过氧化物酶同工酶的提取分离共35页
几种植物中的过氧化物酶同工酶分析1)
将胶浸入染 色液 中 ５ ０ 神，取 出置 一１ 分
于 永 中＾ 沈 ， 止染 色。 ｀ ＇ 停
将胶 置于醋酸 缓冲液中沁 ２ 分钟， 。 再浸 入染色液中，２℃ 保佩染色 ２ ６ ０ ５ ０分钟 － 后， 取出 ， 水漂洗。
１ 酷酸联苯 ） 胺炸液：２ 克联茉胺溶于 １ 毫升醋酸中， ７ 毫升水。 ８ 加 ２
电泳在冰箱或低于 １ ℃ 的 室 温 下 进 行。 ５
力水至 １０ ｉ 」 ０ｎ１ １ ． 斗 ％ Ｆ 过硫酸 按（ ． 用前配划 、Ｆ Ｔｒ－ ． ｉ 泞檬酸缓冲 液忿 ｓ
１． 呢 ， ４ Ｉｒｓ ５． ８ ＋ 柠 檬 酸 ｉ １ ５
１０ ； ．ｇ
加水至 １ ０ １Ｐ Ｒ９ ０ ｍ， ． ０ Ｈ
＇ｒｓ ．ｑ ｒ ３ ０ ； ｉ ０
Ｔｒｓ ２ ； ｉ６ ｇ ．
甘氨ｌ １・ ； ， 斗斗 ｎ ： ９
甘氨酸 ２０； ． ｋ
至凝胶下端 ０ －１厘米处停止电泳。 电泳 时 ． ５
间约 ９－ １０分钟。 ０ ０ 过氧化物Ｒ 同工醉 的染色鉴定方 法 很 多，
染 色 方 法 染 色
加水至 １０ｒ ，爪 ｝３ 加水至 １０ｍｌ Ｈ ．； ０ ０ ｌ １ ． ： ｎ ００ ， ｈ７ ｐ 使用时杯释 １ 信－ ０ 随用时稀释 ５倍
个过氧化物酶同工酶相对活性的维生素 Ｃ 一联 苯胺染色法阁。 近些年来又较多地采用了丁子
香酚 （ｕｅ ｌ Ｅｇ ｏ ｎ ）一类夭然物作底物的新染
色法［ ９ １ ｃ 近年来， 由于同工酶测定、 分析技术在遗传
１ ）本工 作曾得到龚葵 同志的指导， 特致谢意 ， ２ 黄寿松：西北植物研究所进修人员。 ）
离心（５０．． １ 分钟， ３０ ：ｐｍ）５ ． 取上清液， 混人等
烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
实验八 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、实验目的１ 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
２ 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。
３ 掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。
４ 掌握过氧化物酶的活性的测定。
二 实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr ）和交联剂（即共聚体的N,N －甲叉双丙烯酰胺 Bis ）在加速剂（N,N,N ’,N ’－四甲基乙二胺 TEMED ）和催化剂（过硫酸胺 (NH 4)4S 2O 8 简称AP ）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性１ 聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr 和Bis 在催化剂（AP ）或核黄素（C 17H 20O 6N 4）和加速剂（TEMDA ）的作用下聚合而成的三维网状结构。
催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：① AP-TEMED 属化学聚合作用② 核黄素－TEMED 属光聚合作用２ 凝胶孔径的可调性及其相关性质① 凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr 与Bis 之比： 00100a b T m+=⨯ a:b<10 脆硬乳白交联度： 00100b c a b=⨯+ a:b>100糊状易断 ② 凝胶浓度与孔径的关系T （Acr 和Bis 总浓度）增加 孔径减小 移动颗粒穿过网孔阻力增加③ 凝胶浓度与被分离物分子量的关系分子量增加 阻力增加 移动速度减慢。
同时还与分子形状及分子电荷有关系。
在操作时，可以选用007.5凝胶。
因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。
３ 试剂对凝胶聚合的影响水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）原理根据有无浓缩效应可分为：连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH 值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。
实验五过氧化物同工酶PAGE分析
成分
含量
作用
A液（30%Acr-0.8%Bis） 2.65mL
交联剂
B液（Tris+EDTA） 4.75mL
缓冲液
C液（TEMED）
10μL
加速剂
D液（10% AP）
50μL
催化剂
四、操作步骤
样品制备 称取小麦幼苗叶片0.5 克，放入研钵内，
加 pH8.0 样品提取液1mL，于冰浴中研 成匀浆，转入离心管，在高速离心机上以 8000rpm 离心 10 分钟，倒出上清液， 以等量 40%蔗糖混合，并加2滴溴酚蓝， 即为样品液。
