毛细管电泳原理及分析策略CE
毛细管电泳法 CE
⑴ 离子移动的速率：
e E
e
U L
U：毛细管两端施加的电压 V L：毛细管总长度 cm
e 离子运动速度 cm/s
可以看出：采用高电压使离子迅速移动和快速分离 。显然，在分离中不仅需要快速分离，更希望获得高分 离度。
⑵ 毛细管电泳的板高：
在色谱中，纵向扩散和传质阻力是影响谱峰展宽的 重要因素，而毛细管电泳只有纵向扩散影响谱峰展宽 （板高），在电泳中的塔板数：
⑷ 试样用量少：仅需几nL（10-9 L）的试样。 ⑸ 仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升 流动液。 ⑹ 应用：除分离生物大分子（肽、蛋白、 DNA 、糖 等）外，还可用于小分子（氨基酸、药物等）及离子 (无机、有机)，甚至可以分离各种颗粒（硅胶颗粒等）。 从无机离子到整个细胞，具有“万能”分析功能或潜力。 ⑦ 自动：CE是目前自动化程度最高的分离方法。 ⑧ 通常使用水溶液，对人和环境无害。
N eU
2D
D : 组分扩散系数 U：毛细管两端施加的电压 V
注意：N∝U，R随N增加而增加，因此要获得高的分离 度应采用高电压。电泳与色谱法不同，其塔板数并不随 柱长的加长而增加。
在毛细管电泳中，一般可采用20000～60000V的 高压，使得分离速度和分离度有明显的改善，N一般为 100000 ～200000，而HPLC N为5000～20000。 ⑶ 电渗流(EOF) ：
㈢ 改变电泳介质的温度； ㈣ 处理毛细管壁表面。
⑷ 电渗流的流型 在毛细管内，电渗流的流速轮廓适宜平面，如同瓶
塞一样流动，不存在径向的流速梯度。而在液相色谱
中，由泵推动的压差引起的流速轮廓是抛物面。这是
毛细管电泳柱效高于高效液相色谱法的原因。
毛细管电泳法的特点和CE-MS的构造
自动化与智能化
通过自动化和智能化技术，实现CE-MS的 远程控制和实时监测，提高分析效率。
解决实际应用中的问题
样品处理
优化样品处理方法，减少基质干扰，提高分析准确度。
交叉污染
采取有效措施减少交叉污染，如定期清洗、更换分离介质等，确保分析结果的可靠性。
谢谢
Байду номын сангаасTHANKS
03 CE-MS的构造
CHAPTER
毛细管电泳仪
高效分离
毛细管电泳仪利用电场对 带电粒子的作用力，实现 高效分离不同成分的物质。
微量进样
毛细管电泳仪采用微米级 的进样体积，可减少样品 消耗，降低实验成本。
高灵敏度
毛细管电泳技术结合激光 诱导荧光检测等高灵敏度 检测方法，可实现对痕量 物质的检测。
质谱仪
分子结构分析
质谱仪通过测量分子在电场和磁 场中的行为，确定分子的质量和
结构信息。
高选择性
质谱技术可对复杂混合物中的目标 分子进行高选择性检测，排除干扰 物质。
定量分析
质谱技术可实现目标分子的定量分 析，提供准确的物质浓度信息。
接口设计
高效传输
接口设计的主要目标是实现毛细管电 泳分离后的样品溶液高效传输至质谱 仪。
原理
在毛细管中施加电场，带电粒子在电 场作用下产生迁移，根据其在电场中 的迁移速度差异实现分离。
发展历程
1980年代初期
毛细管电泳技术开始发展，研究者发 现使用毛细管可以产生电渗流，为电 泳提供驱动力。
1980年代中期
成功分离氨基酸和多肽，奠定了毛细 管电泳在生物分析领域的应用基础。
1990年代
毛细管电泳技术得到广泛应用，涉及 蛋白质、DNA、糖类等多种生物分 子的分离分析。
毛细管电泳技术在检测分析中的应用
2011-12-31 毛细管电泳技术及其在检测分析中的应用分析化学毛细管电泳技术及其在检测分析中的应用摘要：毛细管电泳技术(CE)作为现今一种主要的分析技术，凭借其高效、灵敏、快速、设备简单、广泛适用性等特点，广泛应用于各个领域。
本文简要概述了CE技术的原理及特点，并简述了它在环境分析、食品分析、药物分析、生物大分子分析等各个领域的应用。
关键词：毛细管电泳；分析；应用1.毛细管电泳技术简介1.1 产生与发展毛细管电泳技术（Capillary Electrophoresis, CE）是一种在电泳技术的基础上发展的一种现代分离技术。
电泳技术作为一种分离技术已有近百年历史，1937 年A.Tiselius首先提出：传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热。
1967年，Hjerten最先提出了毛细管电泳的雏形，即在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳。
但他并没有完全克服传统电泳的弊端。
直至1981年Jorgenson和Lukacs提出在75μm内径毛细管柱内用高电压进行分离, 这时现代毛细管电泳技术真正产生。
1984 年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支：胶束电动毛细管色谱（MEKC）。
1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。
同年，Cohen 发表了毛细管凝胶电泳的工作。
近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的应用范围。
毛细管电泳技术兼有高压电泳及高效液相色谱等优点，其突出特点是：（1）所需样品量少、仪器简单、操作简便。
（2）分析速度快，分离效率高，分辨率高，灵敏度高。
（3）操作模式多，开发分析方法容易。
（4）实验成本低，消耗少。
（5）应用范围极广。
自1988年出现了第一批毛细管电泳商品仪器，短短几年内, 由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶，抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求,得到了迅速的发展。
(一)定义毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)
随着我国对药品质量的日益重视和自主药物研发的迫 切需要，色谱分析和光谱分析已成为药物研究中最重要的 分析方法，色谱分析和光谱分析技术结合的联用技术更 是必不可少，发展十分迅速。
现代药物分析方法和技术为药学的发展提供了技术支持。
第十七章 药品质量控制中现代分析方法的进展
一、毛细管电泳及其应用
(二) CE的主要优点：
高效 理论塔板数每米几十万，高者可达 几百万甚至几千万；
高速 最快可在约1分钟完成； 微量 只需纳升级的进样量； 低消耗 只需少量溶剂和价格低廉的毛细管。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
一、毛细管电泳及其应用
(三)主要分离模式
➢ 毛细管区带电泳：以离子状态存在的样品（最基本、应用最广泛）。 ➢ 胶束电动毛细管色谱：非离子状态的样品。 ➢ 毛细管凝胶电泳：蛋白质，DNA等生物大分子。 ➢ 微芯片毛细管电泳：基因序列分析。 ➢ 毛细管电色谱：带电物质 和中性物质（融合CE和HPLC ） 。 ➢ 毛细管等电聚焦电泳： ➢ 毛细管等速电泳：
一、毛细管电泳及其应用
主 二、手性HPLC技术及其应用
要
三、GC-MS技术及其应用
内
四、LC-MS技术及其应用
容
五、液相色谱-核磁共振技术及其应用
一、毛细管电泳及其应用
一、毛细管电泳及其应用
（一）定义
毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）是指 以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据 样品中各组分之间淌度和（或）分配行为上的差异 而实现分离的一种液相分配技术。它是经典电泳技 术和现代微柱分离相结合的产物。 CE和HPLC的使用范围在很大程度上互为补充。
毛细管电泳的原理及应用(第二讲)毛细管电泳的原理及应用
５ ０ｍ增至 ５０ｍ； ０ Ｚ型可使光径从 ５ ０ｍ增至
３ ｍ， ｍ 增加 了近 ６ 倍 ， ０ 可使信 噪 比提 高 至原来 的 ６ 倍 ， 因体 积增 加 将 引起 ２％ 但 ０ ３ ％的 谱带 扩 张 ， ０ 导致 柱效 下降［。 ５ 此外 ， 毛细管价格昂贵也是需 ］ 特殊 考虑 的。 对于普通毛细管 ， 有以下两种设计来增加光 路 长度 ： 向照射 是将光 束从毛 细管 末端 沿管 轴方 轴 向入 射 ， 在毛细管侧面进行检测 ［。 ６ 一般用激光作光 ］ 源， 荧光检 测 ， ５ｍ 毛细管 ， 法 可使光 路 长度 对 ０ 此 增 为 ２ ｍ， ｍ 灵敏度可增加近 ５ 倍 ， 效损失 ２ ０ 但柱 ５％ ～ ０ ％。另一种是多次 反射 池［， ７ 毛细管壁 镀上银 ， ］
溶液在几 千伏 电压作 用下 ， 表面 带 电产 生库仑 排斥 力， 使液滴成雾状喷 出。 引入 离子 源中的热氮气流使 雾状液滴蒸发 ， 形成离子流 ， 经聚焦进入质谱仪［ ８。
Ｃ ／ 在肽链序列及蛋白结构、 ＥＭＳ 分子量测定等
方面［］ 卓越 的表现 ， 多方 面 的研 究正 在开 展 ， １有 ９ 许 可以预见这是最有发展前途 的技术之 一。
