发酵设备及消毒灭菌
第四章-发酵工程的灭菌与空气除菌
7、杀灭细菌芽孢的温度和时间
成熟的细菌芽孢除含有大量的钙-吡啶二羧酸成分外，还处于脱水 状态，成熟芽孢的核心只含有营养细胞水分的10%～30%。这些特性 大大增加了芽孢的抗热和抵抗化学物质的能力。
在相同温度下杀灭不同细菌芽孢所需时间不同，一方面因为不同 细菌芽孢对热的耐受性不同，另外培养条件的不同也使耐热性产生差 别。
在发酵过程中夹杂其它杂菌会造成严重的后果
如，生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；在连 续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得 更快，结果使发酵罐中以杂菌为主；杂菌及其产生的物 质，使提取精制发生困难；杂菌会降解目的产物；杂菌 会污染最终产品；发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发 生溶菌现象。
优点：无需专一灭菌设备，操作简便。 缺点：加热和冷却时间较长，易发生过热破坏营养分的现象，发 酵罐利用率低。 灭菌流程：培养基的加热一般用直接蒸汽通入罐内，冷却是冷却 水通入蛇管或夹层间接进行。灭菌时间过程包括：加热、维持、 冷却所需要的时间。
• 流程操作：先预热一定时 间，使物料溶胀均匀受热， 预热90℃以上时，将蒸汽 直接通入培养基及罐中，
一、定义 1、培养基灭菌的定义
是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及 其孢子，或从中将其除去。工业规模的液体培养 基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。 2、灭菌与消毒的区别 • 灭菌（sterilization）：用物理或化学方法杀死或 除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽 孢和孢子 • 消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿 内外的病源微生物。
表 多数细菌芽孢的灭菌温度与时间
8、影响培养基灭菌的因素
（1）培养基成分
培养液中油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性。高 浓度盐类、色素能削减其耐热性。
第四章发酵工业的无菌技术
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
3. 预防
培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
喷淋冷却连续灭菌流程
蒸汽
蒸汽
放汽
冷却水
无菌培养基 进发酵罐
配料罐
连消泵 连消塔
维持罐
冷却罐
生培养基
真空冷却器 无菌培养基进发酵罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
养基加热至1000C以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。
将配置好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、 保温和冷却等灭菌过程。——高温短时
（三）连续灭菌（连消）
工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程
灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。
本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐
2.3发酵罐及灭菌方法
第一节 物理消毒灭菌法
热力灭菌法 辐射杀菌法 滤过除菌法 超声波杀菌法 干燥与低温抑菌法
一. 热力灭菌法
干热灭菌法— 焚烧：废弃物、尸体 灼烧：接种环、试管口 干烤：玻璃器皿 红外线：医疗器械 湿热灭菌法（moist heat sterilization)— 巴氏消 毒法：61.6-62.8 ℃30min或71.7℃15-30s,主要用于 牛乳消毒。 煮沸法；流动蒸汽消毒法 间歇蒸汽消毒法； 高压蒸汽灭菌法
消毒剂的种类：酚类、醇类、重金
属盐类、氧化剂、表面活性剂、烷 化剂。
消毒剂的应用：病人排泄物与分泌
物、皮肤、粘膜、饮水、厕所、空 气、手。
第三节 影响消毒灭菌效果的因素
消毒剂的性质、浓度与作用时间 微生物的种类与数量 温度 酸碱度 有机物
发酵罐按容积分类
一般认为500L以下的是实验室发酵罐；
500-5000L是中试发酵罐；
5000L以上是生产规模的发酵罐。
现代发酵工程规模
低值工业品大型化
