第八章环境毒理学常用研究方法.

His+
• 哺乳动物微粒体酶－前致癌物
S-9混合液
致 突 变 物
DNA修复测定
• 蔗糖密度梯度离心技术
切除片段大小 • 放射自显影技术 直接定位损伤部位 沉降速度
第八节 致突变实验
一、哺乳动物细胞突变试验
正常细胞
正向突变
酶的缺失
突变细
胞能与有害物共存 突变细胞
回复突变
不能与有害物共存
正常细胞
二、染色体畸变试验
⑤皮内注射
注射途径 静脉 肌肉 皮下 腹腔
小鼠 0.2~0.5 0.1~0.2 0.1~0.5 0.2~1.0
大鼠 1.0~2.0 0.2~0.5 0.5~1.0 1.0~3.0
豚鼠 1.0~5.0 0.2~0.5 0.5~1.0 2.0~5.0
兔 3.0~10 0.5~1.0 1.0~3.0 5.0~10.0
斑马鱼
青鳉鱼
第五节 毒物蓄积的研究方法
蓄积毒性作用： 物质蓄积：环境污染物 进入>排出 功能蓄积：结构和功能变化的积累
慢性、亚慢性实验必须先评价蓄积性
5.1 物质蓄积的研究方法
• 生物蓄积的极限值与其在单位 时间内的吸收量成正比
• 生物半衰期越短，达到极限所 需时间就短
• A = a×T1/2×1.44
K>5, 轻度蓄积
5.3 蓄积率的测定方法
对照组LD50-预给组LD50
预给剂量
蓄积率＝
×100％
蓄积量＝对照组LD50－预给组LD50
第六节 亚慢性和慢性毒性实验
• 必须先做蓄积实验判断可能性 6.1 亚慢性毒性实验(1/30～1/20)
①动物要求敏感、两种（啮齿类、非啮齿类） 健康、年幼 ②剂量（高、中、低） 一般取LD50的1/80～ 1/50，每天定时染毒，剂量相等 ③观察指标
优点：
①柜内毒物浓度相对稳定
②受试环境具有持久的稳定性
缺点：
①毒物消耗量大
2）静式吸入染毒法－急性
• 在具有一定气体容积的密闭容器中或在密封 染毒柜内进行
动物种属 呼吸通气量 最低需气量 (L/小时) 小鼠 大鼠 1.45 10.18 (L/小时) 2.45 30.5 不同容积染毒柜放置动物数(只) 25L 3~5 50L 6~10 100L 12~15 1~2 300L 36~40 5~6
一般指标、生化指标、病理学检查
6.2 慢性毒性实验
• 实验时间一般要求1～2年或者终生染毒 • 一般要求选用几种动物，年龄要小 • 设3～4个剂量组和一个对照组
• LD50的1/1000～1/20之间取3～4个剂量
• 注意事项：指标提前观察、同步进行、注意 异常情况、延长饲养时间继续观察
第七节 致癌性实验
5.2 功能蓄积的研究方法
K =
ED50(n)
ED50(1)
①固定剂量连续染毒法；>5LD50，蓄
积作用不明显
②剂量定期递增染毒法（等比递增） ③ 20天蓄积实验法－停药7天内死亡情况
LD50
染毒时间序列 项目 每天染毒剂量 4 天染毒剂量 累积染毒剂量 1～ 4 0.1 0.4 0.4 5～ 8 0.15 0.60 1.00 9～ 12 0.22 0.88 1.88 13～ 17～ 21～ 25～ 16 0.34 1.36 3.30 20 0.50 1.00 5.30 24 0.75 3.00 8.30 28 1.12 4.48 12.8
（4）症状观察
（5）病理学检查及其他指标观察
（6）结果评价－LD50、毒性级别
剂量的选择
①预实验测定：最大无作用剂量、100％ 死亡剂量 ②按等比级数（<2.2,一般1.2~1.5）间距
设计浓度系列，系列浓度中有一个的
死亡率为40～60％为最佳
二、急性阈剂量的测定
• 关键：选定适当的观测指标
机理—肝肾、有机磷农药—胆碱酯酶
大、小鼠、 豚鼠
腹腔
制呼吸。 静脉 腹腔 腹腔 静脉 腹腔 静脉 皮下或肌肉 淋巴囊注射 淋巴囊注射 15-20 40 15-20 80-100 50 750-1000 800-1000 0.1ml/100g 1ml/100g 2 1 1 2 2 30 20 20-25 10 15-30 分钟，麻 醉力强， 宜缓慢 注射。 3-4 小时，诱导 期不明显 2-4 小时，毒性 小， 主要适用小 动物的麻醉。
• 外观形态新鲜、完整，分析时取内 层粪便
