感染性疾病的临床分子诊断
病毒感染的分子生物学检验
所得病毒信息量较少，不 提供病毒基因型或耐药性 方面的信息。
常用的技术：PCR技术、核酸杂交技术、基因芯片技术及 基因测序技术
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第二节 乙型肝炎病毒的分子生物学检测
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是引起 病毒性肝炎的主要病原体之一。 根据有关资料统计，全球约有3.5亿乙肝病毒携 带者，我国约50％~70％的人群感染过乙肝病毒， 其中乙肝病毒携带者已超过1.3亿，肝癌发病率也 在增加。
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HBcAg抗原性很强，能刺激机体产生抗HBc， 但无中和作用，如检出高效价抗HBc，特别是 抗HBc-IgM则表示HBV在肝内处于复制状态。 不同亚型的HBcAg长度不等，一般在183~214 个氨基酸。 HBcAg相对保守，不同亚型HBcAg的变异率< 6%。
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HBeAg蛋白由前-C基因开始编码（包括前C和C 基因），由212个氨基酸残基组成： HBeAg为可溶性蛋白质，游离于血中，可作为H BV复制及具有强感染性的一个指标。 抗 -HBe 能 与 受 染 的 肝 细 胞 表 面 HBeAg 结 合 ， 通 过补体介导破坏受染的肝细胞，有一定的保护作 用。抗-HBe的出现是预后良好的征象。
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前-C区是一个极易发生突变的区域。前-C基因 突变后，造成HBeAg的分泌水平下降或完全终 止，形成HBeAg阴性的前C区突变株，使受感 染的细胞不能被抗-HBe及相应的细胞免疫所识 别而清除，从而使变异株在抗-HBe阳性的情况 仍大量增殖。因此临床上将慢性乙型病毒感染 分为HBeAg 阳性和HBeAg阴性两类患者。对H BeAg阴性抗-HBe阳性的患者应注意监测血中 病毒DNA。
分子诊断技术在感染性疾病诊断中的应用前沿
分子诊断技术在感染性疾病诊断中的应用前沿随着科技的不断进步，分子诊断技术在感染性疾病的诊断中扮演着越来越重要的角色。
分子诊断技术通过检测人体内的特定基因、蛋白质以及其他分子标志物，能够准确、快速地诊断出感染性疾病，为临床治疗提供及时有效的指导。
本文将介绍分子诊断技术在感染性疾病诊断中的应用前沿。
一、分子诊断技术简介分子诊断技术是一种利用分子生物学和生物化学的方法进行疾病检测和诊断的新兴技术。
它利用了人体内微量的分子标志物，如DNA、RNA、蛋白质等，通过特定的实验方法进行检测，从而准确地诊断出感染性疾病。
在感染性疾病的诊断中，传统的方法往往需要培养和鉴定病原微生物，操作繁琐、耗时且存在很大误差。
而分子诊断技术则能够通过直接检测病原微生物的核酸或蛋白质等标志物，极大地提高了诊断的准确性和快速性。
二、PCR技术的应用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前应用最广泛的分子诊断技术之一。
PCR技术通过扩增病原微生物的DNA片段，能够在非常短的时间内获得大量特定的基因组DNA。
在感染性疾病的诊断中，PCR技术被广泛应用于包括呼吸道感染、血液感染、泌尿道感染等在内的多个领域。
例如，在呼吸道感染的诊断中，通过采集患者的呼吸道标本，利用PCR技术快速检测出病原微生物的核酸，可以准确地确定感染性病原体，从而指导治疗方案的选择。
PCR技术的快速性和准确性为感染性疾病的早期诊断提供了重要的手段。
然而，PCR技术在一定程度上存在着对特殊设备和操作技术的依赖，同时也容易受到样品质量和操作误差的影响。
三、下一代测序技术的发展随着生物技术的不断发展，下一代测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）逐渐兴起并广泛应用于感染性疾病的诊断中。
NGS 技术能够快速、准确地测序全基因组的DNA或RNA，不受研究对象的限制。
在感染性疾病的诊断中，NGS技术能够对患者样本中的全部基因组进行测序，并通过比对分析找出病原微生物的基因组序列，从而实现全面的病原微生物检测和鉴定。