以规模来取胜 （几十数百吨）。如味精、氨基酸、 有机酸、抗生素、饲料、食品工业用 产品等；
高价值转基因产品小型化（几十数
百升）。基因工程大肠杆菌、酵母菌 高密度培养；动物细胞植物细胞培养；
二. 辐射杀菌法
紫外线 波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用。 其主要作用于DNA，使一条DNA链上相 邻的两个胸腺嘧 啶共价结合形成二聚体， 导致细菌变异和死亡。 电离辐射 高速电子、X射线、γ射线 微波 波长1mm~1m
三. 滤过除菌法
赛氏滤器
玻璃滤器
薄膜滤器
四. 超声波杀菌法
工业发酵灭菌与消毒
间接蒸汽加热灭菌
优点 保留较多的营养质量 容易放大，较易自动控制 糖受蒸汽的影响较少 缩短灭菌周期 在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少 发酵罐利用率高，蒸汽负荷均匀。
缺点 设备比较复杂，投资较大罐灭菌： 实罐灭菌时，与培养基一起灭菌 连续灭菌时，发酵罐需在培养基灭菌前进行空消
（2）培养基成分
培养基中的油脂、糖类、蛋白质等有机化合物，会在微生物细胞周围形成一层 薄膜，影响热的传导，增加了灭菌难度。
（3）培养基含菌量
不同成分的培养基其含菌量是不同的，天然基质培养基，特别是营养丰富或变质的原料中 含菌量远比化工原料的含菌量多，因此灭菌时间要适当延长。含芽孢杆菌多的培养基，要适 当提高灭菌温度和延长时间。
优点：能耗低；空气压力损失 小；除尘效率高
缺点：高压技术，设备庞大
三、介质过滤除菌
（一）绝对介质过滤 机制：微生物大于孔径 介质：微孔滤膜、微孔虑棒、折叠微孔膜滤心
(孔径0.2 um)
(二)深层过滤介质
1.深层介质过滤器除菌的机制
重力沉降：可以忽略 惯性冲击：空气流速大时，起主导作用 阻截：空气流速小时，起主导作用 扩散：布朗运动 静电吸附
连续灭菌（连消）：将培养基在罐外连续进行加热、维持和冷却然后进入到灭 菌反应器的灭菌方法就是连续灭菌。
（1）分批灭菌
在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温 三个过程。
实消的步骤：配料→夹套进蒸汽→液面以下进蒸汽入培养基→直接升温→ 液面以上排汽打开 → 恒温→通无菌空气→降温
•分空气过滤器在发酵罐灭菌之前进行灭菌，灭菌后用空气吹干备用。 •管路可与罐同时进行灭菌，但保温时间为1h。上述各种管路在灭菌之前，要进行严格检查，以防泄 漏和“死角”的存在。
发酵灭菌与消毒方法
发酵灭菌与消毒方法的选择作者飞扬发表于2010年8月13日消毒与灭菌方法的选择1. 前言在制药、食品、轻工及医疗卫生等各行业领域，常需要对某些物品或产品、以及使用和生产这些物品或产品所需的原辅料、包装材料、设备、工器具、生产设施与环境进行必要的消毒和灭菌，甚至包括操作人员同样需要采取必要的消毒与灭菌措施，以确保经消毒与灭菌后的物品或产品符合规定的质量标准。
消毒与灭菌是既相似又有区别的二类概念，必须根据处理物品的用途和危险程度区别对待，以确定是采用消毒或灭菌工艺；其次由于消毒与灭菌处理的直接对象是待处理物品上被污染的微生物，随微生物种类、性状和抵抗力的不同，可供选择的消毒与灭菌方法也可有所不同；再者，在用消毒与灭菌方法杀灭或去除各种微生物的同时，也使被微生物污染的物品处于相同的消毒灭菌过程中，而这些物品或产品的使用价值、理化性状及除被微生物污染外的其它影响消毒灭菌效果的情况等又是消毒与灭菌方法选择时需不得不加以综合考虑的重要因素。
因此，为能合理选择消毒与灭菌方法，有必要对消毒与灭菌的基本概念、微生物的基本知识、各种消毒与灭菌方法的基本特点、适用范围及影响消毒灭菌效果的基本因素有个全面的认识与了解；而且一旦选择了消毒灭菌方法，还需对其操作的有效性、可靠性与安全性进行严格的验证。
. 消毒与灭菌的基本概念灭菌是指杀灭或去除外环境中一切微生物的过程，包括病原和非病原微生物及细菌芽孢，使之完全无菌。
消毒是指杀灭或去除外环境中病原微生物的过程，使之无害化，不致引起感染或致病。
从上述定义可知，消毒和灭菌都要求杀灭或去除外环境中的微生物，只是杀灭或去除的目标微生物和程度不同,即消毒处理不一定都能达到灭菌要求，而灭菌一定可达到消毒的目的。
另外需指出的是，对灭菌而言，其达到的无菌状态，一方面虽指不含有任何活体微生物，但并不排除杀灭以后非活体微生物残骇的存在；另一方面，从定义上来说无菌是一个绝对的概念，但作为一项设定的质量标准，它受到必须具备的三个基本条件：现实性、可验性和安全的限制，因而从現实情况而言，无菌是相对的。
发酵工程的灭菌与除菌2讲课文档
因为过滤介质层是由无数的纤维纵横交 错组成的，形成的网格阻碍气流前进，使气 流无数次地改变运动速度和运动方向，这些 改变引起空气中微粒的惯性冲击、拦截、扩 散、重力沉降和静电吸附等作用，于是大大 增加了微粒被纤维捕获的几率。
32
第三十二页，共一百一十九页。