同功酶是机体调节酶活性的一种方式，在各种生物体中 广泛存在。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。 它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。 在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此， 测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某 一时期植物体内代谢的变化。
（二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98）
三、材料、仪器和试剂
试剂：
A液：30%Acr-0.8%Bis B液：Tris+EDTA C液：TEMED D液：10%AP 电极缓冲液：硼酸钠-硼酸（pH8.3） 0.5%溴酚蓝 染色液：0.1%联苯胺 样品提取液：pH8.0Tris-HCl缓冲液 40%蔗糖溶液
四、操作步骤
凝胶制备
四、操作步骤
装槽、上样
30-50μL
四、操作步骤
电泳 接好电源线(上槽接负极，下槽接正极)。
打开电源开关，调节电压，以10V/cm稳 定电压电泳，待前沿指示染料溴酚蓝下行 至距胶板末端1-2 厘米处，即可停止电泳。
四、操作步骤
剥胶、染色
过氧化物酶同工酶电泳分析(经典有用)
过氧化物酶同工酶电泳分析实验原理（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。
上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。
本实验采用碱性系统。
电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。
而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。
（3）在电场中形成不连续的电位梯度。
在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。
下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用：（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。
（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。
这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。
（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。
其原因如下：①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。
使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。
②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。
HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。
待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。
电泳一开始，有效泳动率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。
在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸（pI = 6.0 ）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。
这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。
在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。
生化实验四--果蔬中过氧化物酶分析
五,操作
1,贮液配制(已完成) ,贮液配制(已完成) 2,安装电泳槽(安装,封底) ,安装电泳槽(安装,封底)
3,制胶(分离胶,光聚合,浓缩胶) ,制胶(分离胶,光聚合,浓缩胶) 拔出梳子,倒入电极缓冲液,备用. 拔出梳子,倒入电极缓冲液,备用. 4,过氧化物酶的提取 , 按下列比例称取果蔬: 按下列比例称取果蔬: 冬 枣 , 柚 子 , 梨 : 1:2 ; 萝 卜 , 盘 菜 : 1:10 ( W:V) , 剪碎 , 放入研钵中 , 加适量石英砂及 ) 剪碎, 放入研钵中, 样品提取液于冰浴上研磨成匀浆, 置于离心管中, 样品提取液于冰浴上研磨成匀浆 , 置于离心管中 , 研钵用少量提取液清洗,洗液并入离心管,以 14000r/min的转速离心 / 的转速离心15min,取上清液贮存于低 的转速离心 , 温冰箱备用. 温冰箱备用.
