生物发酵制药

发酵罐的类型
• 搅拌釜反应器 • 鼓泡式反应器 • 气升式反应器
发酵辅助设备
无菌空气系统
• 无菌空气的要求 灭菌系统、管道、阀门
培养基及其灭菌
培养基（medium）
培养基的成分 • 碳源、氮源、无机盐、前体物、促进剂、抑制剂
培养基的类型
• 按组成 • 按状态 • 按用途
培养基灭菌
工程菌和新型微生物的开发
• 新型的生理活性多肽和蛋白质类药物：干扰素、
白介素促红细胞生成素等；
• 新型菌体制剂和疫苗。
红细胞生成素
生长激素 胰岛素 干扰素
( 治疗贫血)
( 促进生长) (治疗糖尿病) (抗病毒、抗肿瘤)
第二节 发酵制药中的微生物
L/O/G/O
常见的制药用微生物
• 细菌
• 放线菌 • 真菌
• 20世纪40年代初，第二次世界大战爆发，青霉素 迅速工业大规摸生产。 • 深层培养、生产大规模化、多种抗生素、氨基酸、 核酸发酵成功。
第四阶段 • 20世纪50年代，利用代谢调控发酵氨基酸、核酸。 • 20世纪70年代，利用固定化酶或细胞连续发酵。 • 20世纪80年代，基因工程、蛋白质工程、细胞融合 技术等高新技术应用阶段。
温度
pH
溶氧 泡沫 染菌 发酵终点的判断
菌体浓度
• 在适合的生长速率下，发酵产物的产率与菌体浓 度成正比关系。特别是初级代谢产物。 • 菌体浓度过低，产物产率下降。 • 菌体浓度过高，产生其他影响。 • 措施：调节培养基中的营养物质的浓度。
营养物质
• 碳源 • 氮源 • 磷酸盐：生长亚适量浓度 • 补料：半饥饿状态
tsinanesisn) 产创新霉素(creatmycin；1964)
真菌之根霉属(Rhizopus)
• 生产甾体激素、延胡索酸及酶制剂等。
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真菌之曲霉属(Aspergillus)
• 生产枸橼酸、葡萄糖酸、有机酸类、抗生素，进 行甾体转化。
真菌之青霉属(Penicillum)
• 产黄青霉(Penicillum chrysogenum)
抗生素、生物碱、毒素、色素、胞外多糖等
结构常较复杂对环境条件敏感
4、微生物转化发酵
利用微生物细胞的一种或几种酶，对外源化合物的
特定部位进行加工，如加入羟基、还原双键、脱氧
或切断支链等。 反应最显著的特点是特异性强，包括反应特异性、
结构位置特异性、立体特异性。 如： 甾体转化：环戊烷多氢菲核的化合物
主要指标与中间分析项目雷同
安全性：非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素
发酵菌种的选育方法
从自然界中获得新菌种 诱变育种 杂交育种
原生质体融合
基因工程
从自然界中获得新菌种
土壤、空气、动植物等，严重污染的水域，极端
环境等 基本程序： • 采样预处理富集培养筛选鉴定野生型
菌株
诱变育种
物理或化学方法诱发突变
微生物发酵类型
1、微生物菌体的发酵
SCP、药用真菌（冬虫夏草、茯苓等）
生物防治制剂（如苏云金杆菌）
活性乳制剂
细胞的生长与产物的积累成平行关系，
生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段
2、微生物酶发酵
各种酶制剂 糖化酶、α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等 天冬酰胺酶： 抗癌
纳豆激酶、链激酶： 治疗血栓
青霉素酰化酶：青霉素生产
细菌之乳酸杆菌属 (Lactobacillus)
• 生产抗癌类药物
放线菌
• 抗生素12000余种，60%左右来自放线菌，经济 价值大。
放线菌之链霉菌属 ( Streptomyces )
灰色链霉菌(Streptomyces griseus)
金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens) 红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus) 龟裂链霉菌 (Streptomyces rimosus)
细菌之大肠杆菌属(Escherichia coli)
• 生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等氨基酸类药物 • 基因工程的载体
细菌之短杆菌属(Brevibacterium)
• 维生素B12、氨基酸、核苷酸类药物生产中常用的
菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种。
细菌之棒状杆菌属(Corynebacterium)
微生物发酵制药
L/O/G/O
第一节 概述
L/O/G/O
微生物发酵制药的定义
利用微生物技术，通过高度工程化的新型综 合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于 微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来 合成一定产物，通过分离纯化进行提取精制，并 最终制剂成型来实现药物产品的生产。
发酵工程的4个阶段
温度
• 考虑菌种及生长阶段 • 综合考虑其他培养条件 • 考虑菌种生长情况
• 发酵热
pH
• 补加酸或碱和补料的方式
溶氧和CO2
• 溶氧异常下降 • 溶氧异常上升 措施
泡沫
• 负面影响 • 措施
染菌
• 发酵前期染菌
• 发酵后期染菌
发酵终点的判断
• 提高产物的产量和经济效益 • 降低生产成本
适用范围 各种微生物的短期保藏。 各种微生物的中短期保藏， 不适用某些能分解烃类的菌 种。 产孢子微生物和芽孢细菌的 长期保藏，不适用对干燥敏 感的微生物 产孢子霉菌和某些放线菌， 工厂多采用此法 基因工程菌
保藏期 1-6个月 1-2年
砂土管保藏法
1-10年
麸皮保藏法 甘油悬液保藏法
1年 1年/10年
砂土管保藏法
麸皮保藏法
甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法 宿主保藏法
方法名称 斜面低温保藏法 石蜡油封存法
主要特点 传代培养，4℃保藏 石蜡油隔绝空气，室温 或4℃保藏 沙土管作载体，干燥器 中抽真空，室温或4℃保 藏 麸皮作载体，干燥，4℃ 保藏 悬浮于10-15%甘油中， 需低温冰箱
可的松（Cortisone）
药用发酵产品分类
生物来源 作用对象 作用机制 化学结构
细菌 真菌 放线菌
抗菌药 抗肿瘤药 抗病毒药 除草剂 酶抑制剂 免疫调节剂
抑制细胞壁合成药