• 器皿干净
（4）呼出气的收集
• 研究毒物的吸收代谢和对肺功能的
影响
• 动物需固定
（5） 组织匀浆的制备
• 酶：取样－洗净－研磨－离心 －测定
• 用于毒物的测定
1.4 预备试验
• （1）选择合适的实验动物 • （2）设计染毒剂量及其分组
• （3）操作技术的检验和训练 • （4）发现新线索、新指标
分3组：
再取一个随机数除以6，看余数
（5）实验动物的麻醉
• 动外科手术
• 避免剧烈挣扎
• 麻醉药物：乙醚
（1）全身麻醉
a）吸入法：开放法、封闭法－挥发性
b）腹腔和静脉给药麻醉法－非挥发性
（2）局部麻醉
a）猫：一般应用0.5-1.0%盐酸普鲁卡因
注射。粘膜表面麻醉宜用2%盐酸可卡因
b）兔在眼球手术时，可于结膜囊滴入0.02%盐酸
硫喷妥纳
狗、兔 大白鼠 小白鼠
氯 醛 糖 乌 拉 坦
兔 大白鼠 兔 大、小白鼠 蛙 蟾蜍
麻醉注意事项
（1）静脉注射必须缓慢，同时观察肌肉紧张性、角膜
反射和对皮肤夹捏的反应。当这些活动明显减弱或消
失时，立即停止注射。配制的药液浓度要适中。 （2）麻醉时需注意保温。麻醉期间，动物的体温调节 机能往往受到抑制，出现体温下降。保温的方法有： 实验桌内装灯，电褥，台灯照射等。无论用哪种方法 加温都应根据动物的肛门体温而定。 （3）慢性实验时，在寒冷冬季，麻醉剂在注射前应加 热至动物体温水平。
可卡因溶液，数秒钟即可出现麻醉
c）狗：用0.5-1%盐酸普鲁卡因注射。眼鼻、咽喉
表面麻醉可用2%盐酸可卡因
麻醉剂
动
物
给药方法
剂
量
常用浓 度% 3 3 2
维 持 时 间
（mg/kg）
戊巴比妥 纳
狗、兔
静脉 腹腔
30 40-50 40-50
2-4 小时中途加 上 1/5 量，可维 持 1 小时以上， 麻醉力强， 易抑
④健康状态：检查、预检
（2）实验动物的标记编号
• 染色、烙印、号牌
大动物：记录外表和毛色
（3）实验动物的捕捉及固定
• 做好防护 戴厚手套
• 用器具固定
（4）实验动物的随机分组
分2组：
任意从随机数字表的某一行某一数字开始抄录14个数
再抄录一个数字为78，因为归入A组的小鼠有8只，故以8除， 得余数6。于是把第6个A（即编写为第12号的小鼠）划给B组
大鼠－致癌
豚鼠－过敏反应
常用动物介绍
①猫 气体、蒸气对黏膜的刺激
②豚鼠或兔 皮肤 ③豚鼠 过敏性反应 ④猫、狗、兔 呕吐 ⑤兔和猫 体温 ⑦狗、兔、大鼠 血压 ⑧大鼠和小鼠 致癌 ⑨小鼠 慢性中毒对脏器的损害
2）个体选择
①年龄：幼年>成年，急性实验－成年 ②性别：无特殊要求就雌雄各半
③生理状态：如怀孕、哺乳
1.2 毒物的准备
（1）了解毒物的物理常数
密度、溶解度、蒸汽压、熔点、
沸点、油/水分配系数等
（2）剂型：
毒性高、刺激Baidu Nhomakorabea大－稀释
固态－溶液、软膏
（3）溶剂：
①本身毒性很小或无毒
②不与受检毒物产生增毒或
减毒作用 ③不影响毒物吸收
④无特殊的刺激性或气味
1.3 生物材料的采集和制备
（1）血液的采集
需求少 刺破组织取毛细血管的血
第八章 环境毒理学常用 研究方法
毒理学研究方法
(1)流行病调查/临床观察
体内实验 in vivo tests 体外实验 in vitro tests
(2)动物实验
第一节 实验准备
1.1 动物的准备
①选择实验动物 ②编号与标记 ③固定与麻醉
（1）选择实验动物
高血压
黏膜刺激
1）种属的选择原则
• 在机体反应上与人体近似 • 易获得、易饲养、易管理 • 敏感、合适－实验资料
（2）尿液的收集
• 连续收集
在代谢笼下配置粪尿分离漏斗 • 一次性尿液收集 逼尿法、导尿法、输尿管插管法
剖腹采集尿液、提鼠采集尿液
尿液收集注意事项
• 实验期间膳食一致，特定时间完成收集
• 防止尿液的污染
• 标本迅速测定或冷冻保存
• 避免器皿污染 • 灌喂水或青菜满足尿量需求
（3）粪便的收集
• 代谢笼、粪尿分离器
优点：设备简单，操作方便 缺点：要经过一段时间才能达到实验浓度要求
3）面罩染毒法
• 优点：避免皮肤吸收 • 注意检查面罩的密封性
4）吸入染尘法
颗粒污染物 < 5μm
2.2 气管注入法
