酶检测方法

脱氢酶活性的测定（dehydrogenases）:脱氢酶活性的测定采用2-3-5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)TTC（2，3，5—氯化三苯基四氮唑）为

底物经脱氢酶催化还原反应后生成红色产物TTCH2-trifenylformazane(TF)，TF颜色的深

浅可以反映脱氢酶活性的高低

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1. 配制TTC系列溶液

在7只容积为50 mL的容量瓶中分别加入0, 1，2，3，4，5，6 mL的l mg/mL 的TTC标准溶液，然后用去离子水定容至50 ml作为TTC系列溶液。

2. 标准曲线的绘制

在8支25 mL的具塞比色管中分别加入2 mL的pH 8.6的Tris-HCl缓冲溶液(三(羟甲基)氨基甲烷)、l mL的去离子水和TTC系列溶液，对照组无需加入TTC；然后向各管中各加入1 mL的10%的硫化钠溶液，将比色管振荡摇匀后置于暗处让溶液进行充分显色后，然后再向各管加入5 mL的丙酮溶液，在37 ℃水浴条件下进行10 min振荡萃取，然后3000 r/min条件下离心5 min，将上层有机溶液用723分光光度计进行测定吸光度值，光波波长492 nm 处，以试剂空白作为对照，根据吸光度值绘制标准曲线。

3. 测定步骤

取发酵液20 mL于研钵中，研磨完全后3000 r/min 条件下离心5 min，弃去上清液，

然后用蒸馏水补足，并搅拌洗涤三次，然后用蒸馏水补足，用玻璃棒搅匀后备用。取活

性污泥制备液2 mL 于带塞比色管中，依次加入pH 8.6 的Tris-HCl 缓冲溶液、1.5 mL 的0.l mol/L 葡萄糖溶液、0.5 mL 的0.4% TTC 溶液和0.36%的Na2SO3溶液，在恒温水浴振荡仪（37±l℃）中培养2 h 后取出，再向比色管中加入0.5 mL 甲醛终止反应，向比色管中加入5 mL 丙酮，37±l ℃振荡萃取10 min，3000 r/min 的条件下离心5 min，取上清于492 nm 处测定吸光度。在上述条件下，l h 产生1 μgTF 的量为一个酶活力单位。

辅酶F420的测定：采用分光光度法

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1.首先取发酵液泥水混合物20 mL，加入40 mL 的0.9%生理盐水，然后在6000 r/min

条件下离心15 min，弃去上清液，向沉淀中再加入40 mL 生理盐水使沉淀悬浮，在6000 r/min 条件下再离心15 min，同样弃去上清液。向沉淀中再加入30 mL 的0.9%生理盐水使沉淀悬浮，然后在95～100 ℃水浴中保温20 min，不断搅拌污泥以使其受热均匀；

达到时间后取出冷却，记录下污泥体积值，以乙醇:污泥：水=2.5:1 的比例加无水乙醇，

搅拌混合均匀，然后6000 r/min 离心10 min 取上清液，将亮黄色上清液分为两份，分别测定溶液的吸光度。一份用4 mol/L的NaOH溶液调节pH至13.5待测，另一份用6 mol/L 的HCl 调节pH<3.0 作为参比，在420 nm 波长下用分光光度计测量吸光度值，然后根据吸光度值进行计算。

2. 结果计算

C= (A1-A0)×f/ε×L，式中：C—辅酶F420浓度，单位mmol/L；A1—pH13.5 的待测样在420 nm 吸光度值；A0—参比样在420 nm 吸光度值；f—样品稀释倍数；L—比色皿厚度，单位cm；ε—辅酶F420的消光系数，单位L/(cm·mmol)，在pH=13.5时，ε=54.3 L/(cm·mmol)。求出污泥混合液的辅酶F420的浓度C 后，可以根据污泥混合液的TS 浓度求出污泥内辅酶F420的浓度，计算公式为：CX=C/X，式中：CX 为单位质量污泥中酶F420的含量，mmol/g；X 为单位体积污泥中污泥的质量，g/L。

乙酰辅酶A（acetyl coenzyme A，acetyl-CoA)

甲基辅酶M（特征性结构成分：2 一疏基乙烷磺酸）(Methy-coenzyme-M reductase, MCR）氢化酶(hydrogenase), 也称为氢酶