(1)惯性冲击截留作用：撞上去被吸附；
相对热阻：是指某一微生物在某一条件下的致死时间与另一微 生物在相同条件下的致死时间之比。
第十五页，共一百一十九页。
灭菌方式
大肠杆菌
细菌或酵母 营养细胞
细菌芽胞 霉菌孢子
噬菌体 和病毒
干热
1
湿热
1
苯酚
1
甲醛
1
紫外线
1
1
1000
2~10
1
1
3×106
2~10
1~5
1
10×108 1~2
30
1
250
2~10
我国在GMP验证过程中人们大力推荐臭氧灭菌方法。臭氧 灭菌有许多特点：
① O3为气体，能迅速弥漫到整个灭菌空间，灭菌无死角，浓度分
布均匀。
②臭氧灭菌为溶菌级方法，杀菌彻底。杀菌能力与过氧乙酸相
当，高于其它消毒剂。
③杀菌广谱，可杀灭细菌繁殖体和芽孢、病毒、真菌等， 并可破坏肉
毒杆菌毒素。另外，O3对霉菌也有极强的杀灭作用。
病毒 霉状分枝杆菌
细胞：宽×长/μm 1.0~1.5×1.0~2.5 1.3~2.0×8.1~25.8 0.5~1.0×1.0~3.0 0.5~0.7×1.8~3.3 0.9~2.1×2.0~10.0 0.6~1.6×1.6~13.6 0.5~1.1×1.6~4.8 0.5~1.0×0.5~1.0 3.0~5.0×5.0~19.0 0.0015~0.225×0.0015~0.28 0.6~1.6×1.6~13.6
发酵实验灭菌方法
发酵实验灭菌方法一、干热灭菌法干热灭菌法是指在干燥环境中进行高温灭菌的方法。
通常是将待灭菌的物品放在烘箱、干燥箱或火焰中加热，以达到灭菌的目的。
此方法的优点是能够杀死绝大多数微生物，而且对不耐湿热的物品尤为适用。
然而，干热灭菌所需温度较高，时间较长，可能会对某些物品造成损坏。
二、湿热灭菌法湿热灭菌法是指利用高温水蒸气进行灭菌的方法。
在发酵实验中，常用的湿热灭菌设备有高压蒸汽灭菌器和常压蒸汽灭菌器。
湿热灭菌法的优点是杀菌效果好，对大多数微生物都能有效杀死，而且对物品的损伤较小。
但是，湿热灭菌法需要一定的时间和能源，而且在使用过程中要注意防止物品受潮。
三、紫外线灭菌法紫外线灭菌法是利用紫外线照射杀灭微生物的方法。
紫外线具有较好的杀菌作用，而且对人体的伤害较小。
在发酵实验中，可以使用紫外线灯对实验室内空气、表面和物品进行消毒。
然而，紫外线灭菌法对于隐藏在角落或缝隙中的微生物效果不佳，而且长时间照射可能会对某些物品造成损坏。
四、过滤除菌法过滤除菌法是指通过过滤介质去除微生物的方法。
在发酵实验中，常用的过滤除菌设备有滤膜过滤器和超滤器。
过滤除菌法的优点是不加热、不损伤物料、操作简便等。
但是，过滤除菌法只能去除液体中的微生物，对于气体和固体颗粒中的微生物效果不佳。
此外，过滤介质需要定期更换或清洗，以保证过滤效果。
五、化学消毒剂灭菌法化学消毒剂灭菌法是指利用化学消毒剂杀灭微生物的方法。
常用的化学消毒剂有酒精、漂白粉、甲醛等。
这些消毒剂具有较好的杀菌作用，而且使用方便。
然而，在使用化学消毒剂时要注意安全，避免对人体造成伤害，同时也需要注意防止消毒剂残留对实验结果造成影响。
六、辐射灭菌法辐射灭菌法是指利用放射性物质发射的射线杀灭微生物的方法。
常用的辐射源有钴-60和铯-137等放射性同位素。
辐射灭菌法的优点是杀菌效果好、时间短、操作简便等。
但是，辐射灭菌法的设备投资较大、成本较高，而且放射性物质有一定的危险性，需要专业人员操作和维护。
发酵过程中控制杂菌的方法
发酵过程中控制杂菌的方法
1.设备与环境消毒：
-在发酵前，应对所有接触发酵物料的设备，如发酵罐、管道、过滤器、阀门等进行全面、彻底的清洁和消毒，可使用高温蒸汽灭菌、化学消毒剂浸泡等方式进行消毒处理。
2.培养基灭菌：
-制备的发酵培养基必须在严格的无菌条件下操作，通过高压蒸汽灭菌或其它适用方式彻底灭菌，确保无任何杂菌存在。
3.无菌操作技术：
-接种、转接、取样等操作应在无菌操作台上进行，操作人员需要穿戴无菌防护装备，遵循无菌操作规程，避免引入杂菌。
4.种子纯化：
-使用纯净、活性良好的种子进行接种，必要时对种子进行多次传代净化，剔除可能携带的杂菌。
5.温度与pH控制：
-发酵过程中适当调整和控制温度、pH值等参数，创造有利于目标菌株生长而不利于杂菌滋生的条件。
6.监控与检测：
-定期对发酵过程进行监测，包括pH值、溶解氧、浊度等指标的变化，及时发现异常。
并对发酵液进行微生物检测，一旦发现杂菌污染，立即采取相应措施。
7.添加抑菌剂：
-在某些情况下，可在发酵过程中添加适量的抑菌剂或抗生素来抑制杂菌生长，但这需要考虑对目标菌株的影响。
8.应急措施：
-若发现早期染菌，可通过降低培养温度、调整补料策略、补充杀菌剂或抗生素等手段尝试挽救；若中后期染菌且不影响产品质量，则可考虑提前终止发酵。
9.优化工艺流程：
-改进工艺流程，如采用一次性使用系统、密闭连续流发酵技术等，减少人为操作带来的污染风险。
发酵灭菌、染菌知识(发酵篇)