分子诊断技术在临床检验中的应用
分子诊断技术在临床检验中的应用第一章引言随着科技的不断发展，分子诊断技术在临床检验中的应用变得越来越广泛。
分子诊断技术是利用分子生物学、遗传学等原理和方法，通过检测和分析人体体液、组织或细胞中的分子信息，以达到疾病的早期诊断、预防和治疗的目的。
本文将详细介绍分子诊断技术在临床检验中的应用，并探讨其未来的发展趋势。
第二章 PCR技术在临床检验中的应用PCR（聚合酶链反应）是一种基于DNA模板的体外扩增技术。
PCR技术已被广泛应用于临床检验领域，如病毒感染、遗传性疾病和肿瘤等的诊断。
例如，利用PCR可以检测到患者体内存在的病毒DNA或RNA，从而判断病毒感染的种类和程度。
此外，PCR还可以用于检测某些基因突变，从而提供遗传性疾病的诊断和遗传咨询。
第三章基因测序技术在临床检验中的应用基因测序技术是指通过测定DNA序列，确定基因组中特定基因的序列信息的技术。
近年来，随着高通量测序技术的发展，基因测序已成为临床检验中不可或缺的工具。
基因测序技术可以用于检测遗传性疾病、肿瘤等的突变，帮助临床医生制定个体化的治疗方案。
此外，基因测序技术还可以用于预测个体的药物代谢能力，从而优化药物治疗的效果。
第四章微阵列技术在临床检验中的应用微阵列技术是一种高通量的基因表达分析技术，能够同时检测成千上万个基因的表达水平。
微阵列技术已被广泛应用于肿瘤分型、药物敏感性预测等临床研究中。
通过对肿瘤样本进行基因表达谱的分析，可以根据基因的表达模式判断肿瘤类型，从而指导治疗方案的选择。
此外，在药物研发领域，微阵列技术可以用于筛选潜在药物靶点和预测药物的效果。
第五章荧光定量PCR技术在临床检验中的应用荧光定量PCR技术是PCR技术的一种改进，通过引入荧光探针可以实现对PCR产物的定量检测。
荧光定量PCR技术已被广泛用于临床检验中，如病毒感染的早期诊断和监测，基因表达水平的定量分析等。
利用荧光定量PCR技术，可以实现对DNA、RNA等分子的高灵敏度和高特异性的定量检测，从而提高疾病的诊断准确性和监测效果。
感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南
感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南前言感染性疾病是当今世界严重威胁人类健康的重大疾病，快速、准确的诊断是有效治疗、病情监测和控制疾病蔓延的重要前提。
随着分子检测技术的不断发展和完善，分子检测在病原微生物感染诊断及治疗监测上的临床应用日益广泛，已成为一些重要的感染性疾病的诊断和疗效评价中不可缺少的重要工具。
为使我国的感染性疾病分子检测临床应用健康有序发展，更好的为医患提供高质量的服务，有必要制订感染性疾病相关的分子检测技术指南，规范临床实验室相关分子检测操作程序，指导从事感染性疾病分子诊断的医务人员正确开展工作。
本指南以大量、丰富的临床实践为基础，同时消化吸取了大量国内外文献的精华，广泛征求相关学科专家的意见，遵循科学性、实用性、可行性的原则，反复修改而成。
我们衷心希望《感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南》能够对广大检验人员起到很好的帮助和指导作用，从而为提高感染性疾病临床诊治水平发挥积极的作用本指南起草单位：中国医科大学附属第一医院、国家卫生计生委临床检验中心本指南起草人：尚红、李金明、郭晓临、代娣、程仕彤目录1. 本指南适用范围 (3)2. 标准术语 (3)3. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测概述 (9)4. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测分析前质量控制 (12)4.1 标本采集 (13)4.2 标本的转运 (16)4.3 标本的接收 (17)4.4 标本的保存 (18)4.5 检验项目的选择 (19)5. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测分析中质量控制 (20)5.1 实验室的设计要求 (20)5.2常用的分子检测方法 (21)5.3 试剂和方法的选择 (29)5.4 设备维护和校准 (36)5.5 人员培训 (36)5.6 试剂性能验证 (37)6. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测分析后质量控制 (40)6.1 结果报告 (40)6.2 结果的解释及医患的沟通 (41)6.3 检测后标本的保存及处理 (42)7. 质量保证 (42)7.1 标准操作程序 (42)7.2 质控品 (42)7.3 室内质量控制 (43)7.4 室间质量评价 (47)8. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测应用 (48)8.1 乙型肝炎病毒感染诊疗的个体化分子检测 (48)8.2 丙型肝炎病毒感染诊疗的个体化分子检测 (52)8.3 结核分枝杆菌感染诊疗的个体化分子检测 (56)8.4 人获得性免疫缺陷病毒感染诊疗的个体化分子检测 (57)附录 (65)参考文献 (66)1.本指南适用范围本指南由国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会编订，是国家卫生计生委个体化医学检测技术系列指南之一，旨为临床实验室进行感染性疾病相关的个体化医学分子检测提供参考和指导。
什么是分子诊断
什么是分子诊断分子诊断指的是通过分子生物学检测方法诊断机体中某些遗传物质的方式。
在临床医学领域，分子诊断学的应用非常广泛，其检查结果相对精准且快速。
比如说，分子诊断方式可以应用于产前诊断中，主要检测人体结构中的蛋白、酶、抗原、抗体等基因。
除此之外，分子诊断技术也可以检测出人体的传染性疾病，对影响药物的变异性基因进行鉴别，还可以检测出与癌症有关的基因。
分子诊断必须在符合规定条件的实验室内进行，目的是保证最终的检测结果有效且可靠。
人们可以通过分子诊断发现潜在的基因疾病风险，从而更早的做出风险管理准备，避免疾病发生或加重。
分子诊断也能筛选出更加有效的药物对人体进行治疗，提升医疗质量与效率。
图1即为分子诊断相关内容。
图1一、分子诊断技术分类第一，PCR技术。
PCR技术就是基因扩增技术，其利用了DNA的变性原理与复性原理，通过适温延伸、高温变性和低温复性，使得核酸片段体外扩增，可以将非常少的目标DNA特异的扩增上百万倍，然后分析和检测DNA分子。
整体而言，基因扩增技术灵敏度较高且具有特异性，应用时简便快速，所以已经成为临床基因扩增实验室应用较多且接受程度最高的技术，包含定量PCR和常规PCR。
第二，分子杂交技术。
分子杂交技术的原理是，将两条同源序列核酸单链经过碱基互补配对之后结合形成双链的过程。
该技术可以借助已知序列的基因探针捕获和检测目标序列。
所以杂交双方包含探针与有待探测的核酸，比如基因组DNA或细胞总DNA，可以提纯也可以进行细胞内杂交。
一定要标记探针，然后才可以进行示踪与检测。
分子杂交技术灵敏度高且特异性高，目前多应用于克隆基因的筛选、基因组中特定基因序列的定性、定量检测等。
第三，基因测序技术。
基因测序技术是分子诊断技术的重要分支，能够直接获得核酸序列信息，且是唯一的技术手段。
目前，分子杂交与分子构象变异或定量PCR技术得到了良好发展，但在核酸鉴定方面依然处于间接推断假设阶段，所以特定基因序列检测的分子诊断依然以核酸测序为金标准。
分子诊断学
（四）检查方法 由于淋病的临床表现缺乏特异性，其确 证主要依靠实验室检查。
目前常用的诊断方法： 1、传统的图片染色法：敏感度低。 2、分离培养法：要求高，结果慢，影响因素多，难以满 足临床。 3、免疫学法：使用受限。 4、分子诊断法 敏感、特异 、可直接检出含量低的病 原菌适于淋球菌的快速检测
第二节病原菌的基因检测—淋球菌
知识性回顾
（一）生物学性状 1.形态与染色 革兰染色阴性球菌，常成双 排列。浓汁标本中，大多数淋球菌（慢性淋 病病人除外）位于中性粒细胞中。无芽孢， 无鞭毛，用碱性美兰液染色时，菌体呈深蓝 色。 2.培养特性 专性需氧培养要求高，一般不 易培养 ，常用巧克力色血琼脂平板培养基。 其抵抗力弱，对冷热干燥和消毒剂极度敏感。
（五）预防与治疗
1.加强宣传教育，减少淋球菌的传播 2.对患者应早期用药，彻底治疗。药 物可选用：青霉素，博来霉素。
3.婴儿出生时，无论母亲有无淋病， 都应以氯霉素链霉素合剂滴入双眼， 预防新生儿淋球菌性结膜炎。
细菌的基因组结构
•1.染色体分子量980M ,可编码5000个基因， 其G+C的含量为52%。 •2.杂交实验表明淋球菌与脑膜炎球菌具有80% 的同源序列,但与其他细菌的同源性较低。 •3.淋球菌中没有操纵子，几乎所有淋球菌中 至少含有1个质粒。