（ｅ－ ｙ ｐ３， ｐｎｒ ｌ ａ ａ ｍ ］可将光线聚焦到毛细管上， 对溶 菌酶的检测限可达 １ｆｏ １－ｍ ｌ ， ８ｍ ｌ ０５ ｏ Ｌ 线性范围 ／
为４ 个数 量级 ； 展吸光光路长度 ： ③扩 可通过很多巧 妙的设计来扩展光路长度 ， ： 如 为了克 服圆柱形毛细 管表面 引起散射 、 失真 等不 利的光学 特性及 增加光
成。其检测限 以 Ｌ＋计可达 １－ｍ ｌ １－ ｉ ０７ ｏ／ ０１ Ｌ ８
ｍ ｌ［］ 柱尾检测 则在 分离毛细管后再接上 电导检 ｏ ２。 ０ 测器 。还有 的是将柱尾 电导检测器和 安培检测器组
高效毛细管电泳法原理
毛细管区带电泳（CZE）
CZE又称毛细管自由电泳，是毛细管电泳中最基本、应用最普遍的一种模式。它在毛细管中 仅填充缓冲液，基于溶质组分在电场中的迁移速度不同而分离。前述的基本原理即是CZE 的基本原理。
毛细管胶束电动色谱（MECC）
毛细管胶束电动色谱是电泳技术和色谱技术巧妙结合的分离新技术，也是毛细管电泳中唯 一能同时分离中性物质和离子型物质的分离模式。
简称毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE），指以高压电场为驱动力，以毛细管为 分离通道，依据样品中各组分之间淌度和（或）分配行为上的差异而实现分离的一种液相分 配技术。CE是经典电泳技术和现代微柱分离技术相结合的产物。
基本装置
CE 的基本装置包括一个高压支流电源、一根毛细管、一个检测器及两个供毛细管两端插入 而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。
高效毛细管电泳
高效毛细管电泳相对于经典电泳在技术上采取了两项重要改进： 一是采用了0.05mm内径的毛细管, 二是采用了高达数千伏的电压。 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高；
电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加。
基本理论
在电解质溶液中，带电粒子在电场作用 下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移。迁 移速度为：
试中Vep为离子电泳迁移速度， μep为电泳淌度，E为电场强度, q为离子电荷量，η为介质粘度， r为离子半径。
Vep=μep ·E=
q
·E 6πηr
基本理论
CE所用的石英毛细管柱，在pH>3时，石英毛细 管壁上的硅醇基(— SiOH）在水溶液中发生电 离，产生的SiOˉ负离子使毛细管壁内表面带负 电，和溶液接触时相应的缓冲液带正电，形成 了双电层。
ce-ms工作原理
ce-ms工作原理
CE-MS是毛细管电泳-质谱联用技术的缩写，它结合了毛细管电泳（CE）和质谱（MS）两种分析技术。
毛细管电泳是一种用于分离离子或分子的技术，它利用带电粒子在电场中的迁移速度差异来实现分离。
而质谱则是一种分析化学技术，用于确定化合物的分子质量和结构。
在CE-MS中，样品首先通过毛细管电泳分离，然后进入质谱分析器进行检测。
这种联用技术可以充分发挥毛细管电泳和质谱的优势，实现对复杂混合物的高效分离和准确检测。
毛细管电泳可以提供高分辨率和高效率的分离，而质谱可以提供高灵敏度和特异性的检测。
因此，CE-MS广泛应用于生物医学、环境分析和食品安全等领域，为复杂样品的分析提供了强大的工具。
毛细管电泳原理及分析策略CE
电源系统
电源要求
毛细管电泳仪的电源系统需要提供稳定的直流电，以保证仪器的 正常运行和实验结果的准确性。
电压调节
毛细管电泳仪的电压调节范围通常很宽，可以从几千伏到几十万伏， 以满足不同实验条件的需求。
电流控制
为了保护仪器和保证实验结果的准确性，电源系统通常需要具备电 流控制功能，能够限制电流的大小和方向。
工业废水等。
重金属离子分析
02
毛细管电泳可以用于分离和测定环境中的重金属离子，如铅、
汞、镉等。
营养物质与毒素分析
03
毛细管电泳可以用于分离和测定环境中的营养物质与毒素，如
硝酸盐、亚硝酸盐等。
04 毛细管电泳的优缺点
CHAPTER
优点
高分离效率
毛细管电泳采用微米级别的分离通道， 能够实现高分离效率，尤其适用于复 杂样品的分析。
毛细管电泳可以分为多种类型， 如自由溶液毛细管电泳、凝胶毛 细管电泳、等电聚焦毛细管电泳、
亲和毛细管电泳等。
根据检测方式分类
毛细管电泳也可以分为多种类型， 如紫外可见吸收光谱检测、荧光检 测、质谱检测等。
根据应用领域分类
毛细管电泳还可以分为临床检测、 生物分子分析、环境监测等领域。
02 毛细管电泳仪器
在药物分析中的应用
药物成分分离
毛细管电泳能够快速分离和测定药物中的有效成分和杂质。
药物代谢产物分析
毛细管电泳可以用于药物代谢产物的分离和鉴定，有助于药物代 谢动力学研究。
药物质量控制
毛细管电泳可用于药物质量控制，确保药物的有效性和安全性。
在环境监测中的应用
有机污染物分析
01
毛细管电泳可以用于分离和测定环境中的有机污染物，如农药、
第十三章毛细管电泳CapillaryElectrophoresisCE
第二节 高效毛细管电泳的基本原理
➢ 溶质在毛细管区带电泳过程中的传递
含离子的溶液，在电场中所发生的物理过程 服从欧姆定律，当有直流电通过溶液时，阴离子 向阳极迁极，阳离子向阴极迁移，溶液的导电率 取决于离于浓度和其迁移率(又称淌度，即指溶质 在单位时间和单位电场强度下移动的距离)。离子 迁移率以μ表示，其大小受溶质的电荷／离子大 小比例所控制。
对于大分子或胶体，其关系可表示为
ep
2 3
•
f
• K
➢ HPCE分离，几乎都是在熔融石英毛细管 中完成的，熔融石英是一种高度交联的 SiO2聚合物，具有很好的抗拉强度。石英 毛细管表面含有许多硅酸基（Si—OH）， 在一定的条件下可离解。使表面带有负电 荷。
由于表面带负电，因此，带负电荷的 离子被表面排斥，而带正电均离子则被毛 细管壁吸引。
➢ 毛细管电泳，又称高效毛细管电泳
（High Performance capillary electrophoresis，HPCE），
它不同于经典的区带电泳，有如下特点：
（1）它是在内径（10～200）μm的石英毛细管 中进行的，在毛细管中的散热较好，沿着管截面的 温度梯度很小，因此，可以提高加在毛细管两端的 电压，所加电压可高达几十千伏。
υep ＝q·E／f
将上述表达式合并，作为电泳迁移率（或电泳 淌度）μep 。表示式，则
μep＝υep／E＝q士／6πηr
电泳迁移率定义为பைடு நூலகம்一种质点在每单位电场强 度下的稳态速度。
μep 值的大小，取决于分子的净电荷数及 其摩擦性质，（分子大小和形状）以及 所用介质的介电常数ε和粘度η。因而， 对于每一种质点，在电场作用下的迁移 均具有特定的速度。
毛细管电泳的基本原理及应用
毛细管电泳的基本原理及应用摘要：毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。
该技术可分析的成分小至有机离子、大至生物大分子如蛋白质、核酸等。
可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，比HPLC 分析高效、快速、微量。
关键词：毛细管电泳原理分离模式应用1概述毛细管电泳(Caillary Electrophoresis)简称CE，是一类以毛细管为分离通道，以高压直流场为驱动力的新型液相分离分析技术。
CE的历史可以追溯到1967年瑞典Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳(Capillary Zone Electro-phoresis，CZE)。
但他没有完全克服传统电泳的弊端[1]。
现在所说的毛细管电泳(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他们使用了75mm的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离。
1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支: 胶束电动毛细管色谱(MEKC)。
1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。
同年，Cohen 发表了毛细管凝胶电泳的工作。
近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的应用范围。
毛细管电泳和高效液相色谱（HPLC）一样，同是液相分离技术，因此在很大程度上HPCE与HPLC可以互为补充，但是无论从效率、速度、样品用量和成本来说，毛细管电泳都显示了一定的优势毛细管电泳（C E）除了比其它色谱分离分析方法具有效率更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、应用面同样广泛等优点外，其仪器结构也比高效液相色谱（HPLC）简单。