• 经喉插入法 • 气管穿刺法 • 暴露气管穿刺法
①适用于颗粒物染毒。
②颗粒物可制备成生理盐水混悬液，也可将颗粒物中的
狗 5.0~15.0 2.0~5.0 3.0~10.0 －
2.5 经皮染毒法
• 家兔和豚鼠
• 斑贴法 • 兔耳法
• 结膜囊染毒
第三节 毒理学实验的设计方法
3.1 实验设计
明确实验目的、了解毒物、预备实验
实验类型（急性、慢性）、实验动物
染毒方式、浓度分组、对照组（平行、自身）
3.2 动物分组
随机化
• 混合毒物LD50的测定方法
①分别测定各毒物的LD50 ②按等毒性比例混合测定混合毒物的LD50 ③评定作用类型
K<0.4 拮抗；0.4<K<2.5 相加； K>2.5 协同
4.3 水生动物毒性实验
一、鱼类毒性实验
动物选择—区域代表性
实验条件—水温、溶氧、pH
二、甲壳动物实验
水蚤幼虫的准备
TLm的测定
7.1 长期动物实验
①实验动物的选择：抗病力强、容易饲养、肿瘤 自发率低、寿命长、对受试物敏感。两种或以 上动物 ②动物数目：小型动物 50只；大型减少 ③剂量分组与对照（阴性、阳性对照）： 高剂量（加速致癌）、低剂量（接近人类）
④染毒途径：口、皮肤、注射
⑤实验时间：动物生命期的1/3～1/2 ⑥指标观测：外表、行为、X射线、病理
第四节 急性毒性实验
4.1 急性毒性实验的内容
①急性毒性测定－LD50 / LC50 ②皮肤染毒实验－经皮肤进入 ③局部作用实验－有无刺激腐蚀 ④中毒症状的观察－作用程度、部位
⑤功能及病理组织学检查－部位、程度
4.2 哺乳动物的急性毒性实验
一、半致死剂量的测定（途径？）
（1）动物准备(小动物、预观察) （2）剂量选择 （3）药液配置及染毒－等容量法
学检查
⑦结果评判：
潜伏期：第一例
病理学检查：恶性、良性、癌前期变
阳性结果的判断：肿瘤数、潜伏期短
7.2 短期筛检方法
• Ames实验：外源化学物致突变作用 • DNA修复测定：3H-Tdr • 哺乳动物细胞的体外恶性转化
Ames试验
• 组氨酸营养缺陷型菌株（His-）
His受试物
组氨酸缺乏培养基
需求多 静脉采血、动脉 注意：光线、温度、器皿消毒、
抗凝剂
割（剪）尾取血 眼眶静脉丛采血 断头取血 颈动脉取血 腹主动脉 股动（静）脉取血
动物品种
最大安全采血量 最小致死采血量 (ml) (ml) 0.3 2 10 40 500 200 60
小鼠 大鼠 豚鼠 兔 狼狗 猎狗 猴
0.2 1 5 10 100 50 15
观察染色体的完整性
• 哺乳动物体内骨髓细胞遗传学试验
• 人外周血淋巴细胞遗传学试验 (T、B cell)
未分裂，G0期 加秋水仙素抑制有丝分裂，使染色体 停滞在分裂中期
三、微核试验
• 用于检测染色体断裂剂（诱裂剂）和纺 锤体毒物 • 小鼠或大鼠骨髓 高剂量 • 每只动物计数1000个以上嗜多染红细胞 • 评价：正常水平：单个动物 0.4％；一组
有害成分提取，再用提取物进行染毒。
③此法需在动物麻醉下进行，难度较大，适宜急性试验
2.3 经口染毒法
• 不挥发性液体和固体毒物
灌胃法－液体或制剂
喂饲法－混在食物中 经口滴入－淀粉糊剂
吞咽－胶囊
2.4 注射染毒法
• 毒物对局部损害不能太大
①腹腔注射
②肌内注射
不溶于水但溶于油或其他溶剂
③静脉注射
④皮下注射
第二节 常用染毒技术 2.常用染毒途径
吸入染毒、经皮肤染毒－最重要的
灌胃
气管注入 注射（腹腔、静脉、肌内、皮下）
根据实验目的进行选择，同时考虑： （1）人群接触环境毒物的实际情况
生产车间－呼吸道
（2）毒物的理化性质
固态、液态、气态
（3）受检毒物的来源
消耗量的大小
2.1 吸入染毒法－大气污染物
1） 动式吸入染毒法
新化学物质—整体状态、非特异性指标
• 实验方法
游泳试验、刺激阈试验
三、局部作用试验
• 皮肤和黏膜症状（豚鼠、家兔） • 急性皮肤刺激/腐蚀试验 • 急性眼刺激/腐蚀试验
结膜囊染毒
四、急性联合毒性的测定
• 过筛试验
确定大概的作用类型 1/2LD50
①死亡率>80%，增毒；30％～80％，
相加；<30％，拮抗 ②实测死亡率（O）/预期死亡率（P）