2、所致疾病 人类是唯一宿主，人类淋病主要通过性传播 垂直传播：母体患有淋病时，婴儿易患淋球 菌性结膜炎 男性感染后可引起尿道炎，慢性前列腺炎等， 女性可引起阴道炎，宫颈炎，子宫内膜炎等 淋球菌的慢性感染常是不育的原因，侵入血 液可致关节炎，心内膜炎和脑膜炎等，甚至 危及生命。
（三）免疫性
分子诊断学
第十二章
感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南
感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南前言感染性疾病是当今世界严重威胁人类健康的重大疾病，快速、准确的诊断是有效治疗、病情监测和控制疾病蔓延的重要前提。
随着分子检测技术的不断发展和完善，分子检测在病原微生物感染诊断及治疗监测上的临床应用日益广泛，已成为一些重要的感染性疾病的诊断和疗效评价中不可缺少的重要工具。
为使我国的感染性疾病分子检测临床应用健康有序发展，更好的为医患提供高质量的服务，有必要制订感染性疾病相关的分子检测技术指南，标准临床实验室相关分子检测操作程序，指导从事感染性疾病分子诊断的医务人员正确开展工作。
本指南以大量、丰富的临床实践为基础，同时消化吸取了大量国内外文献的精华，广泛征求相关学科专家的意见，遵循科学性、实用性、可行性的原则，反复修改而成。
我们衷心希望《感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南》能够对广阔检验人员起到很好的帮助和指导作用，从而为提高感染性疾病临床诊治水平发挥积极的作用本指南起草单位：中国医科大学附属第一医院、国家卫生计生委临床检验中心本指南起草人：尚红、李金明、郭晓临、代娣、程仕彤目录1. 本指南适用范围 (3)2. 标准术语 (3)3. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测概述 (9)4. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测分析前质量控制 (12)4.1 标本采集 (13)4.2 标本的转运 (16)4.3 标本的接收 (17)4.4 标本的保存 (18)4.5 检验项目的选择 (19)5. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测分析中质量控制 (20)5.1 实验室的设计要求 (20)5.2常用的分子检测方法 (21)5.3 试剂和方法的选择 (29)5.4 设备维护和校准 (36)5.5 人员培训 (36)5.6 试剂性能验证 (37)6. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测分析后质量控制 (40)6.1 结果报告 (40)6.2 结果的解释及医患的沟通 (41)6.3 检测后标本的保存及处理 (42)7. 质量保证 (42)7.1 标准操作程序 (42)7.2 质控品 (42)7.3 室内质量控制 (43)7.4 室间质量评价 (47)8. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测应用 (48)8.1 乙型肝炎病毒感染诊疗的个体化分子检测 (48)8.2 丙型肝炎病毒感染诊疗的个体化分子检测 (52)8.3 结核分枝杆菌感染诊疗的个体化分子检测 (56)8.4 人获得性免疫缺陷病毒感染诊疗的个体化分子检测 (57)附录 (65)参考文献 (66)1.本指南适用范围本指南由国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会编订，是国家卫生计生委个体化医学检测技术系列指南之一，旨为临床实验室进行感染性疾病相关的个体化医学分子检测提供参考和指导。
分子诊断技术在感染性疾病中的应用
分子诊断技术在感染性疾病中的应用近年来，随着生物技术的不断发展和进步，分子诊断技术逐渐成为感染性疾病的重要诊断手段。
分子诊断技术凭借其高效、准确的特点，在感染性疾病的早期检测、病原体鉴定以及药物治疗等方面发挥了重要的作用。
本文将对分子诊断技术在感染性疾病中的应用进行探讨。
一、感染性疾病的现状及诊断需求感染性疾病是指由病原体引起的，具有传染性和感染性的疾病，在全球范围内都存在广泛的传播。