C E只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器。
毛细管电泳具有分析速度快、分离效率高、试验成本低、消耗少、操作简便等特点，因此广泛应用于分子生物学、医学、药学、材料学以及与化学有关的化工、环保、食品、饮料等各个领域[2]。
毛细管电泳原理及分析策略2010
– 焦耳热
温度轮廓 ---- 黏度轮廓 ----速度轮廓
细内径（<100µm），粗外径的毛细管柱
4 区带宽度及其展宽因素
– 进样
试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。 细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。 一般进样区带控制在柱长的1%
– 电泳扩散
试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或 电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差异，而引起区带电分散。
常用的CE缓冲体系
• • • • 磷酸钠体系 宽缓冲范围 硼酸钠体系 高pH范围 Tris-HCl体系 低pH范围 醋酸-醋酸铵体系 CE/MS常用体系
CZE分离条件的选择
• • • • • 毛细管类型--涂层还是非涂层？ 毛细管长度--长毛细管还是短毛细管？ 缓冲液体系--种类和pH值 添加剂类型--甲醇|环糊精|乙腈 检测器选择--紫外|二极管阵列|激光诱导荧光
毛细管凝胶电泳
CE双链及单链核酸分析
3.0
Relative Fluorescence Intensity
dsDNA片段 (72 bp-12 Kbp)
2 0 23 1 9 18 26 25 27 24 28 29 30 13 11 10 15 12 14 16 17 21
45-寡核苷酸质控
2.0
IS
– Minimizes band broadening – Narrows detection zone
电渗流的活塞流特点
• Hydrodynamic flow – Parabolic – Resistance to flow at surface – More diffusion/broader detection zone
毛细管电泳法的特点和CEMS的构造
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实验操作流程
01
02
03
04
样品处理
将待分析样品进行适当的预处 理，如稀释、过滤、离心等，
以去除杂质和干扰物质。
毛细管清洗与填充
使用适当的清洗液清洗毛细管 内壁，然后填充合适的缓冲液
和胶体。
进样与分离
将预处理后的样品注入毛细管 ，在电场作用下进行分离。
检测与记录
采用适当的检测器对分离后的 组分进行检测，记录检测数据
高通量分析
随着技术的不断发展，毛细管电泳法在高通量分析方面取得了重要进展，能够同时分离和检测多个样 品中的组分。
多模式分析
除了传统的分离模式外，毛细管电泳法还发展出了多种分离模式，如毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚 焦等，能够适应不同组分的分离需求。
cems的发展趋势与展望
• 微纳尺度分离：随着微纳加工技术的进步，毛细 管电泳法的分离通道尺寸越来越小，分离效率越 来越高。
03
毛细管电泳-质谱联用系统（Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry，简 称CE-MS）：CE-MS是将毛细管电泳分离技术与质谱检测技术相结合的分析方法， 具有高分离效能、高灵敏度、高分辨率等优点。
cems的构造与原理
进样系统
进样系统是将待测样品引入到毛细管电泳分离通 道的装置，一般采用注射器、定量环或自动进样 器等。
对缓冲液和电极的要求高
01
毛细管电泳法的分离效果受到缓冲液和电极质量的影响较大，
需要高质量的试剂和电极才能获得准确的结果。
对样品前处理的依赖性较大
02
对于复杂样品，需要进行适当的前处理才能进行有效的分离和
毛细管电泳的原理及应用(第二讲)毛细管电泳的原理及应用.
（２）激 光诱导荧 光检测器 （ＬＩＦ ：激光 的高 光流 量 、聚光性 、单 色性等 特点使 其成 为理想 的激励源 。 常 用 氦－镉 激 光 器 （３２５ｎｍ ）和 氩 离 子 激 光 器 （４８８ｎｍ 。对荧光 黄最 低检 测限 为 １０－ ｍｏｌ／Ｌ，约 ６００００个分子或更低［。 有关ＬＩＦ的应用可参见最 新文献［１。
５ 电化学检测器
电化学检测器 （ＥＣ）可避免 ＣＥ中光学类检测器 遇到的光程太短 的问题 ＥＣ和 ＬＩＦ同为 ＣＥ中灵敏 度最高的检测器 ，其缺点在于商 品化较难 ，至今没有 商品 电化学检测器供 应 。
（１电导检测器 ：柱 上电导检测是 在毛细管 壁上 用激 光钻 两 个孔 ，插 上 两根 铂 电极 ，再 将孔 封 住 即 成。其检测限 以 Ｌｉ＋计可达 １０－７ｍｏｌ／Ｌ １０－１８ ｍｏｌ［２０］。柱尾检测 则在 分离毛细管后再接上 电导检 测器 。还有 的是将柱尾 电导检测器和 安培检测器组
×１０－ｍｏｌ１．３ １０－１２ｍｏｌ／Ｌ １３］。还出现荧光二极 管 阵 列检 测 器［４和 ＬＩＦ／电荷 藕 合 器 件 （ＣＣＤ）系 统［１］，对 ＦＩＴＣ衍生氨基酸 的检 测限为 ２ １０－２０ｍｏｌ （约 １０－１２ｍｏｌ／Ｌ。最新的动向是采用价格低廉的半 导体激光器作激励源［１６］，激发波长在 ６３５ ８５０ｎｍ， 用于可 见和近红 外区 ，检测 限可达 ｆｍｏｌ级。
用激 光束 聚焦到毛 细管 上 ，产生 的散射光 由一 束 围绕着毛 细管 的光纤 引导到拉曼光谱仪 的接收器 上 ，即构成 了激光 拉曼检测器 ，检测限 以甲基红计 ， 为２．５ １０－６ｍｏｌ／Ｌ［２６］，与ＵＶ检测器相当。也可采 用 ＣＣＤ作拉 曼光谱检测器 ［２７］。这种检测方法 的最 大特点是能 获得 溶质 的结构信息 。
毛细管电泳分析方法的工作原理介绍
毛细管电泳分析方法的工作原理介绍毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)又叫高效毛细管电泳(HPCE), 是近年来发展最快的分析方法之一。
1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75μm内径毛细管柱内用高电压进行分离, 创立了现代毛细管电泳。
1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。
1987年Hjerten 建立了毛细管等电聚焦, Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。
1988～1989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。
短短几年内, 由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶，抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求, 得到了迅速的发展。
CE是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。
CE和高效液相色谱法(HPLC)相比, 其相同处在于都是高效分离技术, 仪器操作均可自动化, 且二者均有多种不同分离模式。
二者之间的差异在于：CE用迁移时间取代HPLC中的保留时间, CE的分析时间通常不超过30min, 比HPLC速度快；对CE而言, 从理论上推得其理论塔板高度和溶质的扩散系数成正比, 对扩散系数小的生物大分子而言, 其柱效就要比HPLC高得多；CE所需样品为nl级, 最低可达270fl, 流动相用量也只需几毫升, 而HPLC所需样品为μl 级, 流动相则需几百毫升乃至更多；但CE仅能实现微量制备, 而HPLC可作常量制备。
CE和普通电泳相比, 由于其采用高电场, 因此分离速度要快得多；检测器则除了未能和原子吸收及红外光谱连接以外, 其它类型检测器均已和CE实现了连接检测；一般电泳定量精度差,而CE和HPLC相近；CE操作自动化程度比普通电泳要高得多。
总之, CE的优点可概括为三高二少：高灵敏度, 常用紫外检测器的检测限可达10-13～10-15mol,激光诱导荧光检测器则达10-19～10-21mol；高分辨率, 其每米理论塔板数为几十万；高者可达几百万乃至千万, 而HPLC一般为几千到几万；高速度, 最快可在60s内完成, 在250s内分离10种蛋白质, 1.7min分离19种阳离子, 3min内分离30种阴离子；样品少, 只需nl (10-9 L)级的进样量；成本低, 只需少量(几毫升)流动相和价格低廉的毛细管。
毛细管电泳法
数据处理 检测器 电极 缓冲液
进样方法
1、电动进样 也称电迁移进样.
