感染性疾病的临床分子诊断
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17
18
HBV核酸检测的意义
1.早期诊断
免疫学检测敏感性： 0.1µg/ml
核酸杂交检测敏感性：0.1pg/ml
PCR检测：
0.1fg/ml
ห้องสมุดไป่ตู้
因此，在感染早期即可通过DNA检测证实 病毒的存在。
19
2.监测治疗效果: ❖ HBVDNA>107拷贝/ml提示病毒复制活跃； ❖ HBVDNA＜104拷贝/ml治疗有一定疗效； ❖ HBVDNA＜103拷贝/ml、HBeAg阴转、
6
一、乙型肝炎病毒
我国是HBV高流行区，50%－70%的人 受过感染，8%－12%是HBV携带者，肝 炎患者中60%是慢性肝炎患者，导致肝硬 变，HBV又与原发性肝癌密切相关。 外壳（HBsAg): 外壳蛋白成分为表面抗原 核心（HBcAg)： DNA
DNA 聚合酶 HBcAg
7
（一）乙型肝炎病毒基因组结构
4
分子诊断
❖严格病原体 ❖不可培养或难以培养的病原体 ❖需要快速得到检验结果 ❖需要获得定量数据
5
第一节 病毒性疾病的临床分子诊断
病毒的概况： 人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、脑
炎、流行性感冒等等，占人类传染疾病的75%左右。 400多种不同病毒。 病毒结构：大 小：20-300nm
核心区：核酸（DNA或RNA） 外周衣壳：蛋白质 包膜：脂质（镶嵌有蛋白质）
长江以北
D基因型
少数民族较多的地区(西藏、新疆、宁夏等)
12
病毒分型检测的意义
HBV基因型与HBV流行病学特点、HBV标志物 的表达、致病性、乙型肝炎的病程、转归及对 药物的敏感性有关。
不同基因型对抗病毒药物的效果存在一定差异 用拉米夫定抗病毒治疗时，基因型B比基因型C 有更好的应答： 用普通IFN-a治疗时，基因型B比基因型C对干 扰素治疗的应答率高。
13
（三） HBV核酸检测
常用的免疫学检测方法，即二对半的检测存在 窗口期，不易早期诊断。
1.普通PCR技术
传统PCR方法检测HBV DNA的灵敏度可以达到 ng级水平，检测结果能直接反应HBV病毒的 复制程度，为临床提供从分子水平上对病原 体进行诊断提供依据。
14
引物是PCR扩增的关键，决定扩增的特异性和 敏感度。PCR引物常根据其S、C、P 和X 基因 中的高度保守序列来设计。 不足：不能进行准确的基因定量、重复性差、 扩增产物间污染所到的假阳性多、强致癌物溴 化乙啶的使用等。
15
扩增位置 引物序列 扩增片断（bp)
P、X基因 5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’
278
5’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’
C基因 5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’ 477
5’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’
感染性疾病的临床分子诊断
1
课程内容
❖病毒性疾病的临床分子诊断 ❖细菌性疾病的临床分子诊断 ❖特殊病原体的临床分子诊断 ❖医院感染的临床分子诊断
2
传统病原体的检验程序
收集临床标本
形态学检查
免疫学检测
分离培养及鉴定
形态学鉴定 生化反应 药敏试验
动物试验
血清学鉴定
3
微生物学检验
❖发现传染源的最主要手段 ❖病原体诊断的金标准 ❖检测时限长（2～42天） ❖某些病原体不能被培养 ❖受多种因素影响
11
我国流行的主要是A、B、C、D四种HBV基因型， 另有混合型。中国大陆地区HBV基因型分布
D 8%
Others A 1 % 4%
B 30 %
C 57 %
n = 694
四种HBV基因型在中国地域分布的主要概况
HBV基因型
主要分布地域
A基因型
仅见于少数地区(广西壮族自治区)
B 基因型
长江以南
C基因型
转氨酶正常为乙型肝炎临床治愈指标；
3.判断病情，指导制定合理的治疗方案
20
HBV的耐药突变和检测
常用的抗HBV药物为核苷（酸）类似物，如拉 米夫定、阿德福韦等，但在长期用药过程中， 部分患者对药物产生了耐药性。HBV一旦出现 耐药突变后肝功能恶化比例显著增高。随着服 用拉米夫定时间的延长，患者的耐药性随之增 加，服药 5 年的耐药性可高过约69%。因此， 对乙型肝炎病毒的耐药性分析在指导临床用药 和监测病情等方面都具有重要意义。
C基因 5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’ 258 5’-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3’
16
2．荧光定量PCR技术