三,实验步骤
1,取上述样品提取液 , 取上述样品提取液2.5mL,定容至 刻度, , 定容至50mL刻度, 备 刻度 用(仅指萝卜与盘菜,冬枣,柚子与梨不稀释). 仅指萝卜与盘菜,冬枣,柚子与梨不稀释) 2, 取光径 , 取光径1cm比色皿 只 , 于 1只中加入反应混合液 比色皿2只 比色皿 只中加入反应混合液 3mL和磷酸缓冲液 和磷酸缓冲液1mL, 作为对照 , 另 1只中加入反 和磷酸缓冲液 , 作为对照, 只中加入反 应混合液3mL和上述酶液 和上述酶液1mL(如酶活性过高可稀释 应混合液 和上述酶液 ( 立即开启秒表记录时间, 之),立即开启秒表记录时间,于分光光度计上测量 波长470nm下吸光度值 , 每隔 下吸光度值, 每隔1min读数一次 ( 连读 读数一次( 波长 下吸光度值 读数一次 5min,取平均值). ,取平均值)
四,试剂与材料
A(分离胶缓冲液) 1mol/L HCL (分离胶缓冲液) / /100mL Tris TEMED B(浓缩胶缓冲液) 1mol/L HCL (浓缩胶缓冲液) / /100mL C(分离胶贮液) (分离胶贮液) 贮液 /100mL D(浓缩胶贮液) (浓缩胶贮液) 贮液 /100mL Tris TEMED 丙烯酰胺 丙烯酰胺 48mL 36g 24L 48mL 5.9g 48L 30g pH 8.9 pH 6.7 pH 8.9
超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定、同工酶电泳
超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活⼒测定、同⼯酶电泳实验⼆猪⾎中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活⼒测定、同⼯酶电泳⼀、实验原理超氧化物岐化酶SOD⼴泛存在于⽣物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的⾦属类酶。
它作为⽣物体内重要的⾃由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离⼦，在防御⽣物体氧化损伤⽅⾯起着重要作⽤。
SOD是⼀种酸性蛋⽩，对热、pH和蛋⽩酶的⽔解较⼀般酶稳定。
根据⾦属辅基的不同，它可以分为四类，分别为Mn-SOD、Cu-Zn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD，其中最常见是(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中。
CuZn-S0D酶蛋⽩的分⼦量约为3.2×104，每个酶分⼦由2个亚基通过⾮共价键的疏⽔基相互作⽤缔合成⼆聚体，每个亚基(肽链)含有铜、锌原⼦各⼀个，活性中⼼的核⼼是铜。
SOD作为机体内最重要的抗氧化酶体之⼀，可以直接清除过量的超氧⾃由基，阻⽌机体的过氧化，对机体有较⾼的防护作⽤及保健价值。
本实验采⽤有机溶剂沉淀法以新鲜猪⾎为原料，从中提取SOD硬进⾏纯化。
酶活⼒测定可⽤以下⽅法：黄嘌呤氧化酶法、细胞⾊素C法、肾上腺素⾃氧化法亚硝酸法、NBT光还原法、化学发光法以及邻苯三酚⾃氧化法等。
⽽该实验SOD酶活性采⽤邻苯三酚⾃氧化法测定。
酶活性单位定义为:在1ml的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚⾃氧化速率达50%时的酶量定义为⼀个活⼒单位。
SOD同⼯酶奠定采⽤不连续聚丙烯酰胺-的作⽤，因此，电泳分离SOD后，凝凝胶电泳技术分离鉴定。
⽤“负”显⾊法显⽰。
由于SOD能够抑制O2胶上⽆SOD处显⽰为蓝⾊，⼜SOD处为⽆⾊透明，由此可以鉴定SOD同⼯酶酶谱。
⼆、实验试剂与器材ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%⼄醇、氯仿、考马斯亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐溶液、3mmol/L 邻苯三酚溶液等以及752分光光度计、分析天平、具塞试管、刻度吸管、离⼼机、烧杯、电泳装置、微量进样器、注射器等。