• 2.1.3在灭菌过程中要控制好培养基的泡沫 灭菌时，随着罐温的上升，培养基中的有机氮源 因配比、品种、装量的差异，或者由于用汽不当会产 生大量的泡沫。这些泡沫的内部是空气，由于空气的 比热大，液体的比热小，泡沫便成为隔热层，蒸汽热 量难以穿透，杂菌不易被杀灭。尤其是发生泡沫顶罐 逃液，或在培养液表面形成厚厚的泡沫层都易使培养 基灭菌不彻底，是灭菌操作应防止的弊病。选择适当 的原料配比和培养基装量，提高原材料质量，消前适 量补加油脂或者化学消泡剂，讲究合理的用汽操作可 以防止在培养基灭菌过程中泡沫失控。
实消过程中常见的问题
• 1) 实消过程中罐压上升缓慢是什么原因? 实消过程中加热升温升压的时间一般控制在 30～40分钟，即可使蒸汽压力到达0.1MPa，温度达 到118~120℃。这是正常的控制范围。如果超出以上 时间，仍然达不到要求，需进行如下检查： (1)总蒸汽压力是否低于0.2Mpa。 (2)罐上夹层或蛇形管进水阀、回水阀是否泄漏。 (3)夹层或蛇管内冷水能否畅通排除。 (4)进汽支管及阀门有无堵塞。 (5)罐上压力表是否灵敏。 (6)各支管进汽量控制是否适当。
• 4) 如何防止灭菌过程中发酵罐玻璃视镜破裂? （1）灭菌过程中严禁超压工作。 （2）经常检查发酵罐压力表灵敏度，防止失灵。 （3）视镜紧固螺丝应受力均匀，不偏紧。 （4）预热时，要待罐温上升后再开冲视镜蒸汽阀进汽。 （5）灭菌时，视镜上应有遮盖物。 （6）严禁在灭菌过程中贴着透视镜窥视。
3﹑染菌的后果﹑预防及 处理
总之，实罐灭菌时必须注意操作过程中的合理用汽。 (1)预热升温不宜太快，升温至100℃一般不少于40 分钟，尽量排尽罐内冷空气。 (2)避免蒸汽压力的骤增骤减，维持蒸汽压力的稳定 和防止泡沫顶罐逃液。 (3)保温时应注意各路蒸汽进汽的压力，使之均匀畅 通无短路无堵塞。 (4)保温过程中，罐压和温度应相对应，防止产生假 压力和假温度。 (5)进排汽的流量控制恰当，注意节约用汽。 (6)严防高温高压闷罐导致培养基营养成份的破坏。
发酵技术资料汇编之消毒灭菌篇
发酵技术资料汇编之消毒灭菌篇消毒与灭菌人们通过消毒、灭菌、防腐和无菌等手段，以达到控制、消灭有害微生物的目的。
1、概念① 灭菌（sterilization）灭菌是利用理化方法，杀死物体或介质中的所有微生物，包括致病的和费致病的各种微生物，以及细菌的繁殖体和孢芽。
灭菌后的物品即成无菌状态。
灭菌适用于必须无任何微生物存在的物品，如注射液、静脉输入用液体和外科手术器械、培养基等。
② 消毒（disinfection）消毒是利用理化方法，杀死物体或介质中的病原微生物，但不一定能杀死细菌的芽孢和某些抵抗力强的非病原微生物。
通过消毒可以达到防止病原微生物传播的目的。
具有消毒作用的药品，称为消毒剂（disinfectant）。
③ 防腐（antisepsis）亦称抑菌，是指抑制微生物的生长繁殖，一般用于保存药品、食品、生物制品等。
用于防腐的药物称为防腐剂（antiseptic agent）。
有些防腐剂在增加浓度或延长作用时间时，则具有杀菌作用。
④ 无菌（asepsis）是没有活菌存在的意思，防止微生物进入机体或物体的方法，称为无菌操作。
无菌操作所用的器具和材料，事先都要经灭菌处理。
2、物理消毒、灭菌的方法（1）热力灭菌。
又分为干热灭菌和湿热灭菌法，在同一温度下湿热灭菌比干热灭菌效果好，这是因为：蒸汽的穿透力比干热空气强；微生物蛋白吸收水分后，比干热状态下更易于变性和凝固；蒸汽与物体表面接触后，凝固成水并放出潜热，使被灭菌的物品温度迅速提高，加快生物的死亡。
（2）低温低温不能灭菌，但仅能抑制其生长。
冷冻和融化交替使用，对于细菌细胞则具有更大的破坏力。
（3）辐射（4）过滤除菌是用滤器，机械地滤去液体或空气中的细菌的方法。
滤过除菌只用于不耐热、也不能以化学方法处理的液体或气体，如抗生素、维生素、抗霉素、血清、酶的溶液等。
（5）干燥微生物在干燥情况下，能停止生长繁殖。
（6）超声波发酵罐染菌问题！发酵过程中染菌的检查判断○杂菌的检查方法目前生产上常用的检查方法有：①显微镜检查；②平板划线检查；③肉汤培养检查。
微生物发酵制药技术基础—培养基和设备的灭菌
K1
K `1
ln（ K 2 ） ln（ K`2 ）
K1
K `1
即随着温度的上升，微生物的死亡速率常数增加倍数要
大于培养基成分破坏速率的增加倍数。
从上述的分析可知，在热灭菌过程中，同时会发生微生 物死亡和培养基破坏这两种过程。温度升高，菌体死亡 速率大于培养基成分破坏的速率。
不同灭菌温度、时间与培养基成分破坏情况（Ns/No=10-3）
缺点： • 设备较庞大； • 维持罐直径较大，不能保证物料先进先出，易发生
局部过热或灭菌不足的现象； • 喷淋冷却管道很长，对于黏度较高、固形物含量较
多的培养基极易堵塞。
2.喷射加热器加热的连续灭菌流程
优点：能保证培养液在喷射加热器和维持管中的先进 先出，避免了培养基过热和灭菌不彻底现象，培养基 总的受热时间短，营养物质的损失不严重。