荧光定量PCR法的应用，可以在在进行HBV DNA检 测的同时使其进行相对的量化，这对于乙肝患者体 内HBV的复制及传染性有更直接的了解，能准确地 反映HBV DNA的复制水平、病程变化和治疗恢复情 况等。其特异性高，灵敏度可达001fg，检测范围为 2.5ⅹ102~2.5ⅹ109copies/ml。
❖3.2kb双链DNA病毒 ❖不完全双连环状DNA
长链L为负链：有4个开放阅读框S、C、P、X S区编码外膜蛋白（HBsAg） C区编码HBeAg 、HBcAg p区编码DNA聚合酶 X区位编码X蛋白，可能与病毒蛋白表 达有关。
短链S为正链：长短不一
8
pre-s1
pre-s2
HBV基因组结 构
S
P
pre-S1
pre-S2
HBV DNA 3.2 kb C
S pre-C C
P
pre-c
X
X
pre-S1蛋白 pre-S2蛋白 HBsAg HBeAg HBcAg DNAP HBxAg
9
乙型肝炎病毒的复制周期
10
（三）乙型肝炎病毒的基因分型
对致病的乙型肝炎病毒可用不同的血清型或基因型 进行描述。 根据 HBsAg 抗原性差异，将HBV分为10个血清型， 其中主要的有adr 、adw、ayw和ayr 。血清型分 布有明显的地区与种族差异，和国汉族以adr为主， adw次之。 根据HBV全核苷酸序列差异在8%或以上，或S基因 序列差异在4%或以上的原则 ，可将HBV划分为不同 的基因型，目前已经发现A、B、C、D、E、F、G、 H共8种基因型。不同基因型序列长度不同，主要是 前S1区的不同。
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乙型肝炎病毒的耐药性产生重要原因是HBV本身 是一种变异较高的病毒。
HBV在复制过程中必须经过经过RNA中间体的逆转录过 程中，由于HBV DNA 多聚酶具有逆转录酶的性质，即 缺乏严格的校正功能，使其自发突变率高达10-5。慢性 HBV感染者由于长期抗病毒治疗也会诱发病毒基因变异。 人体免疫应答或疫苗接种等压力下HBV也可发生突变。
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HBV核酸检测的意义
1.早期诊断
免疫学检测敏感性： 0.1µg/ml
核酸杂交检测敏感性：0.1pg/ml
PCR检测：
0.1fg/ml
ห้องสมุดไป่ตู้
因此，在感染早期即可通过DNA检测证实 病毒的存在。
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2.监测治疗效果: ❖ HBVDNA>107拷贝/ml提示病毒复制活跃； ❖ HBVDNA＜104拷贝/ml治疗有一定疗效； ❖ HBVDNA＜103拷贝/ml、HBeAg阴转、
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一、乙型肝炎病毒
我国是HBV高流行区，50%－70%的人 受过感染，8%－12%是HBV携带者，肝 炎患者中60%是慢性肝炎患者，导致肝硬 变，HBV又与原发性肝癌密切相关。 外壳（HBsAg): 外壳蛋白成分为表面抗原 核心（HBcAg)： DNA
DNA 聚合酶 HBcAg
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（一）乙型肝炎病毒基因组结构
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分子诊断
❖严格病原体 ❖不可培养或难以培养的病原体 ❖需要快速得到检验结果 ❖需要获得定量数据
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第一节 病毒性疾病的临床分子诊断
病毒的概况： 人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、脑
炎、流行性感冒等等，占人类传染疾病的75%左右。 400多种不同病毒。 病毒结构：大 小：20-300nm
核心区：核酸（DNA或RNA） 外周衣壳：蛋白质 包膜：脂质（镶嵌有蛋白质）
长江以北
D基因型
少数民族较多的地区(西藏、新疆、宁夏等)
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病毒分型检测的意义
HBV基因型与HBV流行病学特点、HBV标志物 的表达、致病性、乙型肝炎的病程、转归及对 药物的敏感性有关。
不同基因型对抗病毒药物的效果存在一定差异 用拉米夫定抗病毒治疗时，基因型B比基因型C 有更好的应答： 用普通IFN-a治疗时，基因型B比基因型C对干 扰素治疗的应答率高。
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（三） HBV核酸检测
常用的免疫学检测方法，即二对半的检测存在 窗口期，不易早期诊断。
1.普通PCR技术
传统PCR方法检测HBV DNA的灵敏度可以达到 ng级水平，检测结果能直接反应HBV病毒的 复制程度，为临床提供从分子水平上对病原 体进行诊断提供依据。