抗生素 影响细胞膜功能药 维生素 氨基酸 干扰蛋白质合成药 核苷酸 抑制核酸合成药 甾体激素 抑制生物能量反应药 酶及酶抑制剂
物理诱变剂：紫外线、X-射线、γ-射线等
化学诱变剂：氮芥、亚硝酸、5-氟尿嘧啶等
杂交育种：借助有性重组，使不同菌株的遗传
物质得以交换
原生质体融合育种：借助原生质融合技术实现
遗传物质的交换
基因工程育种：DNA体外重组技术定向育种，
技术含量高，应用面广
菌种保藏(Culture conservation)
第三节 发酵设备及消毒灭菌
L/O/G/O
发酵的一般流程
培养基配制 种子扩大培养 空气除菌 发酵设备
培养基灭菌
发酵生产
下游处理
发酵设备——发酵罐
发酵罐的特点
轴封严密，泄漏少 能承受一定压力、温度
搅拌通风装置保证气液充分混合
具有足够的冷却面积
死角少，灭菌彻底
适宜的径高比（高与直径的比值为2.5—4）
需要诱导或遭受阻遏、抑制等调控作用，在菌种
选育、培养基配制以及发酵条件等方面需注意。
3、微生物代谢产物发酵
初级代谢产物： 与菌体生长相伴随的产物、对菌体生长、分化和繁殖是必须的 氨基酸、核苷酸、维生素、糖类等 菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累 次级代谢产物：
与菌体生长不相伴随，以初级代谢的中间产物为原料而合成
发酵工程制药的特点
• 微生物菌种选育获得高产
• 发酵的理论产量存在约10%的变量
• 发酵过程常温常压，操作条件温和
• 纯种培养、无菌条件
• 生产过程是以生物体的自动调节方式进行的
• 分子水平生产，定向发酵、突变、杂交等手段
• 投资少、见效快
发展趋势
• 利用DNA重组技术和细胞工程技术的发展、新的
• 空罐灭菌 • 实罐灭菌 • 连续灭菌
第四节 发酵工程制药的 过程与控制
L/O/G/O
种子的扩大培养
微生物发酵方式
• 分批发酵
• 补料分批发酵 • 半连续发酵 • 连续发酵
发酵过程中的中间分析项目
产物产量
pH 糖 氨基氮 菌丝形态
发酵过程的影响因素及控制
菌体浓度
营养物质
香豆精苷、生物碱、有机酸（主含延胡索酸），以及微量
元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。
发酵菌种的选育要求
生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代
谢产物的产量高，其它类似代谢产物少
操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离
稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳
定、不易变异退化
目的：保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，
防止被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不 发生变异。
菌种保藏三要素
典型菌种的优良纯种的休眠体；
创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、 避光、缺少营养）； 尽可能采用多种不同的手段保藏同一菌株。
菌种保藏的常用方法
斜面低温保藏法
石蜡油封存法
冷冻真空干燥保藏法
用保护剂制备悬液，快 速冻结，减压抽真空， 需冻干机
各类微生物
5-15年
液氮超低温保藏法
保护剂，超低温（各类微生物 196℃），需超低温液氮 设备 与培养基混合直接低温 保存 专性活细胞寄生微生物（如 病毒）
15年以上
宿主保藏法
菌种保藏机构
• ＡＴＣＣ • ＣＣＣＣＭ • ＮＣＴＣ
产链霉素
产金霉素 产红霉素 产土霉素
放线菌之诺卡氏菌属 (Norcadia)
• 生产利福霉素、蚊霉素等
放线菌之小单胞菌属 (Micromonospora)
• 多种可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M. echinospora) 产庆大霉素。
放线菌之游动放线菌属 （Actinoplanes）
• 典型代表：济南游动放线菌 (Actinoplanes
啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)：生产啤 酒、酒精、药用酵母等；核酸、麦角固醇、细胞 色素C、凝血质和辅酶A等。 红酵母 (Rhodotorula)：β-胡萝卜素 棉病针孢酵母(Nematspora gossypii)：核黄素
真菌之其它
牛肝菌属：含有人体必需的8种氨基酸，还含有腺膘呤、 胆碱和腐胺等生物碱。 灵芝属：灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、16种氨基酸(其 中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、甾类、甘露醇、
• 生产氨基酸、核苷酸类药物，用于甾体转化
• 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌，
• 如北京棒杆菌AS1.299钝齿棒杆菌AS1.542
细菌之芽孢杆菌属(Bacillus)
• 生产氨基酸、核苷酸、抗生素类、维生素B12、用 于甾体转化等。
细菌之假单胞菌属 (Pseudomonas)
• 生产维生素B12、氨基酸、核苷酸类； • 进行类固醇（甾体）转化； • 有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。
生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄 糖酸、柠檬酸和抗坏血酸
真菌之头孢霉菌属(Cephalosporium)
• 产黄头孢霉(Cephalosporium chrysogen)、
• 顶孢头孢霉菌(Cephalosporium acremonium) 都生产头孢菌素C
真菌之酵母菌属(Saccharomyces)
第一阶段
• 1676年制成第一台显微镜 ——微生物的存在 • 1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起 的 • 1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒 精——酶
第二阶段
• 对发酵技术的认识起始于19世纪末，主要来自于
厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳
酸和各种发酵食品。
第三阶段