基因表达

DNA甲基化、组蛋白修饰及RNA分子的作用可在不同层面影响DNA分子的表达，其中任何环节出现错误都会导致不同的表达错误，从而引发人类疾病。

如果我们能控制DNA的表达，将可以使癌症、病毒引发的疾病（如肝炎、艾滋病）、血液疾病等得到治愈。

首先，简单谈下基因表达。

基因表达指的是基因转录及翻译的过程。

基因表达有两种方式：一种是组成性表达，指不大受环境变动而变化的一类基因表达。

另外一种是适应性表达，指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。

那么基因的表达有何规律呢？时间和空间的特异性是基因表达规律两大特点。

时间特异性指的是按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生。

空间特异性指的是在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现。

基因的表达调控无论是对真核生物还是原核生物都有着重要的作用，它能维持个体发育和分化，让个体更好的适应环境。

在基因表达里有个在存在于DNA分子中，RNA聚合酶能够识别、结合并导致转录起始的序列称为启动子。

真核生物根据转录的方式可将启动子分三类。

1、RNA聚合酶I的启动子主要由两部分组成。

目前了解较清楚的是人的RNA聚合酶I的启动子。

在转录起始位点的上游有两部分序列。

核心启动子（core promoter）位于-45至+20的区域内，这段序列就足以使转录起始。

在其上游有一序列，从-180至-107，称为上游调控元件（upstream control element，UCE)，可以大大的提高核心启动子的转录起始效率。

两个区域内的碱基组成和一般的启动子结构有所差异，均富含G．C对，两者有85％的同源性。

2、RNA聚合酶Ⅱ的启动子位于转录起始点的上游，由多个短序列元件组成。

该类启动子属于通用型启动子，即在各种组织中均可被RNA聚合酶n所识别，没有组织特异性。

经过比较多种启动子，发现RNA聚合酶II的启动子有一些共同的特点，在转录起始点的上游有几个保守序列，又称为元件（elememt）。

（1）帽子位点（cap site）帽子位点又称转录起始位点，其碱基大多为A（指非模板链），这与原核生物相似。

（2）TATA框（TATA box）TATA框位于-30处，又称Hogness框或Golderg-Hogness 框。

一致序列为TATAA(T)AA(T)经突变试验分析，它是三个元件中转录起始效率最低的一个。

虽然有些TATA框的突变不影响转录的起始，但可改变转录起始位点。

这说明TATA 框具有定位转录起始点的功能。

将TATA框反向排列，也可降低转录的效率。

TATA框周围为富含GC对的序列，可能对启动子的功能有重要影响。

它和原核生物的启动子有些相似。

TATA框具有选择起始点的功能。

在有些启动子中缺少TATA框。

（3）CAAT框（CAAT box）CAAT框位于转录起始点上游的-75如处，一致序列为GGC(T)CAATCT，因其保守序列为CAAT而得名。

虽名为CAAT框，头两个G的作用却十分重要。

它是最先被人们发现的转录起始元件。

虽名为CAAT框一般位于-80bp左右，但离转录起始位点距离的长短对其作用影响不大，并且正反方向排列均能起作用。

CAAT框内的突变对转录起始的影响很大，说明它决定了启动子起始转录的效率及频率。

对于启动子的特异性，CAAT框并无直接的作用，但它的存在可增强启动子的强度。

（4）GC框（GC box）GC框位于-90 bp附近，核心序列为GGGCGG，一个启动子中可以有多个拷贝，并且可以正反两个方向排列。

GC框也是启动子中相对常见的成分。

另外，在有些启动子中还发现了其他的元件，如八聚核苷酸元件（octamer element，OCT element），一致序列为ATTTGCAT；KB元件，一致序列为GGGACTTTCC；ATF 元件，一致序列为GTGACGT。

在转录起始点下游也有一些与启动子功能有关的元件。

各元件间的距离对启动子的功能没有太大影响，不同启动子中各元件的距离差异很大。

但如果距离太近（小于10 bp）或太远（大于30 bp），就会影响启动子的功能。

3、RNA聚合酶III的启动子可分为两类，识别方式不同。

5S rRNA和tRNA基因的启动子位于转录起始点的下游，称为内部启动子（internal promoter）。

snRNA基因的启动子位于转录起始点的上游，和其他基因的启动子比较相似。

启动子含有可被辅助因子识别的特殊序列，只有辅助因子与相应的序列结合后，RNA聚合酶才能与启动子结合，从而起始转录。

进一步研究确定，内部启动子可分为两类，每类启动子均含有两个短序列元件。

两个短序列元件间由其他序列隔开。

第一类内部启动子含A框（boxA）和C框（boxC）；第二类内部启动子含A框和B框(boxB)。

两个保守区域间由其他序列隔开。

第二类内部启动子的A框与B框间的间隔序列长短差异很大，但如果间隔序列过短，会影响启动子的功能。

转录起始点也可影响转录起始的效率，紧接转录起始点的上游序列的突变会影响转录的起始。

因此可以推断，内部启动子起被RNA聚合酶III识别的作用，转录起始点附近的序列控制转录起始的效率。

RNA聚合酶III的第三类启动子位于转录起始点的上游，含三个短序列元件，分别为TATA框、近端序列元件（proximal sequence element，PSE）和八聚核苷酸元件。