过氧化物酶
植物体内过氧化物酶活性测定及同工酶电泳
过氧化物酶活性测定
一、原理
1. 过氧化物酶[perox idase, POD] ： 广泛存在于各种动物、植物和微生物 体内。催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应: RH2+ H2O2→2H2O + R 2. POD 分子结构特点：POD 是一种由单一肽链与卟啉构成的血红素蛋白, 脱 辅基蛋白分子须与血红素结合才构成全酶。
3. POD的主要生理功能： ◆ 参与活性氧代谢过程； ◆ 参与木质素和木栓质的合成； ◆ 参与生长素的降解。
二、实验材料与试剂 1.材料：玉米幼苗
2.试剂： 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）；0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0） 愈创木酚； H2O2
三、实验步骤
1. 提取酶液：取样品1.0g，加入2ml的0.05mol/L pH5.5的磷酸缓冲液，冰浴研 磨，10000rpm，4℃离心后取上清，即为粗酶液。 2. 酶活性测定：采用愈创木酚比色法测定，对照为煮沸5分钟的粗酶液，反应 体系包括：0.05mol/L pH5.5的磷酸缓冲液2.9ml；0.05 mol/L愈创木酚1ml; 2%H202 1ml；粗酶液0.1 ml，反应1分钟后，立刻在470nm下，测定OD值。 以每分钟在470nm处吸光度的变化0.01为一个酶活单位。 3. 计算酶活性：选取OD值变化较均匀的一段数据，代入公式计算； 以每分钟OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活力单位（U）。
二、材料、仪器设备及试剂
1.材料：玉米幼苗
2.仪器设备：稳流稳压电泳仪；冷冻离心机及离心管； pH试纸； 3.试剂： （1)分离胶缓冲液（pH8.9）：1mol/L HCl 48ml，Tris36.6g， TEMED0.23ml，加水定容 至100ml。 (2)分离胶贮液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加水溶解并定容至100ml，过滤 后使用。 (3)过硫酸铵溶液：过硫酸铵0.2g，加水定容至100ml制胶时现配现用）。 (4)浓缩胶缓冲液：1mol/L HCl48ml＋Tris5.98g＋TEMED0.46ml，调pH6.7，并定容至 100ml。 (5)浓缩胶贮备液：丙烯酰胺10g，甲叉双丙烯酰胺2.5g,加水定容到100ml，使用前过滤。 (6)电极缓冲液：Tris 6.0g，Gly 28.8g， 用水定容至1000ml（pH8.3），用前稀释10倍。 (7)四甲基乙二胺（TEMED）。 (8)0.1％的溴酚蓝水溶液。 (9)联苯胺染色母液：联苯胺1g＋冰醋酸18ml＋H2O2ml溶解贮于棕色瓶中。
植物过氧化物酶的提取、
试剂
考马斯亮蓝试剂； 标准和待测蛋白质溶液
器材
试管及试管架， 移液管（0.1ml及5ml），UV－ 2000型分光光度计。
操作方法：取6支试管，按下表制定标准曲线。
试管编号 0.1mg/ml 标准蛋白溶液/ml 0.15mol/L NaCl/ml 每管中蛋白质浓度μ g/ml 考马斯亮蓝 G250 溶液 A595nm 0 0 1.0 0 1 0.2 0.8 20 2 0.4 0.6 40 5ml 3 0.6 0.4 60 4 0.8 0.2 80 5 1.0 0 100
四、植物过氧化物同工酶电泳技术
实验原理 同工酶（isozymes）是指作用于底物相似或完全相同的 酶的不同分子形式，即催化同一种反应而结构不同的一 族酶。它们是受遗传体系决定的酶的不同分子形式。利 用凝胶电泳技术（PAGE）可以将它们分开，用专一的 作用底物和特殊染料，把需要分析的酶染色，在胶柱上 呈现同工酶谱。 实验目的 通过实验掌握植物同工酶实验技术，了解植物同工酶分 析在遗传学研究中的意义。 着重掌握过氧化物酶的提取，电泳与染色技术和分析方 法。
2010年9月
