准修订时增加了大肠杆菌计数方法。
大肠杆菌计数
第一法 MPN法wenku.baidu.com
第二法 VRBA-MUG平板计数法
第三法 Petrifilm测试片法
大肠杆菌计数……第一法
美国食品药品管理局（FDA）：Bacteriological Analytical Manual ，2002，Chapter 4： Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria
检样 25g(ml)样品＋225ml稀释液,均质
检 验 程 序
10倍系列稀释
选择适宜2-3个连续稀释度的样品匀液，接种 PetrifilmTM测试片 培养
361C 24h 2h 或48h 2h
计数测试片上蓝色带气泡的菌落 计算菌落总数 报告
接种与培养
选取适宜的2～3个连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种2张测试片。将 PetrifilmTM大肠杆菌检验测试片置于平坦实验台面处，揭开上层膜，用吸管 吸取样品液1mL垂直滴加在测试片的中央处，将上层膜缓慢盖下，避免气泡 产生和上层膜直接落下，把压板（平面底朝下）放置在上层膜中央处，轻轻 地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上，切勿扭转压板，拿起压板， 静置至少1分钟以使培养基凝固。将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆 叠片数不超过 20 片， 36C±1C 培养 。对于肉、家禽和水产品，培养时间为 24h2h，对于其它食品，培养时间为48h2h。
大肠杆菌计数……第二法
大肠杆菌计数……第二法
大肠杆菌在MUG－LST培养液的荧光现象
大肠杆菌计数……第二法
几点注意事项：
在实验时要用已知MUG阳性菌株和MUG阴性菌株做对照。
在选择计数平板时，选择的菌落数不要太多太密，50个
左右效果比较好些。原因是游离的4-甲基伞形酮有水溶性， 能从菌落向培养基中扩散，菌落太多的话，尤其是阳性菌 落太多的话，很可能就分不出单个菌落了。 紫外灯的功率不要太大。功率大了需要做好个人防护。
7251:1993(E) Microbiology - General guidance for ISO 4832:2006 （E） Microbiology of food and animal enumeration feeding stuffsof – Horizontal presumptive method Escherichia for the coli enumeration – most probable of coliforms number – Colony-count technique technique NMKL Method №125 3rd ed., 1996, Thermotolerant coliform bacteria. Enumeration in foods.
大肠杆菌计数……第三法
第三法 PetrifilmTM测试片法 增加纸片法的依据 国际认证情况
AOAC Official Methods 美国分析化学协会官方方法 AFNOR 法国标准化协会 Nordval validation 北欧认证 AOAC 991.14, AOAC 998.98 AFNOR Certificate Number 3M 01/2-09/89A-C Ref. No. 2003-20-5408-00012
－ － － － + +
－ － + + + +
典型产气肠杆菌 非典型产气肠杆菌
查表
阳性管数 0.10 0.01 0.001 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 2 0 0 3 0 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 1 0 1 1 1 1 2 0 1 2 1 1 3 0 2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 1 0 2 1 1 2 1 2
量气泡形成、不明显的小菌落，培养区呈蓝色时，需要进一步稀释样品来获
得准确的读数。

大肠杆菌为蓝点带气泡的菌落； 不论蓝色深浅，部分蓝色带气泡的菌落均为大肠杆菌； 圆形边缘上及边缘外的菌落不计数； 注意菌落浓度高的几种情况； 蓝点带气泡菌落和红点带气泡菌落之和为大肠菌群数。
不同类型气泡和菌落的连接情况
大肠杆菌计数
GB/T 4789.38-2008
大肠杆菌计数
大肠杆菌
定义：大肠杆菌广泛存在于是人和温血动物的肠道中，能
够在44.5℃发酵乳糖产酸产气、 IMViC生化试验为+ + - 或- + -
大肠杆菌主要是用于指示食品受到近期粪便污染或不卫生加工
大肠杆菌与粪便污染的相关性好
随着食品卫生标准的日益科学和细化，以及对大肠杆菌检验方法的不
澳大利亚 Victorian Dairy Industry Authority 加拿大 Health Protection Branch 智利 Department of Agriculture 法国 AFNOR 德国 DIN (Deutsches Institut fü r Normung) Fachbericht 81 Petrifilm Technik 日本 Food Safety Regulation Ministry of Health 韩国 Korea Code of Federal Regulatory 新泽西 New Zealand Food Safety Authority 波兰 Polish Normalisation Committee 南非 Department of Health 英国 Campden Food and Drink Research Association and Leatherhead Food Research Association study 美国 AOAC American Public Health Association USDA FSIS 委内瑞拉 Commission of Industrial Standards (COVENIN Standard)