依设备和工艺条件的不同，连续灭菌分：
• 连消塔加热的连续灭菌流程 • 喷射加热器加热的连续灭菌流程 • 薄板换热器加热的连续灭菌流程
1.连消塔加热的连续灭菌流程
这是国内味精厂普遍采用的连续灭菌流程。培养基用泵打入连 消塔与蒸汽直接混合，在连消塔内的停留时间为20～30s，达 到灭菌温度132℃。再送入维持罐保温，时间8～25min，最后 由喷淋冷却器冷却至后续的发酵或培养温度。
连续灭菌的优缺点
优点 • 短时间内加热到保温温度且能快速冷却，减少养分的损失 • 操作条件恒定，灭菌质量稳定 • 易于实行管道化和自动化控制 • 避免反复加热和冷却，提高了热利用率 • 发酵设备利用率高
缺点 • 设备要求高，需另外设置加热冷却装置 • 操作比较麻烦 • 染菌机会多 • 对蒸汽要求高 • 不适合大量固体物料的灭菌
（二）对数残留定律
发酵清洁生产及染菌防治第二章 消毒与灭菌
（ 1 ）干热灭菌法
利用热空气将微生物体内的蛋白质氧化进行灭菌。
火焰灭菌（灼烧），利用火焰直接将微生物杀死。是一种最彻底 的干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种针等少数对象的灭 菌。也可以产生一定的无菌区域。
种子罐接种火焰在点 火时最好在点火槽内 加入一定的助燃物 （如棉花等）确保火 焰的稳定及燃烧足够 高度以扩大无菌区域 的范围！同时在雨季 或大风环境下能防止 火焰突然熄灭导致的 染菌。
蛋白质含水量和凝固温度关系
蛋白质含水量％
50 25 18 6 0
30分钟内凝固温度 ℃ 56
74～80 80～90
145 160～170
同时，湿热蒸汽的穿透力要比干热穿透力要强 得多。如下表所示：
干热与湿热的穿透比较
温度 时间 透过布层温度（℃
（℃ （小
）
） 时） 20层 40层 100层
干热 130～ 1 85 72 70以
2、消毒时应重点关注：地沟、积料积水点、 取样口、接种口、投料/移种站、排气房周边、 清液泵等微生物易滋生的地方消毒。
3、针对地沟等积料较多处，消毒前必须将现 场打扫干净后再进行消毒工作，确保消毒效果。
发酵车间环境属 于敞开式环境， 每天进行的现场 消毒主要还是针 对现场积水积料 处可能或已经成 为微生物繁殖的 “温床”进行消毒 灭菌。我们在平 时生产中要重点 关注的就是现场 的积水积料及时 清理，以及如何 减少现场的跑冒 滴漏。
主要原理
在一定温度范围内，温度越低，细菌繁殖越慢；温度越高， 繁殖越快。但温度太高，细菌就会死亡。不同的细菌有不同的最 适生长温度和耐热、耐冷能力。
巴氏消毒其实就是利用病原体不是很耐热的特点，用适当的温度 和保温时间处理，将其全部杀灭。但经巴氏消毒后，仍保留了小 部分无害或有益、较耐热的细菌或细菌芽孢，因此巴氏消毒牛奶 要在4℃左右的温度下保存，且只能保存3~10天，最多16天。
发酵罐灭菌流程
发酵罐灭菌流程发酵罐灭菌流程一、背景介绍发酵罐是微生物发酵过程中最重要的设备之一，其内部环境对微生物生长和代谢有着至关重要的影响。
因此，在使用发酵罐前必须进行灭菌处理，以消除内部的微生物污染，确保发酵过程的纯度和稳定性。
二、准备工作1.选择合适的灭菌方法：常用的灭菌方法有高温高压灭菌、化学灭菌和紫外线灭菌等。
根据具体情况选择合适的方法。
2.准备灭菌设备：根据所选用的灭菌方法准备相应的设备，如高温高压锅、化学消毒液、紫外线辐射器等。
3.清洁发酵罐：在进行灭菌处理前，必须将发酵罐内部进行彻底清洁，以去除表面附着的污垢和微生物。
三、高温高压灭菌流程1.装载发酵罐：将清洗干净的发酵罐放入高温高压锅中，并加入适量的水。
2.加热升温：启动高温高压锅，将水加热至100℃以上，使发酵罐内部达到高温状态。
3.保持时间：在高温状态下保持一定的时间，通常为30分钟以上，以确保发酵罐内部完全灭菌。
4.冷却降温：关闭高温高压锅，待发酵罐内部冷却至室温后取出。
四、化学灭菌流程1.准备消毒液：根据使用说明配制适量的消毒液，并将其倒入清洗干净的发酵罐中。
2.浸泡消毒：将发酵罐放置于消毒液中浸泡一定时间，通常为30分钟以上。
3.漂洗清洗：取出浸泡过的发酵罐，在清水中反复漂洗和清洗，以去除残留的化学物质和微生物。
4.干燥贮存：将清洗干净的发酵罐晾干后进行贮存备用。
五、紫外线灭菌流程1.装载发酵罐：将清洗干净的发酵罐放入紫外线辐射器中。
2.辐射灭菌：启动紫外线辐射器，对发酵罐进行一定时间的辐射灭菌，通常为30分钟以上。
3.取出贮存：关闭紫外线辐射器，将发酵罐取出并进行贮存备用。
六、注意事项1.在进行灭菌前必须进行彻底的清洁工作，以确保发酵罐内部无残留物和微生物。
2.不同的灭菌方法具有不同的优缺点，应根据具体情况选择合适的方法。
3.在高温高压灭菌过程中要注意安全，避免烫伤和压力爆炸等事故发生。
4.化学消毒液使用时应按照说明书配制，避免过量使用或浓度不足导致消毒失败。