一、植物过氧化物酶的提取
目的要求 学习制备植物过氧化物酶粗酶液的原理和方法 为后续实验提供酶液。 器材与仪器 电子天平； 冰冻高速离心机； 可见光分光光度计； 电动玻璃匀浆机等。 试剂 20mM KH2PO4， 100mM PBS：取0.2M 的Na2HPO4 12.3ml与0.2M的 NaH2PO4 87.7ml混合。加入100ml水稀释即成。
三、植物过氧化物酶活性的测定（比色法）
原理
实验五 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
实验五聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、目的同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
研究表明，植物在发育过程中，所含同工酶的种类和比例都不相同，它们与植物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系，因此作为基因表达的产物，测定同工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具，在植物的种群、发育及杂交遗传的研究中有重要的意义。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化，测定这种酶的活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便，灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验要掌握电泳技术的原理、方法、装置、凝胶配制等知识，熟悉主要的操作过程，同时对同工酶有一个感性的认识。
二、原理1．电泳带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
近几十年来，电泳作为一项有效的分析、分离和制备技术发展很快，在生产、科研和医疗工作中得到了广泛应用。
用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。
2．影响电泳的主要因素若将带净电荷q的粒子放入电场，则该粒子所受到的引力F引可用数学式表示如下：F引＝E·q（1）式中E为电场强度，单位为“v/cm”，表示电场中单位距离上的电位差。
如果这种情况发生在真空中，则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。
但在溶液中，由于电场的牵引力F引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力（即摩擦力）F阻相对抗。
故上述现象不会发生。
根据Stokes公式，阻力的大小取决于粒子的大小和形状以及所在介质的粘度：F阻＝6πrηv (2)式中F阻是球形粒子所受的阻力，r是球形粒子的半径，η是溶液的粘度，v是粒子移动的速度。
实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶（实验报告）
实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析⼩麦幼苗过氧化物酶同⼯酶（实验报告）⽣物化学实验报告实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析⼩麦幼苗过氧化物酶同⼯酶⼀、研究背景及⽬的电泳现象就是带电粒⼦在电场中向与其⾃⾝带相反电荷的电极泳动。
电泳技术最初是由瑞典的著名科学家Tisellius所奠基，⾃此⽣物⼤分⼦的分离纯化便进⼊了电泳技术的新纪元。
电泳技术的发明是⼈们在分离纯化技术中的“差异转换”思路上⼜⼀次伟⼤的飞跃。
⼈们清楚地意识到，要想使⽬标物得到分离，⽬标物与杂质之间的性质差异必须⾜够⼤，这⼜与某些性质差异⼩的物质的分离相⽭盾，⽽⼈为放⼤这些差异⼩的性质必然会破坏⽬标物的原有结构，因此需要借助第三者进⾏差异转化，即以其⾃⾝的性质为基础，转化为其他⽅⾯差异⼤的性质。
