第三章 培 养 基

⑤ 硼——细胞分裂和细胞伸长迟缓。 ⑥ 镁和锰——影响细胞伸长。 2. 有机营养物 （1）含氮物质 多数培养细胞能够合成所必需的全部的维生素（ Czosnowski ， 1952；Paris，1955，1958） 。为使组织生长更好，必须补充一种以上 的维生素和氨基酸，其中硫胺素（Fhiamine HCl，维生素 B1）通常 是一种主要的成分。其他维生素尤其是吡哆素（Pyridofine HCl，维 生 素 B6 ） 、 烟 酸 （ Nicotinic Acid ， 维 生 素 B3 ） 和 泛 酸 钙 （Ca-Pantothenate，维生素 B5）以及肌醇（Cinositol）也是已知能 改良培养材料生长的维生素。 不同标准培养基的维生素和氨基酸的组 成有很大差异（见表 3.1） 。 许多组成不明确的复杂营养混合物，如水解酪蛋白（CH） 、椰乳 （CM） 、玉米乳、麦芽提取液（ME） 、番茄汁（TJ）和酵母提取液 （YE）也被用来促进某些愈伤组织和器官生长。但是，这些天然提 取物的应用应尽可能避免。 这些物质的不同样品， 尤其是果实提取物， 可能会影响结果的重复性， 因为在这些提取物中促进生长的物质质量 和数量往往随供试验有机体的品种和组织的年龄、 环境及栽培条件的 不同而变化，而且可用单个氨基酸有效地替代这些物质。例如，对玉 米胚乳愈伤组织来说，Straus（1960）单独用 L－天门冬酰胺替代酵 母提取液和番茄汁。同样，Risser 和 White（1964）证明 L－谷酰胺 能替代 Reinert 和 White（1956）较早用于白云杉（Picea Glauca） 组织培养物的 18 种氨基酸。 （2）碳源 Haberlandt（1902）试图培养绿色叶肉细胞，可能他认为绿色细 胞对营养的需求较简单， 但是这种想法未能实现。 一般开始具有绿色 的组织在培养中会渐渐失去绿色素并依赖于外部碳源， 甚至那些具有 色素的组织在培养时经过突然的变化或在特殊条件下碳不能自给。 对 于在培养中有完全组织的绿芽， 在培养基中加入适量碳源时， 可以生 长得更好，而且能增殖。因此，在培养基中加入可利用的碳源是十分 必要的。 通常使用最多的碳源是蔗糖，一般浓度为 2％～5％，葡萄糖和果糖 也是已知用来维持某些组织良好生长的碳源。Ball（1953，1955）证 明高压灭菌的蔗糖比过滤除菌的蔗糖对红杉属（Sequoia）愈伤组织 的生长更好， 高压灭菌可使蔗糖水解产生更多可有效利用的糖。 如通 常切下的双子叶植物的根有蔗糖时生长更好， 而单子叶植物的根有右 旋糖（葡萄糖）时生长最好，苹果的组织培养有蔗糖或葡萄糖时生长
维生素 20世纪30、40年代的简单 培养基无机盐浓度低，杂 质高，培养效果差 氨基酸 生长调节 物质 胡萝卜 黑樱桃 调节无机 盐浓度
MS基本培养基（含有 较高浓度的硝酸盐、 铵盐、钾盐） ＭＳ培养基
改良ＭＳ 培养基
增加各种无机盐浓度， 尤其是氮和钾的浓度
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椰乳、水解酪蛋 白、氨基酸等
生长调 节物质
图 ３．１
培养基改良过程中营养物质的变化
当新的培养工作开始时，必须拟定适合该培养工作特殊要求的培 养基。因此，20 世纪 60 年代用于植物组织培养的各种效果好的培养 基配方相继诞生（见表 3.1） 。其中最有代表性的是 Murashige 和 Skoog（1962）的 MS 培养基，也是目前应用最普遍、适应范围最广 4 ，对 泛的一种培养基，主要是由于它含有较高浓度的 NO 3 、K＋、 NH 一般植物组织和细胞有促进生长的作用。此后，为了适应不同物种， 在 MS 配方的基础上修改设计了多种培养基， 有适合十字花科植物的 B5 培养基（Gamborg 等，1968） 、适合木本植物的 WS 配方（Wolter and Skoog，1966）和 LS 配方（Linsmal and Skoog，1962） 、适合禾 本科植物花粉培养的 N6 配方（朱至清等，1975，1987）及 Nitsch 修 改 的 H 培 养 基 （ 1969 ） 等 （ 见 图 3.2 ） 。