方法:将毛细管的进样端插入装有试样溶液的 试样管中，试样管中插入电极，与检测端 的缓冲液间施加进样电压，并维持一定时 间，试样溶液在电泳和电渗流作用下进入 毛细管，然后再将试样溶液换成载体缓冲 液，电泳即可进行。
电渗流的意义
电泳过程中，伴随着电渗现象 2. 电渗流的速度比电泳速度快5－7倍 3. 利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向 同一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中 同时完成正、负离子的分离分析 电渗流是毛细管电泳分离的重要参数 控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分 离的效率、重现性、分离度。
毛细管凝胶电泳综合了电泳技术和平板 凝胶电泳的优点 : 1. 电泳峰尖锐，柱效极高 2. 短柱上实现极好的分离 3. 试样容量为10－12g 主要缺点:制备柱较困难，寿命较短 已成为分离分析生物大分子如蛋白质、 多肽、核 酸、DNA等强有力的工具。 例应用CGE分离与激光诱导荧光检测相 结合，用于DNA序列快速分析。
电泳溶液硼砂30 mmol.L-1 (pH 9.43),检测波长295 nm,34 kPa.s压力进样，17 kV恒压电泳，电泳时间10 min，电泳温度 20℃，进样分析溶液中均含硼砂3.0 mmol.L-1 (pH=9.43)。 为消除进样等因素所引起的误差，采用内标定量法。实验 发现p-NBA出峰时间在LIG与FA之间，在优化条件下样品中杂 质对其无干扰，峰形好，用它作内标可明显改善分析精密度， 故选定p-NBA为内标，在进样分析溶液中浓度为60 μg.mL-1。
若某一区带的离子进入前一区带， 由于 电场强度变小而减速，由若进入到下区 带，由于电场强度变大而加速， 都退回 到原区带, 结果导致各区带形成鲜明的 界面.
毛细管电泳的基本原理及应用
毛细管电泳的基起源基础理及运用摘要：毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分别通道,以高压直流电场为驱动力,根据样品中各组分之间淌度和分派行动上的差别而实现分别的电泳分别剖析办法.该技巧可剖析的成分小至有机离子.大至生物大分子如蛋白质.核酸等.可用于剖析多种体液样本如血清或血浆.尿.脑脊液及唾液等,比HPLC剖析高效.快速.微量.症结词：毛细管电泳道理分别模式运用1概述毛细管电泳 (Caillary Electrophoresis)简称 CE,是一类以毛细管为分别通道,以高压直流场为驱动力的新型液相分别剖析技巧.CE的汗青可以追溯到 1967年瑞典Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳(Capillary Zone Electro-phoresis,CZE).但他没有完整战胜传统电泳的弊病[1].如今所说的毛细管电泳(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年起首提出,他们运用了75mm的毛细管柱,用荧光检测器对多种组分实现了分别.1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳,首创了毛细管电泳的重要分支: 胶束电动毛细管色谱(MEKC).1987年Hjerten 等把传统的等电聚焦进程转移到毛细管内进行.同年,Cohen 揭橥了毛细管凝胶电泳的工作.近年来,将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中,又成长了电色谱,扩展了电泳的运用规模.毛细管电泳和高效液相色谱（HPLC）一样,同是液相分别技巧,是以在很大程度上HPCE与HPLC可以互为填补,但是无论从效力.速度.样品用量和成本来说,毛细管电泳都显示了必定的优势毛细管电泳（C E）除了比其它色谱分别剖析办法具有效力更高.速度更快.样品和试剂耗量更少.运用面同样普遍等长处外,其仪器构造也比高效液相色谱（HPLC）简略. C E只需高压直流电源. 进样装配. 毛细管和检测器.毛细管电泳具有剖析速度快.分别效力高.实验成本低.消费少.操纵轻便等特色,是以普遍运用于分子生物学.医学.药学.材料学以及与化学有关的化工.环保.食物.饮料等各个范畴[2].2毛细管电泳的装备和基起源基础理毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分别通道,以高压直流电场为驱动力,根据样品中各组分之间淌度和分派行动上的差别而实现分别的电泳分别剖析办法[3].毛细管电泳仪的根本构成如图1.1 所示 .熔融石英毛细管的两头分别浸在含有电解缓冲液的贮液瓶中,毛细管内也充满同样的电解缓冲液.在毛细管接收端之前装配在线检测体系.被剖析样品可以从进样体系采取重力法.电迁徙法.抽真空法等多种进样方法引入到毛细管的进样端.当样品被引入后,便开端在毛细管两头施加电压 .样品溶液中溶质的带电组分在电场的感化下根据各自的荷质比向检测体系偏向定向迁徙.CE中的毛细管今朝大多是石英材料.当石英毛细管中充入 pH值大于 3的电解质溶液时 ,管壁的硅羟基(- SiOH)便部分化离成硅羟基负离子(- SiO-) ,使管壁带负电荷.在静电引力下 ,- SiO-会把电解质溶液中的阳离子吸引到管壁邻近,并在必定距离内形成阳离子相对多余的集中双电层 (见图 2[4]).在外电场感化下 ,上述阳离子会向阴极移动.因为这些阳离子现实上是溶剂化的(水化的),它们将带着毛细管中的液体一路向阴极移动,这就是 CE中的电渗流(EOF).电渗流的强度很高,乃至于所有进入毛细管中的样品,不管是阴离子.阳离子或中性分子,都邑跟着液体向阴极移动.因待测样品中正离子的电泳偏向与电渗流偏向一致,故最先到达毛细管的阴极端;中性粒子的电泳速度为零 ,迁徙速度与电渗流速度相当;而负离子的电泳偏向则与电渗流偏向相反,但因电渗流速度约等于一般离子电泳速度的 5～7倍[5],故负离子也将在中性粒子之后到达毛细管的阴极端.因为各类粒子在毛细管内的迁徙速度不一致,因而使各类粒子在毛细管内可以或许达到很好的分别.3 毛细管电泳的分别模式根据分别道理不合,CE分别根本模式有6种,如表 1 所示.表 1 毛细管电泳的分别模式和运用Tab. 1 Separation modes and application of CE以上各模式以毛细管区带电泳.毛细管凝胶电泳.