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引物是PCR扩增的关键，决定扩增的特异性和 敏感度。PCR引物常根据其S、C、P 和X 基因 中的高度保守序列来设计。 不足：不能进行准确的基因定量、重复性差、 扩增产物间污染所到的假阳性多、强致癌物溴 化乙啶的使用等。
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扩增位置 引物序列 扩增片断（bp)
P、X基因 5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’
278
5’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’
C基因 5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’ 477
5’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’
感染性疾病的临床分子诊断
1
课程内容
❖病毒性疾病的临床分子诊断 ❖细菌性疾病的临床分子诊断 ❖特殊病原体的临床分子诊断 ❖医院感染的临床分子诊断
2
传统病原体的检验程序
收集临床标本
形态学检查
免疫学检测
分离培养及鉴定
形态学鉴定 生化反应 药敏试验
动物试验
血清学鉴定
3
微生物学检验
❖发现传染源的最主要手段 ❖病原体诊断的金标准 ❖检测时限长（2～42天） ❖某些病原体不能被培养 ❖受多种因素影响
11
我国流行的主要是A、B、C、D四种HBV基因型， 另有混合型。中国大陆地区HBV基因型分布
D 8%
Others A 1 % 4%
B 30 %
C 57 %
n = 694
四种HBV基因型在中国地域分布的主要概况
HBV基因型
主要分布地域
A基因型
仅见于少数地区(广西壮族自治区)
B 基因型
长江以南
C基因型
转氨酶正常为乙型肝炎临床治愈指标；
3.判断病情，指导制定合理的治疗方案
20
HBV的耐药突变和检测
常用的抗HBV药物为核苷（酸）类似物，如拉 米夫定、阿德福韦等，但在长期用药过程中， 部分患者对药物产生了耐药性。HBV一旦出现 耐药突变后肝功能恶化比例显著增高。随着服 用拉米夫定时间的延长，患者的耐药性随之增 加，服药 5 年的耐药性可高过约69%。因此， 对乙型肝炎病毒的耐药性分析在指导临床用药 和监测病情等方面都具有重要意义。
C基因 5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’ 258 5’-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3’
16
2．荧光定量PCR技术
荧光定量PCR法的应用，可以在在进行HBV DNA检 测的同时使其进行相对的量化，这对于乙肝患者体 内HBV的复制及传染性有更直接的了解，能准确地 反映HBV DNA的复制水平、病程变化和治疗恢复情 况等。其特异性高，灵敏度可达001fg，检测范围为 2.5ⅹ102~2.5ⅹ109copies/ml。
❖3.2kb双链DNA病毒 ❖不完全双连环状DNA
长链L为负链：有4个开放阅读框S、C、P、X S区编码外膜蛋白（HBsAg） C区编码HBeAg 、HBcAg p区编码DNA聚合酶 X区位编码X蛋白，可能与病毒蛋白表 达有关。
短链S为正链：长短不一
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pre-s1
pre-s2
HBV基因组结 构
S
P
pre-S1
pre-S2
HBV DNA 3.2 kb C
S pre-C C
P
pre-c
X
X
pre-S1蛋白 pre-S2蛋白 HBsAg HBeAg HBcAg DNAP HBxAg
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乙型肝炎病毒的复制周期
10
（三）乙型肝炎病毒的基因分型
对致病的乙型肝炎病毒可用不同的血清型或基因型 进行描述。 根据 HBsAg 抗原性差异，将HBV分为10个血清型， 其中主要的有adr 、adw、ayw和ayr 。血清型分 布有明显的地区与种族差异，和国汉族以adr为主， adw次之。 根据HBV全核苷酸序列差异在8%或以上，或S基因 序列差异在4%或以上的原则 ，可将HBV划分为不同 的基因型，目前已经发现A、B、C、D、E、F、G、 H共8种基因型。不同基因型序列长度不同，主要是 前S1区的不同。
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乙型肝炎病毒的耐药性产生重要原因是HBV本身 是一种变异较高的病毒。
HBV在复制过程中必须经过经过RNA中间体的逆转录过 程中，由于HBV DNA 多聚酶具有逆转录酶的性质，即 缺乏严格的校正功能，使其自发突变率高达10-5。慢性 HBV感染者由于长期抗病毒治疗也会诱发病毒基因变异。 人体免疫应答或疫苗接种等压力下HBV也可发生突变。