电泳技术就是利⽤⼀些⽣物⼤分⼦的电性特点，在⼀定的条件下使被分离物之间很⼩的差异转化为⾃⾝所带电荷性质与数量的差异，在外加电场的作⽤下便会体现出迁移⽅向及速度上的差异，通过时间上的积累进⽽体现为迁移距离的差异。
最初的电泳技术是在溶液中进⾏的⾃由电泳，后来⼈们想到，由于待分离物的⼤⼩、形状也存在差异，那么它们在电场中泳动的过程中必然会受到不同的阻⼒，这种阻⼒的差异⼜转化为了电场中迁移速度的差异，所以⼈们便发明了各种⽤于电泳的载体（⽀持介质），使分⼦的⼤⼩及形状差异得以转化和体现，⼤⼤提⾼了分辨率。
⾄此，电泳技术的基本理论就建⽴了。
此后，在实际操作中，⼈们不断进⾏探索、改进与完善，发明了诸多的电泳新技术，使电泳成为⼀项⽣物⼤分⼦分离纯化中令⼈瞩⽬的研究技术。
本实验基于电泳的基本原理对⼩麦过氧化物酶同⼯酶进⾏分离，旨在学习并掌握电泳技术的发明历程以及操作过程中的相关细节，同时更为深刻地理解⼀项新技术在实际应⽤中不断修正与完善的过程，体会电泳和层析两⼤技术各⾃的特点和优势。
⼆、原理[1]1.过氧化物酶同⼯酶同⼯酶是催化同⼀种化学反应，但其酶蛋⽩本⾝的分⼦结构组成却有所不同的⼀组酶。
枸杞种质过氧化物酶同工酶分析与评价
江苏农业科学
２０ ０ ７年 第 ３期
一
１５一 ７
枸 杞种质过氧化 物酶 同工 酶分 析与评价
赵 建华 ，安 巍 石 志 刚 ， ，焦恩 宁 ，毛 陶
（ ．宁夏枸杞发展工程技术研究中心 ， １ 宁夏银川 ７ ０ ０ ；２ ５ ０ ５ ．宁夏大学农学院 ， 宁夏银川 ７ ０ １ ） ５ ０ ０
材料杂交后代进行遗传分析 ， 为枸杞育种亲本选配
和种 质创 新提 供理 论依 据 。
收 稿 日期 ：０ ６— ９— ４ ２０ ０ ０
１２ 试 验 方法 ．
基金项 目： 国家科 技攻关 计划项 目（ 编号 ：０ ４ Ａ ２ Ａ ６ ；国家科 ２０Ｂ ７１ ３ ） 技成果重点推广项 目（ 编号 ：０ ４ Ｃ ０ ３ ７ 。 ２０ Ｅ ０ ０ ３ ） 作者简介 ： 赵建华 （ ９７ ） 男 ， 肃靖远 人， １７ 一 ， 甘 硕士 ， 助理研究 员 ， 主 要从事枸杞种质研究和分子生物育种工作。Ｔ ｌ（９ １ ２ ５ ４ ４ ｅ：０ ５ ） １８ ５ ； Ｅ—ｍ ｉ： ａｊ ｎｕ０ ４ ＠１３ ＣＩ。通讯 作者 ： ａｌｚ ｏａ ｈａ９ ３ ６ ．Ｏ Ｉ ｈ ｉ Ｔ 安 巍。
一
代 （ ．７ ） ０ ２６ 的杂合度 ， 明不同基因型枸 杞种 质有 着丰富的遗传多 样性 。相 同双亲正反交 ， 说 杂种 一代酶谱 均有
关键词 ： 杞 ； 枸 种质 ； 过氧化物酶 ；同工 酶 ； 母性遗传 中图分类 号 ： ９ ５ ７ Ｑ ４ ．８ 文献标识 码 ： Ａ 文章编号 ：０ ２—１０ （０ ７ ０ ０ ７ １０ ３ ２ ２ ０ ）３— １５—０ ３
差异 ， 杂种一代过氧化物同工酶表现较强的母性遗传特征 ， 这对枸杞杂交亲本 的选择具有重要 意义。
过氧化物酶同工酶的分离提取
20min，沉淀。沉淀用 5ml 0.05 M PBS回溶（测含量和活性）低温保 存.
本实验以菠菜叶片（或苜蓿种子）为材料，低速离心 去除细胞碎片，上清用丙酮或硫酸铵沉淀得过氧化物酶同 工酶粗品。
实验材料与器材
（一）材料：菠菜叶片（或苜蓿种子） （二）器材：研钵、超声波粉碎仪、
高速冷冻离心机、酸Байду номын сангаас计
实验试剂
1． 丙酮
2． 提取缓冲液[pH5.5 0.05M PBS 1L ，需 磷酸氢二钠（含12个水）0.1433g、磷酸 二氢钠（含2个水）0.7178g]。
过氧化物酶同工酶的分离提取
制作人：王瑞刚
内蒙古农业大学 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验原理 实验材料与器材 实验试剂 实验步骤
实验原理
过氧化物酶是植物提内普遍存在、活性较高的一种酶， 它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系， 在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测 定这种酶的活性，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