胶束电动毛细管色谱这3种运用较多.4 毛细管电泳的运用4.1 CE在药物成分剖析中的运用今朝,CE在自然中草药剖析范畴中的运用重要分散在生物碱和黄酮及其甙类方面.蒽醌类剖析也有报导.生物碱有相似于碱的性质,在pH < 7的缓冲液中运用 CZE 分别.纪秀红等[6]拔取马钱子碱为内标物,在磷酸/甲醇缓冲溶液中 ,测定了小檗碱.巴马亭.药根碱的含量.黄酮类化合物大多是中性分子,重要采取 MECC 模式分别.LiYM[7]以SDS(十六烷基磺酸钠)为阴离子概况活性剂将黄芩中的 6 种重要的黄酮类化合物分别.李伟等[8]以磷酸盐为缓冲体系 ,运用 CZE模式分别. 测定了大黄提取液中离蒽醌化合物的含量.4. 2 CE在手性拆分中的运用CE因其高效.快速.选择性强的特色而成为今朝最有效的手性拆分办法.各类CE分别模式皆可用于对映异构体分别,是以手性拆分成为 CE运用最活泼. 最奇特的范畴.个中,添加剂法只需向电泳缓冲液中参加合适的手性试剂,经由必定的分别前提优化即能实现手性分别.又因为可选择的添加剂种类很多,此法是 CE进行手性拆分的重要情势.今朝 ,重要的手性添加剂有环糊精类（CDs).冠醚类.大环抗生素.蛋白质等.仅环糊精一类就有α-CD,β-CD,γ-CD,HP-α-CD, CM-β-CD 等多种添加物资 ,其运用十分普遍.此外,其他种类添加剂的运用联合 MECC和 NACE 模式根本上能实现各类手性药物的拆分[9～11].4.3 CE用于肽和蛋白剖析CE在蛋白质分别剖析中的运用重要包含肽和蛋白的辨别剖析.构造剖析.微量制备,蛋白的定量测定.纯度检测.非均一性检测.定性和动力学研讨.CE在肽和蛋白质的别剖析中运用最多的是CZE测定肽谱, SDS-CGE测蛋白分子量及CE-MS直接测定分子量.用CZE还可测定蛋白的物理参数,如蛋白的有效尺寸.电荷和集中系数.用CIEF测定蛋白等电点比平板凝胶电泳测等电点的办法简略,可直接监测.蛋白被酶解或化学裂解成肽片段,运用CZE的高分辩率分别后所得的电泳图称CE肽图.肽图是进行蛋白序列剖析的第一步,随后可用CE进行微量制备,再测定各片段的氨基酸序列,即可得出全部蛋白的一级构造.CE的制备总量比高效液相色谱低,只实用于微量制备.对集中系数小的生物大分子而言,CE比HPLC的分辩率高得多, 是以CE被用来作为收集异常纯的单一馏份的微量制备的手腕.在有些情形下,CE定量线性规模可达(3个数目级). 4.4 CE用于糖类的剖析近年来,毛细管电泳已成为剖析单糖.寡糖.糖肽.糖蛋白等糖类化合物的有力兵器,在糖型剖析.方面也取得了较大的成功单糖的pKa6值一般大于11,故需选用强碱性的缓冲液（pH>11）,使糖基上的羟基去质子而带负电荷, 直接进行电泳分别,用紫外（195nm）检测.也可以选用硼酸盐缓冲液,硼酸盐与糖基络合形成带负电荷的络合物以进行电泳分别,用紫外检测.简略单糖的剖析办法也适于简略寡糖的剖析[12].多糖一般运用酸解或酶解的办法将其转化为寡糖落后行剖析.糖蛋白经蛋白酶酶解后生成糖肽,糖肽的图谱被以为是糖蛋白的指纹图谱.糖肽的分别主如果基于其pKa 值的不合而进行CE分别,其实不是基于糖链构造的不合, 是以所选用的缓冲液的构成及其pH的选择尤为重要,其检测也是基于蛋白质的检测.糖脂既可以直接用CE分别,也可以用神经酰胺聚糖酶将糖链释放出来落后行剖析.糖胺聚糖（GAG）类糖基的聚糖部分有透明质酸.硫酸软骨素.硫酸角质素和肝素等,一般都含有反复的二糖单元,并且可用裂解酶降解成糖醛酸化酸性寡糖,这些寡糖既带电荷又有紫外接收（232nm）,是以很合实用CE进行剖析.别的,CE在糖型剖析方面也取得了较大的成功.在糖的检测方面,紫外剖析是最早用于CE进行糖类检测的,但它的敏锐度相对不高,检出限一般只有10—6mol数目级.运用激光引诱荧光检测对糖类进行柱前高效荧光标识表记标帜,可使检出限达到10-9mol程度.在改良检测体系的同时,中性糖类的极性标识表记标帜也在不竭改良与完美.个中一种极性标识表记标帜物为8-氨基-萘-1,3,6-三磺酸,运用其可以快速高效地对均一寡糖和庞杂多糖进行分别剖析, 具有很高的分辩率.4.5 CE在临床化学上的运用CE 在临床化学中的运用十分普遍, 所检测样品的起源可分为尿样.血浆血清.脑脊液.红细胞.其它体液或组织以及实验动物活体(invivo)实验.被剖析的组分则包含肽类.各类蛋白.病毒.酶.糖类.寡核苷酸.DNA.小的生物活性分子.离子.药物及其代谢产品.具体运用可分为: 临床疾病诊断临床蛋白剖析. 临床药物监测.代谢研讨.病理研讨.同工酶剖析.聚合酶链反响(PCR )产品剖析.DNA 片段及序列剖析等.所运用的CE 模式包含CZE.MECC.CGE. CITP 和毛细管等电聚焦(CIEF)[13.14].4.6 CE用于检测非均一性(多样性, Heterogeneity)很多纯化蛋白, 甚至在它们的自然状况, 往往都不是单一分子片段, 而是由相干分子构成, 称为非均一性(多样性).产生多样性的原因有: 氨基酸(AA )的序列不合, 如突变体的某地位AA 转变或AA 侧链转变; 后转译产生不合长度的多肽链; 糖蛋白不合程度的糖基化, 如消失不合数目的寡糖链, 寡糖链有不合的单糖构成. 序列及单糖之间的异构衔接. 采取CZE, MECC, CIEF, CE-MS 可检测这些非均一性.用于心脏病的重组人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(rtPA )含 4 个可能糖基.Yim [15]用 CZE 和CIEF 研讨了制备进程中 rtPA 不合糖基化程度引起的非均一性, 成果标明, CIEF办法要比CZE的好.还有效CZE 对人促红细胞生成素( rHuEPO )[16].用MECC对重组人C2干扰素(IFN2C)[17]及CE-MS[18]研讨蛋白的多样性.有关蛋白的非均一性在临床中的一些运用, 如人铁传递蛋白.血清蛋白的变异.异构酶的剖析等.4. 7 CE用于农药残留量的剖析对农药残留物的测定国外研讨的较多.Lazer等[19]将飞翔时光质谱和毛细管电泳仪联用,采取样品聚积技巧进样对 Paraquat 和Diquat 两种除草剂进行了分别,检测限低至 10- 17mol/L.Farran等[20]采取φ(乙腈) = 50 %的磷酸-硼砂缓冲液分别出两种苯氧羧酸类除草剂.Hinsmann 等[21]经由过程主动在线浓缩样品, 采取固相微柱以十二烷基硫酸钠(SDS)作胶束 ,添加少量乙腈 ,在13min 内分别测定了水中的7种不合种类的农药.磺酰脲类化合物是一类相对较新的除草剂 ,是以这一类化合物在水和食物中的残留量的测定十分重要.Lipez Avila等[22]采取3μmODS硅胶填充柱来分别这一类化合物 ,线性规模为1～100mg/L.Mayer等报导了农药Cinosulfuron 及其副产品的毛细管电色谱的分别剖析.