合理稀释度的选择，每稀释度接种2张测试片；


避免气泡产生；
培养基未凝固时勿挪动； 对于肉、家禽和水产品，培养时间为24h2h,对于其它产品，培养时间为 48h2h。
图 示
1
2
3
凹面
平面
4 5 6
判 读
可目视、用菌落计数器、放大镜、或PetrifilmTM自动判读仪来计数。蓝色
有气泡的菌落确认为大肠杆菌，不论蓝色的深浅，部分蓝色的带气泡菌落也 确认为大肠杆菌。培养圆形面积边缘上及边缘以外的菌落不做计数。出现大
1g(mL)检样中最大可能数（MPN）表
MPN <3.0 3.0 3.0 6.1 6.2 9.4 3.6 7.2 11 7.4 11 11 15 16 9.2 14 20 15 20 27 95%置信区间 低 高 -9.5 0.15 9.6 0.15 11 1.2 18 1.2 18 3.6 38 0.17 18 1.3 18 3.6 38 1.3 20 3.6 38 3.6 42 4.5 42 4.5 42 1.4 38 3.6 42 4.5 42 3.7 42 4.5 42 8.7 94 阳性管数 0.10 0.01 0.001 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 3 0 2 3 1 3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 2 0 3 2 1 3 2 2 3 2 3 3 3 0 3 3 1 3 3 2 3 3 3 MPN 21 28 35 29 36 23 38 64 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 >1100 95%置信区间 低 高 4.5 42 8.7 94 8.7 94 8.7 94 8.7 94 4.6 94 8.7 110 17 180 9 180 17 200 37 420 40 420 18 420 37 420 40 430 90 1,000 42 1,000 90 2,000 180 4,100 420 --
大肠杆菌计数……第二法
检 样 25g(mL）样品+ 225mL稀释液，均质
10倍系列稀释
选择适宜2~3个连续稀释度的样品匀液，接种VRB-MUG平板
36℃±1℃ 18h-24h
紫外灯照射，计数发荧光菌落 报告结果
大肠杆菌计数……第二法
测 定
选取 2 ～ 3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度分别 取1mL注入两个无菌平皿。另取1mL稀释液注入一个无菌平皿中， 作空白对照。将 45℃ 士 0.5℃ 的结晶紫中性红胆盐琼脂（ VRBA ） 10 mL～15mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样 品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3 mL～4mL VRB-MUG覆盖 平板表层。 凝固后翻转平板，36℃±1℃培养18h～24h。选择菌落 数为 10 ～ 100 的平板，暗室中 360nm～ 366nm波长紫外灯照射下， 计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。
Certificate Number 9504 Method MFHPB-34 Official method for carcass sampling AFNOR Certificate Number 3M 01/2-09/89AC 2000 Edition
Standard analytical method Notification No. 25 KCFR Method 7.8.6.3 MAF Standards D107.1 Commission No. 35 July 1, 1999 Government Gazette, No. R.1555.21 of 21 EMMAS assessment 3M Petrifilm E. coli/Coliform Count Plate – 1998 AOAC 991.14, 998.98 Standard methods for foods and dairy 9 CFR Part 310.25, 9 CFR Part 381.94 Covenin 3276-97
大肠杆菌计数……第一法 操
作
步
骤
大肠杆菌计数……第一法
典型的 金属光泽
大肠杆菌计数……第一法
大肠杆菌与非大肠杆菌的生化鉴别
靛基质（I） 甲基红（M） VP试验（Vi） 枸橼酸盐（C） 鉴定（型别）
典型大肠杆菌 非典型大肠杆菌 典型中间型 非典型中间型
+ － + － － +
+ + + + － －
大肠杆菌计数……第二法
基本原理
4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷 4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG
游离出4-甲基伞形酮
带蓝色的荧光
大肠杆菌计数……第二法
美国食品药品管理局（FDA）：Bacteriological Analytical Manual ，2002，Chapter 4： Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria
大肠杆菌PetrifilmTM测试片
• 预先制备好的培养基系统 • 改良VRB培养基 •能验证产气，是一种确认性的 方法，而非筛选方法； • 24h确认大肠菌群，24-48h确 认E.coli; • 操作简单，结果稳定。
大肠杆菌PetrifilmTM测试片法

PetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌群测 试片是一种预先制备好的培养基 系统，含有VRB培养基，冷水可溶 性凝胶和葡萄糖苷酶指示剂，可 增强菌落计数效果。E .coli能产 生-葡萄糖甘酸酶与培养基中的 指示剂反应，产生蓝色沉淀环绕 在大肠杆菌菌落周围。表面覆盖 的胶膜，可截留发酵乳糖的大肠 菌群产生的气体。培养结束后计 数蓝点带气泡的菌落即为大肠杆 菌数，红点带气泡和蓝点带气泡 的菌落之和为大肠菌群数。