实验步骤
1．精确称取10g左右植物样品（若是苜蓿种子，提前用水溶胀好，） +20ml提取缓冲液匀浆；
2．超声裂解5min； 3．13000g离心20min； 4．取清液（量体积），沉淀弃去（清液少许低温保存测定酶活和含量）； 5．沿烧杯壁缓慢加入等体积-30℃预冷的丙酮，4℃放置1h； 7．13000g离心20min，沉淀用3 ml 0.05 M PBS回溶(留作实验二测含量
黄芩过氧化物酶同工酶几种酶液提取方法的比较
关键 词 ： 黄芩 ； 氧化物 同工酶 ； 过 电泳
中图分类号 ： ６． ； ４ ． 文献标识码 ： 文章编号 ： ０ －００ （０８０ 一Ｏ３ —０ Ｓ５７ ９Ｑ ９６６ Ａ １ １ ０ ９２０ ）６ ０３ ３ ０
中药黄芩为唇形科植 物黄芩 （ｃｔ ｌｒ ｉ ｌ ｓ Ｓｕｅ ａ ｉ ｂ ｃ ｅ ｉ ｌ ａ ａ ａ ｎｓ Ｇ ｏｇ） ｅｒｉ的干燥根 ， 具有清 热燥湿 、 泻火解毒 、 止血安胎 等 功效Ｌ 。其主要成分黄 芩 甙 （ａ ａｉ， ａ 有抗 菌、 ｌ Ｊ ｂｉ ｌ Ｂ Ｄ具 ｃｎ 抗 病毒 、 抗炎 、 变态反应 、 抗 抗氧化 、 除氧 自由基 、 清 抗癌 、 抗 肿瘤 、 抗凝 、 血栓形 成 和保 护肝 脏 、 抗 心脑 血管 、 神经 元
１次 。
基金 项 目 ： 黑龙 江省普 通 高等 学校 骨干 教 师创 新能 力计 划资 助 项
目（ ｏ １ ５ Ｇ ６ ） Ｎ ．０４ Ｏ ６。
收 稿 日期 ：０ ８ ０ － ３ ２０ － １ ０
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植 物 细胞 工程 方面 的研 究 。Ｅｍａｌｚ ａｇｅ ２ ２ ３ ６ ＠ １３ Ｃ ｒ。 － ｉ：ｈ ｎ ｌ１ ０ ７ ８ ０ ６ ．Ｏ ｉ ｎ
体 ， 无 菌 外 植 体 接 种 于 附 加 ０ ２ｍ ／ ， 一 和 将 ． ｇ Ｌ ２ ４ Ｄ
２０ｒｇ Ｌ６Ｂ ． ／ －Ａ的 ＭＳ培养基 中（ 糖 ３ ， ａ 蔗 琼脂 １ ， ｐ ． ）（５ ）。 Ｈ ５ ８ ，２ ±１ Ｃ暗培养诱 导愈伤组织 。选取疏 松的 淡黄色的愈 伤组 织作 为继代培 养 的材料 。每 ３周继代
1种利用SDS-PAGE检测过氧化物酶同工酶的分析方法
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过 氧化 物 酶 （ ｅ０ｉａｅ Ｐ Ｄ） Ｐ ｒｘｄ ｓ ， Ｏ 同工 酶 作 为 一种 重要 的
Ｂａ ｒ 方法凹 以牛 血清白蛋白为标准ｏＯ ｒ ｏｄ ｆ ， Ｐ Ｄ活性测定采用
愈创木 酚方 法圈 。
遗传 标记 被 广 泛应 用 于 生物 学 研 究 的各 个 领 域 ，Ｏ Ｐ Ｄ同工 酶能 够 在很 大 程度 上 反 映植 物 个 体 之 间 的遗 传 差异 ， 探 是 测基 因差 异和遗 传变 异的一种 重要 手段［］ Ｏ ｉ。 Ｄ同工酶 作为 －Ｐ ３ 遗传标 记 ， 为农 作物 、 可 药用 植物 与 药材 品种 鉴 定提 供 重要 依据 。 统 的 Ｐ Ｄ同工 酶检 测方 法 是先 用 聚丙 烯 酰胺 凝 传 Ｏ 胶 电泳 （Ａ Ｅ 分 离蛋 白质 样 品 ， 用醋 酸联 苯 胺染 色检 测 ＰＧ ） 再 Ｐ Ｄ同工 酶 。 者 建立 了 １ Ｏ 笔 种检 测 Ｐ Ｄ同工 酶 的新 方 法 ， Ｏ 基 本原 理 为 ： 聚丙 烯酰 胺凝 胶 中加入 十二 烷基 磺 酸钠 （Ｄ ） Ｓ Ｓ 分 离样 品 ，Ｄ 使 Ｐ Ｄ同工 酶暂 时变 性 ， ＳＳ Ｏ 电泳 完毕 后 ，ｉ０ Ｔｔ ｌ ｎ Ｘ １０ Ｐ Ｄ同工酶复 性 ， 一 使 Ｏ ０ 最后用 醋 酸联苯 胺染色 检测 Ｐ Ｄ ０ 同工酶 ； 并利用 新建立 的方 法分 析 了 ５ 种菖蒲 属植 物 叶子的 Ｐ Ｄ同工 酶 ， Ｏ 旨在 为 菖蒲 的科 学 分 类 和鉴 定 提供 新 的生化 指标。
Ａ ｔ ｃｉ ｇＭ ｅ ｈｏ ｏｒＡｎａｙｓｓｏｆ ｒ ｘ ｄ ｓ ｓ ｅ ｙ ｅ ｉ Ｄ Ｓ ＡＧ Ｅ Ｄｅｅ ｔｎ ｔ ｄ ｆ ｌ ｉ ｏ ｉ ａ ｅＩ ｏ ｎｚ ｍ ｓＵｓｎｇＳ Ｐｅ