游静等[23]对毛细管电泳在农药手性拆分的进展做了综述.4.8 CE用于纯度检测CE在国外分子生物学实验室及生物工程药厂里已普遍用作最有效的纯度检测手腕.当蛋白的疏水性邻近时, 它们在HPLC 柱中往往同时流出, 是以在对蛋白进行构造研讨(包含N 端序列和肽谱)之前, 必须监测从HPLC 所得肽片段的纯度.快速CE 纯度检测可勤俭样品和节俭序列测定所需时光.因CE 和RP2 HPLC 分别机理不合, 所以当用CE 检讨由RP2HPLC 纯化制得的某一合成肽(一个峰, 纯度为 99.12% )时, 发明分出 6 个组分, 主峰纯度仅为50%.或许这就是部分基因工程产品用HPLC 检测纯度很高而现实生物活性却各批差别很大的一个原因.至于用CE 对药厂临盆及QC 作纯度检测的运用实例触目皆是, 如对胰岛素.白细胞介素.人发展激素.粒性巨噬细胞菌落刺激因子(用CIEF )等的检测.纯度检测时用CE 可检测出多肽链上单个氨基酸的差别.CE 用于纯度检测可用CZE,MECC, SDS2 CGE, CIEF 多种模式.还有文献评论辩论了用不合办法(包含RP2 HPLC, IEC2 HPLC, SDS2PA GE 及CE)进行纯度检测的最有效的计谋[24].5 结论作为一种蛋白质.多肽.核酸及其他生物分子分别和剖析的重要技巧,近20年来,毛细管电泳的机理摸索和运用研讨都取得了长足的进展,对毛细管电泳的研讨, 使其分别效力和剖析精度不竭进步,也使其运用范畴不竭扩展,推进了生物技巧的不竭成长.毛细管电泳往后成长偏向仍是持续进步分辩率.速度和检测器的选择性.同时,增长主动进样装配和使之微机化.商品化.别的,将它与质谱仪更好地联合,可对生物分子特征作出更快.更精确的剖析,以进一步拓宽毛细管电泳在生物范畴的运用规模.。
毛细管电泳的原理和应用(第六讲)CE在DNA、糖和离子分析中.
讲座毛细管电泳的原理和应用Ξ第六讲ΥΕ在∆ΝΑ 糖和离子分析中的应用罗国安王义明王如骥王清刚清华大学化学系北京提要简要介绍了在糖和离子分析中的应用∀分析包括分离原理方法及检测手段碱基核苷和核苷酸分析纯度检测和微量制备和分析基因突变检测及序列分析等∀糖分析包括衍生化技术检测方法所用模式及糖复合物的分析等∀离子分析包括阴离子分析原理检测方法影响因素应用及阳离子分析等∀关键词毛细管电泳分析糖分析离子分析分类号 Ù概述本讲对毛细管电泳广泛应用的个领域分析糖分析和离子分析作一简要介绍∀限于篇幅在其它领域如有机化合物高分子金属螯合物燃料和染料等方面的应用就不作介绍了∀∆ΝΑ分析用于分析的第一批文献发表于年∗此后涌现出大批有关分子生物学生物技术临床诊断遗传及法医领域中分析的报道∀与传统的平板凝胶电泳相比具有分析速度快分辨能力高分析过程全自动化及样品用量少等优点受到科学家的青睐∀分离原理分离方法及检测手段分析包括碱基核苷核苷酸寡核苷酸引物探针单链双链片断产物分析∀和通常用来分离碱基核苷核苷酸简单的寡核苷酸等∀则可用于寡核苷酸和等的分离∀在电泳中分离的机理是讨论的热点∀用荧光摄像显微镜可监测到单个分子在电场作用下通过凝胶进行筛分的情景∀但没有任何单个模型能完全计算淌度分子尺寸和实验参数场强凝胶浓度等间的关系∀常用的两种模型为理论和模型∀因每个核酸上磷酸基团带强烈负电荷时其电荷大于其它碱基上的电荷而寡核苷酸的质荷比取决于碱基组成故用很难分离较大的寡核苷酸或∀所以分析大多使用模型∀所用的凝胶制备方式总体可分为两大类化学胶和物理胶∀化学胶是指交联或化学键合到管壁上粘度较高的凝胶∀物理胶则指不交联或键合到管壁上粘度较低的高分子溶液包括无胶筛分所用的聚合物溶液∀在中最常用的材料为聚丙烯酰胺也有用葡聚糖琼脂糖烷基纤维素等的报道∀聚合物的性质对分离的影响可见文献其中十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳被广泛用来测定肽和蛋白质的含量∀用化学胶分离大的寡核苷酸可得到最高的分离度和柱效几千万塔板数Ù 但制备困难使用时容易产生空泡而导致分离失败∀物理胶包括无胶筛分液体胶制备简便用改变浓度来调节分离效果每次分离均用新胶就可避免空泡的产生∀缺点在于分离能力比化学凝胶柱略差∀筛分介质的孔径选择可用曲线测定涂层和未涂层毛细管对分离的影响也有研究报道∀分析常用紫外检测对的片断的最小检测浓度为 Ù ∀但对于生物样品中在和许多其它成分共存的痕量物质测定时或对于特殊分析如序列测定时就使用激光诱导荧光检测器∀加入嵌入染料溴化乙锭还第卷第期色谱年月Ξ国家自然科学基金资助项目本文收稿日期修回日期可改善分离度能将碱基长度相同但序列不同的片断分开∀采用特殊嵌入染料可和或分子发生作用用氩离子激光器时的灵敏度比高∗个数量级∀一般用于分析可达范围∀复杂的检测器可测定人的单个细胞中蛋白和核酸组分甚至可测定染色的单个分子∀除了的氩离子已实现商用外最近还出现了商用的半导体此时生物样品中基质的荧光背景大大减弱∀与此相适应的荧光染料也已应用于标记片断∀最近还有报道将单聚及二聚染料用于分析研究了荧光染料和分子结合及其对分离的影响∀用对进行分析需将极性反转∀对检测应选∗波长∀常用室温但采用不同温度可改善片断分离∀用分析小分子时电动进样有进样歧视现象但对片断则无歧视现象∀一般说来电动进样比气压进样能产生更高柱效的峰∀对于化学凝胶柱只能使用电动进样∀在中进样条件对进样量和分离的影响可参见有关文献∀采用产物和片断标准品同时进样是鉴别峰的简便方法也可由此推算出产物的数∀控制场强可优化分离度和分析时间由此发展出梯度场强还有用专门仪器实现脉冲场强电泳和溶质速率调制电泳的报道∀碱基核苷和核苷酸的分析这类化合物分子较小通常用或测定∀如研究了和分离分析由非生物成分引起的损伤即苯并芘加合物的测定条件∀等用法测定了羟基脱氧鸟苷氧化物的标记∀等定量测定了血清中∗ Λ Ù 的抗白血病试剂胞嘧啶Β 阿拉伯糖酐∀对细胞提取液中核苷酸的定量测定有很多报道∀如等测定了海拉细胞中∗ Λ Ù 范围的种核糖核苷酸∀等比较了和定量测定种不同细胞中核糖核苷酸的结果发现法可定量测定至理论塔板数达万Ù ∀ουηηερ Βλοη杂交研究用等提出的转移技术进行基因组的特定序列分析是分子生物学的基本技术之一∀但传统的方法既麻烦又费时∀等采用测定用荧光素标记探针可定量至Λ Ù ∀将杂交产物进样到两根毛细管中分别分析一根为非变性条件另一根为变性条件∀根据目标探针和杂交三者在两根柱上因二级结构的差异导致不同的分离情况可进行杂交研究∀此外还可用于测目标基因组序列∗等∀纯度检测片断收集和微量制备等用测定的方法测定了合成的寡核苷酸的纯度∀等用收集了寡核苷酸引物再用于分析∀等用从突变的产物中收集若干个变性片段将其用于扩增再用分析发现不同的峰对应不同的基因序列∀ ΠΥΡ产物分析和δζ∆ΝΑ分析等用 Ù 商业仪器定量测定了扩增的或片断∀用 Ù 可测定竞争性产物对细胞定量∀等用作荧光标记测定了的产物分辨率达分析时间少于∀还测定了从基因序列得到的反转录∀等对Κ ®的片断至共个片断用 Ù 的线性胶可达百万塔板数Ù ∀等指出是一种重组技术中监测质粒浓度的优异定量工具∀对于大于万的染色如∗和∗的范围仍可获得良好的结果∀如用脉冲场对大片断则可获得超高分离∀也有用单分子荧光脉冲检测器进行片断分析和快速分析的报道∀蛋白-∆ΝΑ反应测定蛋白和反应包括复制重组修复和转录等是一种很好的监测工具∀等用荧光染料标记带有识别部位的寡核苷酸监测它和蛋白的反应研究了结合过程∀有关蛋白结合的报道可见文献∀基因突变测定在基因治疗和基因疾病诊断中需要进行基因突变测定∀用于点突变测定有多种方法∀要求一次分离和最常用的是单链构象多形分析∀等用对致癌基因进行了限制片断长度多核分析∀等用测定质粒限制酶降期罗国安等毛细管电泳的原理和应用解所得质粒谱图来检查基因的稳定性∀还有用于法医的报道∀∆ΝΑ序列分析人类基因组计划所需解决的关键问题之一就是提高测序的速度∀现已出现商品测序列的仪器∀用测序列的报道很多如用短寡核苷酸引物库测序列高速序列毛细管阵列毛细板阵列等等∀对分析是的应用重点之一内容太多连 Ù 联用也已用于分析其余不再详述∀糖分析糖是构成生命的基本物质之一但对糖的分析却困难重重因其种类繁多结构复杂常与蛋白脂肪形成复合物∀在糖分析中应用的难处在于糖类物质一般为电中性且亲水性较强一般无发光基团检测上存在困难∀但自年报道还原糖的测定以来用于糖分析的报道日益增多应用越来越广泛也有综述发表∀糖的衍生化技术糖经过适当的衍生转变成带有电荷且具有一定的吸收或荧光发光基团的衍生糖就可依其淌度的不同用进行分离和检测∀目前广泛采用等报道的使中性糖复合成带电体的方法∀等用羧基苯甲酰喹啉甲醛柱前衍生氨基糖用可检出的氨基糖或具有还原性的单糖和寡糖∀醛糖羰基糖还原糖二糖葡聚糖等衍生试剂很多可参见文献∀最近还有对高电荷的寡糖用柱尾标记的测定方法∀糖的检测方法对衍生化糖的检测或不经衍生化反应的糖的直接检测有或电化学检测器等方法如间接紫外和电化学检测∀现在还采用和快原子轰击质谱基质辅助激光解吸时间飞行质谱等联用来研究糖的分离和结构以及用进行寡糖的多维谱研究∀糖分析所用的ΥΕ模式除了用进行糖分析外等用分离了中性寡糖和硅化寡糖加入提高了分离度∀陈义用对大肠杆菌胞壁质膜糖进行了分离∀用等速电泳分离了糖胺聚糖但类似报道极少∀糖复合物的分析糖复合物包括糖肽糖蛋白糖脂等∀有关糖肽糖蛋白和一些分离的应用可见本讲座第四讲∀再如我们用结合及 Ù 对重组促红细胞生成素进行了微多相性及酶解肽图的分离和鉴定∀糖肽糖蛋白及其衍生所得寡糖的分离脂多糖的 Ù 分离的鉴定等均表明对糖复合物的分析正在日益增多∀在其它化合物分析中对糖的应用也很多如结合研究特别是糖作为手性选择剂在手性药物分离中起重要作用此处不再赘述∀离子分析在发展初期主要用于生物大分子的分离分析随着模式的出现又扩展到中性分子如药物等的分析∀小分子离子包括无机离子的是年代发展起来的毛细管离子分析简称∀传统电泳只能用于大分子的分离而采用高压快速的方法减少溶质在毛细管内的停留时间降低由于分子扩散而引起的区带扩展实现小分子离子的分析∀与离子色谱法相比具有高效快速微量低耗等特点显示了强大的生命力颇有取而代之的趋势∀下面仅就几个要点作一简要介绍∀阴离子分析的基本原理传统的电渗流的方向由正极流向负极阴离子迁移方向与其相反∀要进行的关键是在电解质溶液中加入季胺盐阳离子表面活性剂如或等作为电渗流改性剂使方向发生反转从负极流向正极∀同时要调整仪器为阴极进样阳极检测∀此时阴离子迁移方向与方向相同且因电泳迁移率不同而得以分离∀中性组分可在阴离子分离结束后吹洗出毛细管阳离子则由于向阴极迁移不再出峰∀阴离子分析检测方法少数阴离子如硝酸根碘酸根等具有紫外吸收对它们可直接检测但对大部分阴离子包括阳离子因缺少生色团故常用间接紫外检测法检测即在缓冲液中加入具有强紫外吸收的物质如铬酸盐等再在它们的最大紫外吸收波长处进行测定∀当分离区带通过检测区时溶质离子取代铬酸根离子背景离子而使吸光度减小呈现一个倒峰∀如用间接荧光法检测灵敏度会更高∀也有用作离子峰检出的报道但价格昂贵难以普遍使用∀阴离子分析的影响因素改性剂阳离子表面活性剂的种类和浓度对分离影响颇大∀一般而言随着阳离子表面活性色谱卷剂碳链的增长阴离子组分的迁移时间变长选择性有所变化∀浓度对分离选择性亦有影响∀显色剂的种类和浓度对分离也会有影响需根据淌度匹配原则使背景离子的迁移率尽可能和被分离溶质的迁移率相近否则会出现前伸或拖尾现象∀缓冲液的值对阴离子迁移时间影响显著∀分离电压也是影响迁移时间和柱效的因素∀此外尚可加入有机改性剂如乙腈甲醇等形成络合物难溶盐包合物等调节分离∀阴离子分析的应用阴离子的最成功的例子是在内分离了种阴离子∀样品制备简单如纸浆是一种复杂的强碱性样品只需将它简单稀释后就可用测定其中阴离子∀可测定高浓度组分共存的痕量离子如监测对苯二甲酸盐中含量低于 Ù 的对羧基苯甲醚∀还可分析无法分离的强氧化性阴离子等和强还原性阴离子等∀我们还用法定量测定了大量有机硒硒酸酯多糖存在下不同价态的痕量无机硒解决了用原子吸收光谱和均无法解决的难题检测限可达≅∀阴离子分析在食品行业水厂水质监测等方面均有很多应用不再赘述∀阳离子分析对阳离子分析也是基于离子电泳迁移率的不同∀但许多离子的电泳迁移率相近难以分离一般采用在缓冲溶液中加入络合剂来改变分离的选择性∀不同的络合剂及其浓度对分离选择性的影响较大∀一般来说随着络合剂浓度的增加离子迁移时间也增加∀值对分离的影响主要表现在两个方面一是电渗流随值的增加而增大二是值对络合平衡的影响需综合加以考虑∀常用的阳离子背景试剂为含氮有机化合物和对甲基苯甲胺咪唑等∀分离种离子是阳离子的典型例子∀等研究了影响阳离子定量的各种因素∀限于篇幅许多应用不再一一介绍∀总之在生物大分子中性分子乃至离子方面均有广泛的应用∀我们相信尚有许多新的原理和应用领域等待开拓∀在年代后期还会有更大的发展∀参考文献林炳承许旭罗国安分析测试学报期罗国安等毛细管电泳的原理和应用王义明魏伟罗国安分析化学∗色谱卷期罗国安等毛细管电泳的原理和应用陈义毛细管电泳进展第二卷广州华南理工大学出版社罗国安周国华曹亚澄等分析化学年待发表胡平罗国安王如骥等清华大学学报自然科学版英文版王义明罗国安分析化学∗ Λεχηυρε οθ Πρινχι λ ανδ Α εζ Α λ ιχαηιονζ οθ Υα ιλ αρψ Ε λ λ εχηρο ηορεζιζ λ ιχαηιονζ οθ ΥΕ ιν ∆ ΝΑ Αναλ ψζιζ Υαρβοηψδ ραηε Αναλ ψζιζ ανδ Υα ιλ αρψ Ιον Αναλ λ ψζιζ θ χηοολ οθΛιθε χιενχε Ε νγ ινεερινγ Σ ζ ηυα Τ νιϖερζ ψ Β ειϕινγ ιη ινγ Αβζηραχη Κ εψ ωορδζ。