有一部分snRNA的基因由RNA聚合酶II转录，它们的启动子也有相似的结构，三个元件也有相似的功能。

TATA框决定着启动子与两种RNA聚合酶的作用。

RNA聚合酶只需要转录起始点加上一段含TATA框的短序列就能起始转录，但PSE和OCT元件能大大提高其转录效率。

PSE对RNA聚合酶n的启动子来说是必需的，对RNA聚合酶III的启动子只起刺激作用。

【瞬时转染实验及荧光素酶报告基因的检测
瞬时转染:外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。

一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。

】
启动子活性可以通过做瞬时转染实验来检测出。

启动子质粒与pSV-β-Galactosidase 共转染MCF7 细胞，测定各启动子质粒表达的荧光素酶Luc 值，及pSV-β-Galactosidase表达的β-gal 活性作为实验内对照。

启动子活性＝荧光素酶Luc 值/半乳糖苷酶β-gal 值。

荧光素酶检测样品收集使用Luciferase Assay Kit(Promega)。

上面谈了一些关于基因表达的概念，那么基因表达异常会出现什么问题呢？疾病！基因表达异常会导致诸如癌症，肝炎，艾滋等的疾病，对人类的日常生活造成很大影响。

RNA的调控包括小分子RNA（miRNA、siRNA、piRNA等）、核糖开关、假基因、反义RNA 的影响
1、小分子RNA
人们经过对基因组的分析发现大于50%的miRNA位于癌症相关序列处或易碎片段，这说明在基因的复杂调控网络中miRNA对癌症的治疗起到重要的推动作用。

近来研究表明，siRNA 可以通过对CSF-1或CSF-1受体表达的抑制对巨噬细胞进行下调，最终可以抑制肿瘤的生长。

另外人们发现注入siRNA或重组质粒可以防止小鼠的自身免疫性疾病和病毒性肝炎。

2、假基因
假基因指的是在基因组中存在的有缺陷的拷贝，其广泛存在于真核生物中。

根据其中是否很有内含子，假基因可以被分为两类：重复型假基因（duplicated pseudogenes）和经过加工的假基因（processed pseudogenes）。

假基因可以反映物种之间的进化关系。

同时，假基因在保证功能基因正常表达方面也起着非常重要的作用。

人们发现假基因的5’端与功能基因的5’端有700nt的相同序列，其转录产物可以与功能基因所转录合成的mRNA共同竞争RNase，从而保护了mRNA不受RNase
的降解。

DNA组蛋白的修饰及DNA的甲基化
1、DNA组蛋白的修饰
组蛋广泛存在于人体染色体中，与DNA分子结合以维持DNA分子的三维结构。

当组蛋白被修饰时，其带电性也会发生改变，从而影响其与DNA分子间的结合。

当组蛋白的正电性增强时，DNA分子与之结合将变得更紧密，从而DNA分子凝集化加强，不宜进行转录，反之则可增进DNA分子的转录。

当组蛋白被乙酰化时，染色质经常处于转录状态，RNA合成可以顺利进行。

而当组蛋白被甲基化或是磷酸化时，DNA则经常处于非转录状态。

组蛋白的修饰包括甲基化、乙酰化以及磷酸化等，可发生于H3或H4亚基的赖氨酸、精氨酸及色氨酸位点。

由于在DNA的复制过程中，组蛋白八聚体并不完全解体，H3-H4四聚体仍然与DNA结合，其修饰方式能够保留至子代DNA旧链。

而在子代DNA中，H3-H4四聚体能够募集相应的酶类对新链中的H3-H4四聚体进行相同的修饰，使得组蛋白的修饰方法得以完全传至子代。

2、DNA的甲基化
甲基化的DNA机可以避免被限制性内切酶降解、保持DNA的非转录活性，也可以对染色体的保护作用。

人类在配子形成过程中，发生去甲基化和甲基化。

去甲基化过程中DNA上的所有甲基化修饰几乎全部去除，当再次甲基化时则按照特定的模式对DNA进行再次的修饰。

甲基化过程有10%的差错率，但大部分都位于不重要的基因位点，不会对个体造成较大影响。

多种疾病是与表观遗传有关的，包括癌症、智力障碍、神经功能疾病、遗传印记疾病等多种威胁人类生命的疾病。

其中癌症主要包括肝癌、肺癌、肾癌、胃癌等。

基因的异常甲基化与癌症发生有密切的关系。

抑癌基因得过甲基化会导致癌基因的过量表达。

而DNA的低甲基化则会降低基因的稳定性。

胃癌与幽门螺旋杆菌的感染关系密切是我们早已熟知的。

近年来人们发现幽门螺旋杆菌的感染可以导致胃粘膜细胞中特定基因发生甲基化。

人们发现人类前列腺癌中GSTpi, APC, MDR1, GPX3 and 14-3-3sigma等多种基因发生高度甲基化并失活，同时也伴有组蛋白修饰。

组蛋白修饰主要为乙酰化和甲基化，这种修饰影响了多种基因的功能，包括编码雄性激素受体的基因。

而这种两种修饰是可以逆转的。

人们利用选择性DNA转甲基酶可以去除DNA的甲基化，同时利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂恢复组蛋白的乙酰化，从而使基因功能得到恢复。

基于表观遗传与人类疾病的密切关系，人们利用全基因组分析技术进行表观遗传测定，从而对人类疾病进行早期诊断、预知疾病的复发、对肿瘤进行精确分期以及分析不同基因在生理疾病理学上的不同表达。