发酵工程连续灭菌设计方案
发酵工程连续灭菌设计方案一、引言发酵工程是一种利用微生物、酶或细胞等生物体系在一定条件下进行生长或代谢活动，产生有益物质的过程。
在发酵工程中，微生物培养液需要进行连续灭菌以确保生产的产品质量。
连续灭菌是指在发酵过程中对微生物培养液进行连续不间断的灭菌处理，以保证微生物培养液的无菌状态。
因此，设计合适的连续灭菌工艺和设备对于确保发酵工程的生产质量至关重要。
本文将介绍连续灭菌的设计方案，包括灭菌工艺流程、灭菌设备选择、操作规程等方面的内容，旨在为发酵工程的连续灭菌提供一些建议和参考。
二、连续灭菌工艺流程1. 培养液分装首先，将待灭菌的微生物培养液从发酵罐中抽取，通过管道输送至连续灭菌设备前的培养液分装装置。
在此过程中，需要确保分装装置能够对培养液进行准确的量化分装，保证后续的连续灭菌工艺。
2. 灭菌处理接下来，将分装好的微生物培养液送入连续灭菌设备中进行灭菌处理。
连续灭菌设备通常采用加热或者化学处理的方式进行微生物的灭菌。
在设计灭菌设备时，需要考虑到处理的温度、时间、压力、流速等参数，以及在灭菌过程中可能产生的氧化、变质、颜色和风味上的影响。
3. 加工尾水处理在连续灭菌处理过程中，可能产生一定量的加工尾水。
这部分尾水需要进行处理，以保证对环境的安全性和符合相关的环保法规。
4. 贮存和输送经过连续灭菌处理的微生物培养液需要进行存储和输送，以确保生产线上的连续生产。
因此，需要设计相应的贮存和输送设备，包括存储罐、输送管道、泵等。
5. 清洗和消毒在整个连续灭菌工艺结束后，需要对相关的设备进行清洗和消毒。
这包括清洗灭菌设备、培养液分装装置、贮存罐等设备，以确保下一次的灭菌工艺的进行。
三、连续灭菌设备选择在设计连续灭菌工艺中，选择合适的灭菌设备至关重要。
常见的连续灭菌设备有：1. 输送管道2. 灭菌罐3. 灭菌灌装机4. 贮存罐5. 清洗设备在选择灭菌设备时，需要考虑到其灭菌效率、可靠性、稳定性，以及容易清洗和维护的特点。
微生物发酵操作规程
微生物发酵操作规程1.工艺准备（1）确定发酵菌种：选择适合发酵目标产物的菌株，并进行纯化和保存。
（2）培养基配制：根据菌株的要求，制备培养基，包括碳源、氮源、矿物质和生长因子等。
（3）发酵设备准备：清洁和消毒发酵罐、搅拌器、温度和pH控制装置等设备。
2.接种和预培养（1）接种菌种：用菌液或菌片接种到含有预培养培养基的培养皿中，使其再生长。
（2）预培养：在适当的温度、pH和搅拌条件下培养，使菌株适应发酵条件。
3.发酵过程（1）发酵罐消毒：将发酵罐和相关设备高温高压消毒，并保持无菌状态。
（2）培养基制备：按照预设方案，将培养基置入发酵罐中，同时加热灭菌。
（3）接种：将预培养的菌种接种到发酵罐中，使其开始生长。
（4）发酵条件控制：根据菌株的要求，控制发酵过程中的温度、pH、搅拌和通气等参数。
（5）溶氧供应：通过通气和搅拌，保证发酵过程中的溶氧供应。
（6）反应监测：定期取样，监测发酵过程中的生物量、代谢产物浓度和生物活性等指标。
（7）发酵过程控制：根据反应监测结果，及时调整发酵条件，以提高产量和产品质量。
4.发酵后处理（1）终止发酵：根据菌株的生长曲线和指标，判断发酵结束的时间点。
（2）生物体分离：通过离心或其他手段，将发酵液中的菌体和培养基分离。
（3）产物提取：将发酵液进行抽提、分离和纯化，得到目标产物。
（4）产物检测：对所得产物进行相关的质量检测，包括物质性质、纯度和活性等。
在微生物发酵操作过程中（1）生物安全：严格遵守生物安全操作规程，采取措施防止菌种和发酵液污染。
（2）无菌操作：操作过程中保持无菌环境，对发酵罐和设备进行彻底的消毒和灭菌。
（3）质量控制：保证培养基和原料的质量符合要求，严格控制发酵过程中的温度、pH、搅拌和通气等参数。
（4）操作记录：详细记录发酵过程中的数据和操作步骤，以备后续分析和优化。
（5）固定化技术：根据需要，可以采用固定化技术来提高发酵效率和产品稳定性。
酿酒车间消毒灭菌方法
酿酒车间消毒灭菌方法
可以采用以下方法对酿酒车间进行消毒灭菌：
1. 使用84消毒液：将适量的84消毒液稀释后，用喷雾器均匀喷洒在车间的各个角落，特别是易藏污垢和细菌的地方进行彻底消毒。
2. 使用紫外线消毒灯：在车间内部设置紫外线消毒灯，开启一定时间进行紫外线消毒，可以有效杀灭细菌、病毒等病原体。
3. 使用高温蒸汽消毒：通过蒸汽消毒设备对酿酒车间进行高温蒸汽消毒，可以将细菌和病毒彻底杀灭。
以上方法可以有效对酿酒车间进行全面消毒灭菌，确保酿酒过程的卫生安全。
消毒灭菌后，还需定期清洁和消毒，保持车间的整洁和卫生。
发酵过程各环节操作规程
发酵过程各环节操作规程发酵是指利用微生物（如酵母菌、乳酸菌等）对物质进行代谢，产生有益的化学变化的过程。
在发酵过程中，各个环节的操作规程十分重要，下面将逐一介绍。
一、原料准备1.确定发酵原料的种类和质量，遵循配方要求。