传统的疾病诊断方法往往需要较长的时间，且结果可能存在偏差。
因此，为了更好地控制和治疗感染性疾病，寻找一种快速、准确、敏感的诊断方法至关重要。
二、分子诊断技术的原理分子诊断技术主要是通过检测目标病原体的核酸或蛋白质，从而实现对感染性疾病的快速鉴定。
该技术的核心是PCR（聚合酶链式反应）技术，通过扩增病原体的核酸而使其可检测。
此外，还包括核酸杂交技术、电化学检测技术、质谱技术等。
三、1. 早期检测感染性疾病的早期检测对于及时治疗和阻断传播至关重要。
传统的检测方法往往需要培养病原体，耗时且可能错过感染的黄金期。
而分子诊断技术可以通过检测病原体的核酸来进行诊断，大大缩短了检测时间。
例如，在临床应用中，通过PCR技术可以快速检测出致病菌，包括细菌、病毒、真菌等。
2. 病原体鉴定感染性疾病的病原体鉴定是指确定引发感染的具体病原体种类。
传统的方法往往需要进行培养和分离，耗时且可能造成误诊。
而分子诊断技术可以通过比对特定的基因序列，实现快速、准确的病原体鉴定。
例如，在临床中，利用PCR技术可以快速鉴定出引发感染的细菌株，为精确治疗提供了依据。
3. 药物治疗指导感染性疾病的药物治疗往往需要依据病原体的敏感性进行选择。
然而，传统的方法往往依赖于耗时的培养和药敏试验，存在选择压过大和结果不准确的问题。
而分子诊断技术可以通过检测相关基因的表达，预测病原体对药物的敏感性。
例如，在耐药菌的检测中，分子诊断技术可以快速鉴定出耐药基因的存在，从而指导合理的药物治疗。
传染病的分子诊断方法与技术
传染病的分子诊断方法与技术传染病一直是人类面临的重要公共卫生问题之一。
为了更好地预防和控制传染病的传播，科学家们致力于发展和改进分子诊断方法和技术。
本文将介绍目前常用的几种分子诊断方法，并探讨它们在传染病防控中的应用。
一、PCR技术PCR（聚合酶链式反应）是一种常见的分子诊断方法，通过扩增DNA片段的方法可以快速检测出传染病病原体的存在。
PCR技术的原理是利用DNA聚合酶在加热和退火的循环条件下，将DNA的目标序列扩增到大量可检测的水平。
这使得PCR技术非常灵敏，可以在短时间内准确检测出病原体的存在。
在传染病的分子诊断中，PCR技术被广泛应用于疾病的早期检测和鉴定。
例如，对于新型冠状病毒肺炎（COVID-19），PCR技术被用于检测患者体内是否存在病毒的遗传物质RNA。
这种基于PCR的病毒核酸检测方法成为目前最主要的COVID-19诊断方法之一。
二、核酸序列分析核酸序列分析是通过对病原体的核酸进行检测和分析，以确定其种类和特征。
核酸序列分析包括序列比对、序列测定和序列分型等步骤。
这些步骤可以通过技术手段进行自动化，提高分析效率和准确性。
核酸序列分析在传染病的分子诊断中发挥着重要作用。
例如，在疟疾的诊断中，通过对疟原虫的核酸序列进行分析，可以确定疟疾的致病种类，并判断其耐药性和传播途径等信息。
这为疟疾的防控提供了重要的参考指标。
三、免疫技术免疫技术是一种通过检测和分析体内产生的免疫应答来诊断传染病的方法。
免疫技术主要包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光法和流式细胞术等。
这些技术基于抗原与抗体的特异性结合，可以在短时间内准确检测出病原体或人体对病原体的免疫应答。
免疫技术在传染病的分子诊断中具有重要意义。
以HIV感染为例，通过检测体内产生的HIV特异性抗体，可以判断人体是否感染HIV病毒。
这种基于免疫技术的诊断方法成为HIV感染的常用筛查手段。
总结：传染病的分子诊断方法与技术为疾病的早期检测、鉴定和监测提供了重要的工具。
分子诊断技术在感染性疾病诊断中的应用
分子诊断技术在感染性疾病诊断中的应用研究方案：分子诊断技术在感染性疾病诊断中的应用一、研究目的与背景感染性疾病是临床上常见的疾病之一，它的早期准确诊断对于治疗和预后至关重要。
目前传统的诊断方法存在时间较长、特异性较差等缺点，无法满足对感染性疾病快速准确诊断的需求。
分子诊断技术应运而生，并被广泛应用于感染性疾病的诊断中，具有高灵敏度和高特异性的优势。
本研究旨在进一步探讨分子诊断技术在感染性疾病中的应用，并提出新的观点和方法，为解决实际问题提供有价值的参考。
二、研究方法1.实验设计本研究采用前瞻性观察设计，共招募X名感染性疾病患者和X名非感染性疾病患者作为对照组。
在患者入组后，采集其血液和其他相关样本，进行分子诊断技术的检测，并与传统的诊断方法进行对比。