和有山梨醇（Sorbitol）时效果相同（Chong 和 Taper，1972） 。 已知植物组织中利用的其他形式的碳源包括麦芽糖（Maltose） 、 半乳糖（Galactose） 、甘露醇（Manitol）和乳糖（Lactose）等。 （3）生长激素 除营养物质外，通常需要加入一种以上的生长物质，如生长素、 细胞分裂素和赤霉素， 以维持组织和器官的良好生长。 对这些物质的 需要随组织的不同而变化， 但可以认为主要取决于激素的种类、 水平 和激素之间的平衡状态。 ① 生长素。这类激素随茎和节间的伸长、向性、顶端优势和生长 等而存在， 在组织培养中主要用于细胞分裂和根的分化。 通常用于组 织培养的生长素有吲哚丁酸（IBA，Indole-3-butyric acid） ；萘乙酸 （NAA， Naphthylene acetic） ； 萘氧基乙酸 （NOA， Naphthoxy-acetic acid） ；对氯苯氧基乙酸（P－CPA，Para-chlorophenoxyacetic acid） ； 2，4-二氯苯氧基乙酸（2，4-D，Dichloro-phenoxyacetic acid） ；2，4， 5-三氯苯氧基乙酸 （2， 4， 5-T， 2， 4， 5-Trichlorophenoxyacetic acid） ； 吲哚乙酸（IAA，3-Indolelacetic acid） 。它们中的 IBA 和 NAA 广泛 用于组织生长，与细胞分裂素结合用于芽的增殖；2，4-D 和 2，4， 5-T 对愈伤组织的诱导和生长非常有效。通常生长素既可在乙醇中也 可在稀氢氧化钠中溶解。 ② 细胞分裂素。 这类激素与细胞分裂、 顶端优势改变和芽的分化 等有关，在培养基中则主要是与从愈伤组织和器官上分化不定芽有 关。 这些化合物也用于减弱顶端优势的腋芽的增殖。 常用的细胞分裂 素有卞氨基嘌呤 （BAP， Benzylamino purine） 、 异戊烯基腺嘌呤 （z-ip， Isopentenyl-adenine）和激动素（Kinetin，furfurylamino purine） 。 细胞分裂素常溶于稀盐酸或氢氧化钠。 ③ 赤霉素（Gibberellin） 。已知的赤霉素超过 20 种，一般用的是 GA3。与生长素和细胞分裂素相比，赤霉素使用很少。有报道，赤霉 素可促进高粱不定胚再生小植株的正常发育。 GA3 可完全溶于冷水直 到 1 000 mg/L。 （4）琼脂 当采用液体培养时，静止培养中的培养物会由于缺氧而致死。为 了避免这种现象，培养基可用琼脂[从海草（Seaweed）中得到的一种 多糖]固化，使培养物处于培养基的表面，这种培养基被称作固体培 养基。通常琼脂的浓度为 0.8％～1.0％，浓度过高，培养基会变硬，营 养物不易扩散到组织中。 广泛采用的固体培养基由于与培养物紧密接 触，对多数培养都非常适合，但琼脂不是培养基必要的营养成分。进 行营养研究时，应避免使用琼脂，因为商业用琼脂不纯，含有 Ca、 Mg 等元素。Heller（1953）为了避免这种影响，在液体培养基上采
第三章
第一节
培 养 基
培养基的基本成分和主要培 养基
培养基的组成对植物组织培养的成功关系甚大。离体组织对适合 生长的营养需求随物种的不同而有很大差别， 甚至同一物种不同部位 的组织和器官所需的营养物质也不完全相同 （Murashige and Skoog， 1962） 。因此，没有哪个培养基能完全满足各种植物组织和器官的要 求。 最早的一些植物组织培养基，如 White（ 1943 ）的根培养基和 Gautheret（ 1939）的愈伤组织培养基都是从早先用于完整植株培 养 的 营 养 液 发 展 而 来 。 White 培 养 基 是 基 于 Uspenski 和 Uspenskaia 的海藻培养基（ 1925 ） ， Gautheret 的培养基是根据 Knop（ 1865 ）的盐溶液（水溶液）而设计，所有后来的培养基配 方都是以 White 和 Gautheret 的培养基为基础。 早在 20 世纪 30、40 年代，植物组织培养初期所使用的培养基成 分比较简单，无机盐浓度低，培养效果也差，与当时生产的化学试剂 纯度不高，含杂质较多有关。若无机盐浓度较高，对植物组织有害的 物质必然也相应增多。因此，20 世纪 30、40 年代使用的培养基浓度 偏低。 某些愈伤组织（如胡萝卜组织、黑樱桃组织及多数瘤状组织）可 以在只含有无机盐和可利用糖的简单培养基上生长。 而对于大多数其 他植物来说，则需要在培养基中补充不同数量和不同比例的维生素、 氨基酸和生长调节物质， 所以， 通常把许多复杂的营养物质组合到培 养基中（见图 3.1） 。