2.对原料进行清洗消毒，以防止细菌和杂质的污染。
3.对原料进行切割或研磨，以增加微生物对原料的接触和附着。
4.按照发酵原料种类和要求进行配料混合，注意配料的均匀性。
二、培养液制备1.根据发酵菌株需求和培养液配方，准备发酵基础培养液，包括碳源、氮源、无机盐等。
2.准确称量和称取各种发酵培养介质成分，保证配方的准确性。
3.根据不同的发酵菌株要求，进行高压灭菌或高温灭菌，以确保无细菌污染。
三、接种和预培养1.根据发酵菌株特性和发酵目的选择合适的种属。
2.将培养基中的菌株转移到预培养基质中，进行初级培养。
3.对预培养基质进行一定的搅拌和通气等操作，以保证菌株的充分生长。
四、发酵罐和设备消毒1.在接种前进行发酵罐的彻底清洗和消毒，以保证其内部的无菌环境。
2.对发酵罐和发酵设备进行高压灭菌或高温灭菌，以杀死可能存在的细菌和病原体。
3.消毒后的设备要进行彻底的冲洗和干燥，以防止消毒剂残留。
五、培养液接种1.将预培养中培养好的菌株接种到发酵罐中的培养液中。
2.控制好接种量和比例，避免过多或过少的影响发酵过程。
3.搅拌培养液，使接种菌株均匀分布在培养液中。
六、发酵过程控制1.通过调节发酵罐中的温度、pH值、搅拌速度等参数，确保最适合微生物生长和代谢的环境。
2.在发酵过程中，随时监测和调整营养物质的添加量和氧气的供应。
3.定期取样，进行各项指标的检测，确定微生物代谢过程是否正常进行。
七、发酵结束和产物收获1.根据发酵菌株的繁殖和代谢特性，判断发酵是否结束。
2.停止供气和搅拌，将发酵液进行分离和收获产物。
3.进行产物的后处理，如过滤、浓缩、干燥等。
八、发酵设备清洗和消毒1.在发酵结束后，对发酵罐和发酵设备进行彻底的清洗和消毒。
发酵设备及消毒灭菌
无机盐 • 加入的无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等, 且用量
要适度。另外，由于铁离子对青霉菌有毒害作用, 必须严格控制铁离子的浓度，一般控制在30 μg/ml 。
发酵培养的控制
加糖控制 • 加糖量的控制是根据残糖量及发酵过程中的 pH
值确定。最好是根据排气中CO2量及 O2 量来控制， 一般在残糖降至 0.6% 左右，pH 值上升时开始加 糖。 • 加糖率：0.07-0.15%，每2h一次或连续流加。
补氮及加前体
• 补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素。发酵60-70开始 补加，使发酵液氨基氮控制在0.01%-0.05%。
• 发酵8-12h后补前体，以使发酵液中残存苯乙酰胺 浓度为0.05%-0.08% 。
pH 值控制
• 一般为 pH6.5-6.9，尽量避免超过pH7.0。 • pH上升可以补加葡萄糖或天然油脂来控制； • pH下降则提高通气量，或补加氨水和碳酸钙来控制。 • 目前生产上趋于采用直接加酸或加碱自动控制pH。
ACV合成酶
ACV三肽
异青霉素合成酶
6-APA
异青霉素N(IPN)
青霉素N，…
青霉素G
头孢菌素C
β-内酰胺类抗生素的代谢调控
• 碳源分解代谢物阻遏 • 赖氨酸的反馈调节：共同中间体 • L-甲硫氨酸对头孢菌素C的诱导作用 • 头孢菌素C的扩环/羟化双功能酶需Fe2+，分子氧
等辅助因子 • 缬氨酸是青霉素生物合成的前体
发酵液质量控制
• 生产上按规定时间从发酵罐中取样，用显微镜观 察菌丝形态变化来控制发酵。生产上惯称“镜 检”，根据“镜检”中菌丝形变化和代谢变化的 其他指标调节发酵温度，通过追加糖或补加前体 等各种措施来延长发酵时间，以获得最多青霉素。
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菌体浓度 • 在适合的生长速率下，发酵产物的产率与菌体浓
度成正比关系。特别是初级代谢产物。 • 菌体浓度过低，产物产率下降。 • 菌体浓度过高，产生其他影响。 • 措施：调节培养基中的营养物质的浓度。
营养物质 • 碳源 • 氮源 • 磷酸盐：生长亚适量浓度 • 补料：半饥饿状态
温度 • 考虑菌种及生长阶段 • 综合考虑其他培养条件 • 考虑菌种生长情况
L/O/G/O
代谢调控
• 运用人为的方法对微生物的代谢调节系统进行遗 传改造和条件的控制，在保证微生物适当生长的 条件下，建立新的代谢方式，以期按照人们的意 志有目的地过量积累所需的代谢产物，提高生产 效率。
初级代谢
• 能使营养物质转变成机体的结构物质和对机体具 有生理活性作用的物质，或是为机体生长提供能 量的一类代谢。
抗生素的发酵生产
L/O/G/O
抗生素的定义
• 生物在其生产活动过程中所产生，并能在低微浓 度下有选择性地抑制或杀灭其他微生物或肿瘤细 胞的有机物。
发展历史
• 1929年，英国弗莱明发现青霉素。二战期间，大 规模发酵生产，世界上最早用于临床的抗生素 。
• 20世纪60-70年代，利用生物合成和半合成方法 研制抗生素衍生物。