2.采集样本2.1 血液样本：每例患者采集X ml抗凝血液样本，其中X ml用于传统的检测方法，X ml用于分子诊断技术的检测。
2.2 其他相关样本：根据疾病特点，采集适当的其他相关样本，如尿液、唾液或者呼吸道分泌物等，用于分子诊断技术的检测。
3.分子诊断技术检测3.1 核酸提取：将采集到的样本进行离心分离，分离出核酸。
3.2 PCR扩增：采用特异性引物和逆向转录酶，对核酸进行PCR扩增。
3.3 实时荧光定量PCR：将扩增产物与特异性探针结合，进行实时荧光定量PCR检测。
3.4 基因芯片：将样本中的核酸转录为亮点，通过基因芯片检测亮点的信号强度和分布来进行分子诊断。
4.数据采集与分析4.1 观察指标：观察指标主要包括分子诊断技术的准确性、灵敏度、特异度和重复性等。
4.2 数据采集：根据实验设计采集患者的临床信息、实验结果等数据，并将其录入电子表格。
4.3 数据分析：采用统计学方法对数据进行描述性统计和比较分析，如计算灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值等。
三、数据整理与分析1.整理数据1.1 检查测定数据：将分子诊断技术的检测结果根据不同疾病分类整理，并计算其准确性、灵敏度和特异度。
分子生物学技术在感染性疾病诊断中的应用进展
ＤＯＩ：１０．１３６０２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０２１．０２．０１·专家论坛·分子生物学技术在感染性疾病诊断中的应用进展 作者简介：吕晶南，１９８９年生，女，技师，硕士，从事临床微生物检验工作。
通信作者：余方友，主任技师，博士研究生导师，博士，Ｅ ｍａｉｌ：ｗｚｊｘｙｆｙ＠１６３．ｃｏｍ。
吕晶南１，余方友２（１．苏州大学第二附属医院检验科，江苏苏州２１５００４；２．同济大学附属上海市肺科医院检验科，上海２０００８２）摘要：临床常见病原菌的检测方法中，传统的病原菌分离培养及表型鉴定方法检测周期耗时长，且操作繁琐、敏感性低、特异性差。
相比这下，分子诊断技术可有效弥补传统方法的不足，尤其是２０１９新型冠状病毒（２０１９ ｎＣｏＶ）的暴发，使分子生物学理论和技术飞速发展并得到广泛应用，对指导临床预防、诊断、治疗及疗效评价起到重要的作用。
该文从呼吸道感染、中枢神经系统感染、血流感染及胃肠道感染４个方面系统化介绍核酸检测技术在病原体鉴定中的应用，同时阐述这些方法在临床实验室应用时可能遇到的挑战和机遇。
关键词：分子生物学技术；分子诊断技术；感染性疾病；病毒中图分类号：Ｒ４４６．５ 文献标志码：Ａ ２０１９新型冠状病毒（２０１９ ｎＣｏＶ）的暴发，使分子生物学技术在临床感染性疾病诊断、治疗、疗效评价及预防等方面得到前所未有的重视和飞速发展。
本文就近年来基于核酸检测技术鉴定病原体进行系统化讨论，同时也对这些方法在临床实验室应用时可能遇到的挑战和机遇进行阐述。
１ 呼吸道感染１．１ 病毒 呼吸道病毒的感染对全球流行病公共卫生可引起严重的威胁，如１９１８年甲型流感大流行，２００３年严重急性呼吸系统综合征（ＳＡＲＳ）冠状病毒暴发，２００９年甲型Ｈ１Ｎ１流感引起的大流行，２０１２年阿拉伯半岛出现由冠状病毒引起的中东呼吸综合征（ＭＥＲＳ），２０１９年２０１９ ｎＣｏＶ的暴发。
值得注意的是，仅基于体征和症状区分病毒来源较困难，同时不同病毒感染采取的治疗方案不同，因此，呼吸道病毒对人类健康构成严重威胁［１］。
利用宏基因二代测序技术进行感染性疾病患者的分子诊断
利用宏基因二代测序技术进行感染性疾病患者的分子诊断近年来，感染性疾病一直是全球关注的热点问题。
为了更好地了解感染性疾病的病原体和其发展机制，很多研究者开始采用宏基因二代测序技术进行分子诊断。
宏基因测序技术在病原体研究方面具有许多优势，比如高通量、高准确率和覆盖范围广等。
本文将详细介绍利用宏基因二代测序技术进行感染性疾病患者的分子诊断的方法以及该技术的应用前景。
首先，我们需要大体了解宏基因二代测序技术的原理和流程。
宏基因测序是指通过将DNA进行扩增，将其分离并进行高通量测序，然后通过生物信息学方法分析获得的数据，从而得到生物体内所有的基因信息。
这种技术的主要特点是可以同时对多个样本进行测序，并高效地得到大规模的基因数据。
在感染性疾病患者的分子诊断中，宏基因测序技术可以用于确定病原体的种类、数量和变异情况。