在水中溶解矿物盐时，各种矿质元素要经过解离和电离。在培养 基中的活性因素与其说是化合物， 不如说是不同类型的离子。 一种离 子可能通过一种以上的盐提供。例如，在 MS 培养基中， NO 3 离子通 过 NH4NO3 和 KNO3 供应，而 K＋则是通过 KNO3 和 KH2PO4 供应。 因此， 两种培养基之间的比较可以通过比较其中不同离子总的浓度进 行。 如前所述，White 培养基是最早植物组织培养的培养基之一，它 包含了所有必需的营养物， 广泛用于根培养。 但是许多研究者的经验 表明， 这个培养基中无机营养物在数量上对愈伤组织的良好生长是不 适合的（Murashinge 和 Skoog，1962） 。这一缺点通过在培养基中加 入复杂的混合物，如酵母提取液、水解酪蛋白、椰乳、氨基酸等较早 地得到解决（Reinert 和 White，1965；Risser 和 White，1964） ，并 以形成适宜的合成培养基为目的。 后来， 有些研究者通过增加各种无 机营养物， 尤其是钾和氮的应用有效地取代了有机添加物。 现在广泛 采用的多数植物组织培养基（见表 3.1） ，其中的矿物盐（离子）较 White 培养基更丰富。Heller（1953）所采用的铝（Aluminium）和 镍 （Nickel） 未被证明是必要的， 并被后来的研究者删除。 钠 （Sodium） 、 氯（Chlorine）和碘（Iodine）的必要性也没有被证实。 Heller（1953）进行过植物组织培养中无机营养物的详细的研究， 并特别强调铁和氮。 在原来的 White 培养基中 （1943） ， 铁以 Fe（ 2 SO4） 3 的形式加入，但 Street 及其合作者以 FeCl2 取代并用于根培养，因 为这个方案中含有锰和其他金属离子杂质（ Street 和 Henshaw ， 1966） 。但是，FeCl2 也没有提供一个纯粹的满意的离子来源。在这个 方案中，铁在 pH 值为 5.2 左右时对组织是有效的。众所周知，根培 养开始后一周内，培养基的 pH 值从开始的 4.9～5.0 升至 5.8～6.0， 根开始表现出缺铁的征兆。 克服这个问题的方法就是， 在多数培养基 中采用现在用的 Fe.EDTA，在这个方案中 pH 值达到 7.6～8.0 时铁 仍然有效。根通过与铁结合的自然螯合物，当 pH 值为 6.0 时愈伤组 织培养物还能利用铁（Heller，1953） 。 培养基中无机氮的供应有两种形式——硝酸盐和铵盐。作为氮的 惟一来源时，硝酸盐远远优于铵盐，但在单独使用硝酸盐时，培养基 的 pH 值向碱性漂移，加入少量铵盐能抑制这种漂移。因此，几种培 养基中都同时含有硝酸盐和铵盐。 愈伤组织表现的缺素症状如下（Heller，1965） ： ① 氮——某些愈伤组织出现花青甙；没有导管形成。 ② 氮、钾和磷——细胞过度增大，形成层减少。 ③ 硫——很明显褪绿。 ④ 铁——细胞分裂停止。
1962年Murashige & Skoog的 MS培养基
图 ３．２
培养基的发展过程
一、培养基的组成 1. 无机营养物 在植物生命中矿质元素是非常重要的，例如，镁是叶绿素分子的 一部分，钙是细胞壁的一个组分，氮是氨基酸、维生素、蛋白质和核 酸的一个重要组成部分。此外，C、H 和 O 为植物生长所必需。已知 12 种元素，即氮（Nitrogen） 、磷（Phosphorus） 、硫（Sulphur） 、 钙（Calcium） 、钾（Potassium） 、镁（Magnesium） 、铁（Iron） 、锰 （ Manganese ） 、 铜 （ Copper ） 、 锌 （ Zinc ） 、 硼 （ Boron ） 和 钼 （Molybdenum） ，其中前 6 种元素要求的量相对大，因此，称为大 量元素或主要元素，后 6 种需要量少，称为少量或微量元素。根据国 际植物生理学会的建议，植物所需元素的量大于 0.5 mmol/L 的称为 大量元素，少于 0.5 mmol/L 的为微量元素（De Fossard，1976） 。
1865年Knop 盐溶液培养基 1939年 Gautheret 愈伤组织培养基
1925年Uspenski和Uspenskaia 海藻培养基
1943年White根培养基
B5——十字花科植物 (Gamborg等，1968) 改 良 培 养 基 N6(朱至清等,1975,1987) 和Nitsch H (Nitsch,1969) ——禾本科植物花粉培养 WS (Wolter & Skoog，1966) & LS(Lingmal & Skoog， 1962) ——木本植物