第三节 发酵设备及消毒灭菌
L/O/G/O
发酵的一般流程
培养基配制
种子扩大培养
空气除菌 发酵设备
培养基灭菌
发酵生产
下游处理
发酵设备——发酵罐
发酵罐的特点 ➢ 轴封严密，泄漏少 ➢ 能承受一定压力、温度 ➢ 搅拌通风装置保证气液充分混合 ➢ 具有足够的冷却面积 ➢ 死角少，灭菌彻底 ➢ 适宜的径高比（高与直径的比值为2.5—4）
分解代谢
生物合成
生长
抗生素、生物碱、色素、 毒素等次级代谢产物
代谢产物合成的调控
• 初级代谢对次级代谢的调节 • 碳代谢物的调节 • 氮代谢物的调节 • 磷酸盐的调节 • ATP的调节 • 诱导物调节 • 末端产物的反馈调节 • 细胞膜通透性调节 • 其他：金属离子、溶解氧等的调节
初级代谢对次级代谢的调节
发酵罐的类型 • 搅拌釜反应器 • 鼓泡式反应器 • 气升式反应器
发酵辅助设备
无菌空气系统 • 无菌空气的要求 灭菌系统、管道、阀门
培养基及其灭菌
培养基（medium） 培养基的成分 • 碳源、氮源、无机盐、前体物、促进剂、抑制剂
培养基的类型 • 按组成 • 按状态 • 按用途
培养基灭菌 • 空罐灭菌 • 实罐灭菌 • 连续灭菌：高温短时
• 20世纪80年代至今，根据作用机理理性筛选阶段， 包括耐药筛选模型等。
抗生素的分类
• 根据抗生素的生物来源分 • 根据抗生素的作用对象分 • 根据抗生素的作用机制分 • 根据抗生素的化学结构分
根据抗生素的生物来源分
• 放线菌产生的抗生素：链霉素、四环素、红霉素 • 真菌产生的抗生素：青霉素、头孢菌素 • 细菌菌产生的抗生素：多粘菌素、杆菌肽
• 次级代谢产物以初级代谢产物为母体衍生而来。 • 次级代谢产物合成反应的酶由初级代谢途径的酶
演化而来。 • 因此，初级代谢终产物的过量往往会抑制次级代
谢产物的合成。
碳代谢物的调节
葡萄糖效应 解除方法 • 变更速效碳源和迟效碳源的配比； • 流加葡萄糖。
氮代谢物ห้องสมุดไป่ตู้调节
分解代谢物阻遏效应 解除方法 • 变更速效氮源和迟效氮源的配比； • 流加无机氮。
磷酸盐的调节
磷酸盐效应：类似于葡萄糖效应 机制： • 促进初级代谢、抑制次级代谢 • 抑制次级代谢产物前体的形成 • 阻遏某些关键酶的合成 • 抑制某些关键酶的活性 • 增加菌体能荷状态
ATP的调节
• 直接影响次级代谢产物合成和糖代谢中某些酶的 活性。
• 如四环素的合成。
诱导物调节
• 某些参与次级代谢产物合成的酶为诱导酶。 • 需有诱导物存在，诱导酶才能形成。 • 如甲硫氨酸诱导头孢菌素C。
根据抗生素的化学结构分
• β-内酰胺类：青霉素类、头孢菌素类 • 氨基糖苷类：链霉素、庆大霉素 • 大环内酯类：红霉素、麦迪加霉素 • 四环类：四环素、土霉素 • 多肽类：多粘菌素
第四节 发酵工程制药的 过程与控制
L/O/G/O
种子的扩大培养
微生物发酵方式
• 分批发酵 • 补料分批发酵 • 半连续发酵 • 连续发酵
发酵过程中的中间分析项目
➢ 产物产量 ➢ pH ➢糖 ➢ 氨基氮 ➢ 菌丝形态
发酵过程的影响因素及控制
➢ 菌体浓度 ➢ 营养物质 ➢ 温度 ➢ pH ➢ 溶氧 ➢ 泡沫 ➢ 染菌 ➢ 发酵终点的判断
根据抗生素的作用对象分
• 抗G+的抗生素：青霉素、红霉素 • 抗G-的抗生素：链霉素、多粘菌素 • 广谱抗生素：氨苄青霉素 • 抗真菌抗生素：两性霉素 • 抗病毒和噬菌体抗生素：氯霉素、艾霉素 • 抗原虫抗生素：灭滴虫素 • 抗癌抗生素：阿霉素、博莱霉素
根据抗生素的作用机制分
• 抑制细胞壁合成：青霉素、头孢菌素 • 抑制细胞膜功能：多粘菌素 • 干扰蛋白质合成：四环素 • 抑制核酸合成 ：博莱霉素、利福霉素 • 抑制生物能作用：抗霉素
• 发酵热
pH • 补加酸或碱和补料的方式
溶氧和CO2 • 溶氧异常下降 • 溶氧异常上升 ➢ 措施
泡沫 • 负面影响 • 措施
染菌 • 发酵前期染菌 • 发酵后期染菌
发酵终点的判断 • 提高产物的产量和经济效益 • 降低生产成本
➢ 主要指标与中间分析项目雷同
第五节 发酵工业中的 代谢调控
末端产物的反馈调节
• 末端产物抑制合成途径中的第一个酶的活性，从而 降低产物合成代谢的能力。
• 原位产物分离偶联技术（in situ product removal， ISPR）
细胞膜通透性调节
• 利于代谢产物分泌到胞外，减少胞内浓度，从而 避免末端产物的反馈调节。
• 如：谷氨酸的生产，采取控制生物素浓度、添加 青霉素、添加吐温80等表面活性剂、选育油酸缺 陷型菌株等方法。
次级代谢
• 存在于某些生物中（如某些植物和微生物），并 在一定的生长期内出现的一类代谢。在抵御恶劣 环境、伪装躲避、清除自身毒素和排泄物时很重 要。
微生物初级代谢与次级代谢的关系
多糖、蛋白质、 脂肪、无机盐
分解 合成
初级代谢中间产 物（单糖、氨基 酸、核苷酸、脂
肪酸）
蛋白质、核酸、 粘多糖、脂多糖 等生物大分子