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常用的CE缓冲体系
• 磷酸钠体系 宽缓冲范围 • 硼酸钠体系 高pH范围 • Tris-HCl体系 低pH范围 • 醋酸-醋酸铵体系 CE/MS常用体系
• 电渗流的波动极大的影 响了迁移时间的重复性
影响电渗流的因素
• pH值 pH越高，电渗流越大
• 离子强度 离子强度越高，电渗流越小
• 缓冲溶液添加剂 离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精
电渗流随pH的变化情况
控制电渗流的三个重要手段
1. 采用涂层毛细管，消除电渗流的影响 2. 改变pH，从而调整电渗流的管胶束电动色谱
电解质中加入表面活性剂(surfactant，例如 SDS)，使之形成胶束（Micelle），样品根据其 疏水性(Hydrophobicity)强弱的差异，在胶束与 电解质的分配系数有所不同來进行分离 ，样品 疏水性愈強，则进入胶束的机会愈大。通常物 质进入胶束后，泳动的速度会变慢，因此疏水 性愈強的物质则愈慢出來。
添加剂的选择
• 目的：
1. 改善分离 2. 抑制分析物在毛细管上的吸附
添加剂的选择
1. 甲醇|乙腈（5-50%） • 降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果 • 增加非极性物质的水溶性 2. 环糊精|SDS等表面活性剂 • 增加分离选择性，提高分析效果 • 降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果 3. 非极性高分子聚合物 • 掩蔽毛细管内壁电荷，抑制分子吸附 • 降低电渗流 • 形成一定的分子筛，提高分子大小选择性
毛细管电泳分离原理及分析策略
CE分离原理-与模式有关
• 毛细管区带电泳（CZE） • 毛细管胶束电动色谱（MECC/MCKC） • 毛细管凝胶电泳（CGE） • 毛细管等电聚焦（cIEF） • 亲和毛细管电泳（ACE） • 毛细管电色谱（CEC）
第一章 毛细管区带电泳
样品在电解 液中泳动,根 据物质的荷/ 质比差异来 进行分离， 比值愈大,跑 得愈快
• EOF gives plug flow
– Minimizes band broadening – Narrows detection zone
电渗流是CE中最大的驱动力来源之一
电渗流的正面及负面作用
• 正面作用
• 负面作用
• 增加分离速度
• 使得正、负电荷物质同 时分离
• 减少分离时间和分离有 效距离
进样方式
压力进样 电动进样 浓缩进样
毛细管种类
• 非涂层毛细管（裸管） • 内壁涂层毛细管（涂层管）
非涂层毛细管-电渗流的概念
低pH
高pH
- H+
电渗流的特点
EOF
纯电泳状态
+
-
电泳+电渗流
EOF
+
-
tm (min)
0
电渗流的作用
电渗流的活塞流特点
• Hydrodynamic flow – Parabolic – Resistance to flow at surface – More diffusion/broader detection zone
缓冲溶液及pH值的选择
研究经验表明：对于蛋白质、肽和氨基酸等两 性样品，采用酸性（pH 2）或碱性（pH＞9） 分离条件，比较容易得到好的分离结果；糖类 样品通常在pH=9～11之间能获得最佳分离； 羧酸或其他样品多在pH=5～9之间选择分离条 件。
缓冲溶液及pH值的选择
pH 的选择也和所用的毛细管种类有关，许多 涂层毛细管只能在一定的pH范围内工作，例如 聚丙烯酰胺涂层毛细管，在3＜pH＜8的范围以 外工作，其涂层容易水解失效。
• EOF gives plug flow
– Minimizes band broadening – Narrows detection zone
电渗流的活塞流特点
• Hydrodynamic flow – Parabolic – Resistance to flow at surface – More diffusion/broader detection zone
渗流很低；当pH>10以后，电渗流基本不增 加 3. 添加剂：有机溶剂可以降低电渗流的大小， 从而增加分离的有效距离；表面活性剂可以 彻底改变电渗流的方向和大小，主要是在阴 离子分析时使用
缓冲溶液的影响和选择
• 在CE中应该根据以下性质来选择缓冲溶液： 1. 在所选的pH范围内有较强缓冲能力； 2. 在检测波长处有低的紫外吸收； 3. 小的淌度（即大体积、低电荷离子）以降低所产生的
缓冲溶液及pH值的选择
在相同的 pH下，不同缓冲体系的分离效果不 尽相同，有的可能相差甚远。一般的经验是， 能与样品发生相互作用的试剂，有可能就是最 好的试剂。一个典型的例子是，在分离糖类和 DNA等分子时优先使用硼酸盐缓冲体系，因为 硼酸根能与糖羟基形成配位键，从而增加糖的 负电荷和分离度。硼酸缓冲试剂也适用于其他 含邻位羟基或多羟基化合物的分离。
缓冲溶液及pH值的选择
缓冲试剂及pH调节剂的浓度也需要优化。缓 冲试剂的浓度一般控制在10～200 mmol/L之间。 电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼砂等，其浓 度多控制在20 mmol/L附近，而电导小的试剂 如硼酸及HEPES等，其浓度可在100 mmol/L以 上。有时为了抑制蛋白质吸附等特殊目的，可 采用很高（＞0.5mol/L）的试剂浓度，此时要 注意减少分离电压，分析速度自然也将随之降 低。
CZE分离条件的选择
• 毛细管类型--涂层还是非涂层？ • 毛细管长度--长毛细管还是短毛细管？ • 缓冲液体系--种类和pH值 • 添加剂类型--甲醇|环糊精|乙腈 • 检测器选择--紫外|二极管阵列|激光诱导荧光
缓冲溶液的选择
可先用磷酸缓冲体系为搜寻基础，初步确定 （最佳）pH范围后，再进一步细选出更好pH 和缓冲试剂。磷酸盐是毛细管电泳中最常用的 缓冲体系之一，它的紫外吸收低，pH缓冲范围 比较宽（pH=1.5～13），但电导也比较大。