首先，需要收集感染性疾病患者的病原体样本，如血液、呼吸道分泌物等。
然后，通过提取样本中的DNA或RNA，建立合适的文库。
接下来，使用特定引物和PCR技术扩增目标序列。
然后，将扩增得到的文库进行高通量测序。
最后，使用生物信息学方法对测序结果进行筛选、比对和分析，以确定感染性疾病患者体内存在的病原体、药物抗性基因等信息。
宏基因测序技术可以提供大量的分子信息，从而更全面地了解感染性疾病患者体内的病原体群落。
通过对不同感染性疾病患者的样本进行宏基因测序，可以发现病原体的种类和变异情况，为感染性疾病的诊断和治疗提供更准确的依据。
同时，宏基因测序可以分析感染性疾病患者体内的潜在耐药基因，帮助医生选择合适的抗生素进行治疗，减少药物的滥用和耐药性的发展。
此外，宏基因测序技术还可以应用于研究感染性疾病的发展机制和传播途径。
通过对不同时间点、不同地理位置或不同人群感染性疾病样本的宏基因测序，可以揭示感染源和传播路径，为预防和控制感染性疾病提供科学依据。
相比传统方法，宏基因测序技术具有较高的灵敏度和覆盖范围，极大地增加了我们对感染性疾病的理解。
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18
HBV核酸检测的意义
1.早期诊断
免疫学检测敏感性： 0.1µg/ml
核酸杂交检测敏感性：0.1pg/ml
PCR检测：
0.1fg/ml
因此，在感染早期即可通过DNA检测证实 病毒的存在。
19
2.监测治疗效果: ❖ HBVDNA>107拷贝/ml提示病毒复制活跃； ❖ HBVDNA＜104拷贝/ml治疗有一定疗效； ❖ HBVDNA＜103拷贝/ml、HBeAg阴转、
感染性疾病的临床分子诊断
1
课程内容
❖病毒性疾病的临床分子诊断 ❖细菌性疾病的临床分子诊断 ❖特殊病原体的临床分子诊断 ❖医院感染的临床分子诊断
2
传统病原体的检验程序
收集临床标本
形态学检查
免疫学检测
分离培养及鉴定
形态学鉴定 生化反应 药敏试验
动物试验
血清学鉴定
3
微生物学检验
❖发现传染源的最主要手段 ❖病原体诊断的金标准 ❖检测时限长（2～42天） ❖某些病原体不能被培养 ❖受多种因素影响
C基因 5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’ 258 5’-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3’
16
2．荧光定量PCR技术
荧光定量PCR法的应用，可以在在进行HBV DNA检 测的同时使其进行相对的量化，这对于乙肝患者体 内HBV的复制及传染性有更直接的了解，能准确地 反映HBV DNA的复制水平、病程变化和治疗恢复情 况等。其特异性高，灵敏度可达001fg，检测范围为 2.5ⅹ102~2.5ⅹ109copies/ml。
11
我国流行的主要是A、B、C、D四种HBV基因型， 另有混合型。中国大陆地区HBV基因型分布
D 8%
Others A 1 % 4%
B 30 %
C 57 %
n = 694
四种HBV基因型在中国地域分布的主要概况
HBV基因型
主要分布地域
A基因型
仅见于少数地区(广西壮族自治区)
B 基因型
长江以南
C基因型
转氨酶正常为乙型肝炎临床治愈指标；
3.判断病情，指导制定合理的治疗方案
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HBV的耐药突变和检测
常用的抗HBV药物为核苷（酸）类似物，如拉 米夫定、阿德福韦等，但在长期用药过程中， 部分患者对药物产生了耐药性。HBV一旦出现 耐药突变后肝功能恶化比例显著增高。随着服 用拉米夫定时间的延长，患者的耐药性随之增 加，服药 5 年的耐药性可高过约69%。因此， 对乙型肝炎病毒的耐药性分析在指导临床用药 和监测病情等方面都具有重要意义。13（三） HBV核酸检测
常用的免疫学检测方法，即二对半的检测存在 窗口期，不易早期诊断。
1.普通PCR技术
传统PCR方法检测HBV DNA的灵敏度可以达到 ng级水平，检测结果能直接反应HBV病毒的 复制程度，为临床提供从分子水平上对病原 体进行诊断提供依据。
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引物是PCR扩增的关键，决定扩增的特异性和 敏感度。PCR引物常根据其S、C、P 和X 基因 中的高度保守序列来设计。 不足：不能进行准确的基因定量、重复性差、 扩增产物间污染所到的假阳性多、强致癌物溴 化乙啶的使用等。
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扩增位置 引物序列 扩增片断（bp)
P、X基因 5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’
278
5’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’
C基因 5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’ 477
5’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’
pre-S1
pre-S2
HBV DNA 3.2 kb C
S pre-C C
P
pre-c
X
X
pre-S1蛋白 pre-S2蛋白 HBsAg HBeAg HBcAg DNAP HBxAg
9
乙型肝炎病毒的复制周期
10
（三）乙型肝炎病毒的基因分型
对致病的乙型肝炎病毒可用不同的血清型或基因型 进行描述。 根据 HBsAg 抗原性差异，将HBV分为10个血清型， 其中主要的有adr 、adw、ayw和ayr 。血清型分 布有明显的地区与种族差异，和国汉族以adr为主， adw次之。 根据HBV全核苷酸序列差异在8%或以上，或S基因 序列差异在4%或以上的原则 ，可将HBV划分为不同 的基因型，目前已经发现A、B、C、D、E、F、G、 H共8种基因型。不同基因型序列长度不同，主要是 前S1区的不同。
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一、乙型肝炎病毒
我国是HBV高流行区，50%－70%的人 受过感染，8%－12%是HBV携带者，肝 炎患者中60%是慢性肝炎患者，导致肝硬 变，HBV又与原发性肝癌密切相关。 外壳（HBsAg): 外壳蛋白成分为表面抗原 核心（HBcAg)： DNA
DNA 聚合酶 HBcAg
7
（一）乙型肝炎病毒基因组结构
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乙型肝炎病毒的耐药性产生重要原因是HBV本身 是一种变异较高的病毒。
HBV在复制过程中必须经过经过RNA中间体的逆转录过 程中，由于HBV DNA 多聚酶具有逆转录酶的性质，即 缺乏严格的校正功能，使其自发突变率高达10-5。慢性 HBV感染者由于长期抗病毒治疗也会诱发病毒基因变异。 人体免疫应答或疫苗接种等压力下HBV也可发生突变。
长江以北
D基因型
少数民族较多的地区(西藏、新疆、宁夏等)
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病毒分型检测的意义
HBV基因型与HBV流行病学特点、HBV标志物 的表达、致病性、乙型肝炎的病程、转归及对 药物的敏感性有关。
不同基因型对抗病毒药物的效果存在一定差异 用拉米夫定抗病毒治疗时，基因型B比基因型C 有更好的应答： 用普通IFN-a治疗时，基因型B比基因型C对干 扰素治疗的应答率高。
❖3.2kb双链DNA病毒 ❖不完全双连环状DNA
长链L为负链：有4个开放阅读框S、C、P、X S区编码外膜蛋白（HBsAg） C区编码HBeAg 、HBcAg p区编码DNA聚合酶 X区位编码X蛋白，可能与病毒蛋白表 达有关。
短链S为正链：长短不一
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pre-s1
pre-s2
HBV基因组结 构
S
P
4
分子诊断
❖严格病原体 ❖不可培养或难以培养的病原体 ❖需要快速得到检验结果 ❖需要获得定量数据
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第一节 病毒性疾病的临床分子诊断
病毒的概况： 人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、脑
炎、流行性感冒等等，占人类传染疾病的75%左右。 400多种不同病毒。 病毒结构：大 小：20-300nm
核心区：核酸（DNA或RNA） 外周衣壳：蛋白质 包膜：脂质（镶嵌有蛋白质）