大麦_淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌
大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在
酿酒酵母中的表达和分泌
3罗进贤 李政海 李文清
(中山大学生物化学系及生物工程中心,广州510275)
摘要 将大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶cDNA 重组进同一大肠杆菌2酵母穿梭质粒构建含双基因的表达分泌载体pMA G 15.用原生质体转化法将pMA G 15引入酿酒酵母(S.cerevisiae GRF18),在酵母P GK 基因的启动子和转录终止信号及本身的信号序列的调控下,实现大麦α2淀粉酶和糖化酶的高效表达,99%以上的酶活力分泌至培养基中.构建的酿酒酵母菌株GRF18(pMA G 15)在含15%可溶性淀粉的培养基中,培养47h 能水解99%的淀粉,并能发酵产生酒精.
关键词 大麦α2淀粉酶 黑曲霉糖化酶 酿酒酵母 表达和分泌
酿酒酵母是酿酒工业、酒精和单细胞蛋白的生产菌,但由于其不具有淀粉水解酶的活力不能发酵淀粉.发酵前淀粉需先经过蒸煮、液化、糖化等工序变成葡萄糖后才能被利用.从80年代中期开始将各种来源的α2淀粉酶和糖化酶基因分别克隆进酿酒酵母,构建能分解淀粉的酵母菌株[1～5].只是由于构建菌株的酶活力不高,降解淀粉的速率较慢还不能用于生产.我们曾将地衣芽孢杆菌α2淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶G AI 的cDNA 分别或同时转入酿酒酵母获得表达和分泌[6～9],其中含α2淀粉酶和糖化酶双基因的酿酒酵母GRF18(YEpMA G 27),酶的表达和分泌水平都很高,但淀粉水解的速率仍较低.本文报道用酶学性质与黑曲霉糖化酶比较接近的大麦α2淀粉酶取代细菌α2淀粉酶,构建含大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶双基因的酿酒酵母工程菌,实现α2淀粉酶和糖化酶的高表达和分泌,获得能快速分解淀粉的酵母工程菌.
1 材料和方法
111 材料
11111 菌株与质粒 本研究所用菌株与质粒如表1,其中pBAL 27是含大麦α2淀粉酶基因的大肠杆菌2酵母穿梭质粒,pMA G 69为含黑曲霉糖化酶G AI cDNA 的大肠杆菌2酵母穿梭质粒.
11112 培养基 大肠杆菌培养和转化用LB 培养基,酵母的培养和转化使用的YPD , 1996209208收稿,1996211205收修改稿
3广东省自然科学基金资助项目
中国科学
(C 辑) 第28卷 第1期SCIENCE IN CHINA (Series C )
1998年2月
YP GE ,YPSB ,YNB ,SC ,SORB ,YPS 等培养基,其配方见文献[10].
表1 菌株与质粒
菌株/质粒
基因型来源E.coli C600
F -,thi 21.leuB6,lac Y1,tonA21,Sup E44Jacob 2Monod 研究所S.cerevisiae GRF18leu2,his3,sta -,ihn
-Dr.Hollenburg pBAL 27Amp r ,amy +,L EU ,2μori ,pBR322ori 广东省微生物研究所pMA G69
Amp r ,GAI ,L EU 2μori ,pBR322ori 本室构建[8]pMA G15Amp r ,amy +,GAI ,L EU 2μori ,pBR322ori 本研究工作
11113 主要生化试剂 限制酶EcoR Ⅰ,Hind Ⅲ,T 4DNA 连续酶购自GIBCO 2BRL 公司,低熔点琼脂糖、BSA 、A TP 等为Sigma 公司产品.葡萄糖试剂盒为广州环通生物技术公司产品.
112 方法
11211 质粒的检测和制备 大肠杆菌质粒的检测和制备按Sambrook 的方法[11],酵母质粒的检测按Sherman 的方法[12].
11212 质粒的酶解、酶解片段的回收、D NA 分子的连接和大肠杆菌转化 参照文献[11]的方法.
11213 酵母原生质体转化 按Burgers 的方法[10].
11214 淀粉酶阳性菌落的检测和总酶活力测定 见文献[6].一个酶活力单位定义:p H610,60℃的条件下保温1h 产生1mg 葡萄糖的酶量.
11215 培养液中剩余淀粉含量的测定及重组质粒稳定性检测 参照K im 的方法[13].11216 发酵液中酒精含量的测定 采用简易的酒精定量测定法.先配浓度体积分数为1%,3%,5%,7%及9%的酒精标准液.加3mL K 2Cr 2O 4溶液(4%K 2Cr 2O 4溶于20mol/L H 2SO 4)于6mL 刻度试管内,将刻度试管置于加有012mL 饱和K 2CO 3的50mL 比色试管中,加015mL 酒精标准液于比色管中,立即盖好盖子,摇匀,于50℃保温5h.取出后在刻度管内加入3mL 蒸馏水,摇匀,测A 560并以双蒸水代替酒精作对照.以酒精标准液浓度为横坐标,A 560为纵坐标绘制标准曲线.测定发酵液中酒精含量时,用015mL 发酵液取代酒精标准液,测定A 560值后,查标准曲线乘以稀释倍数即得发酵液中酒精含量.
11217 SDS 2聚丙烯酰胺凝胶电泳 参照文献[11]的方法.
2 实验结果
211 含α
2淀粉酶和糖化酶双基因的酵母表达载体的构建为使大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶基因在酿酒酵母中同时表达,需将这2个基因重组在同一表达载体.大麦α2淀粉酶cDNA 位于质粒pBAL7上酵母P GK 启动子和转录终止信号之间.黑曲霉糖化酶cDNA 位于质粒pMA G 69上.我们设想将pBAL7上含P GK 启动子2大麦α2淀粉酶cDNA 2P GK 转录终止信号的314kb 片段切出转移至质粒pMA G 69上构建含双基因的表达载体.如图1所示,用Hind Ⅲ酶切质粒pBAL7,低熔点琼脂糖凝胶电泳分离314kb 的含α2淀粉酶cDNA 及P GK 调控序列的片段;同时用Hind Ⅲ部分酶切质粒pMA G 69,电泳分离
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图1 重组质粒pMA G 15的构建
P ,T 分别为PGK 基因的启动子及转录终止信号,BA 为大麦α2淀粉酶基因,GA 为黑曲霉糖化酶基因
1116kb 的线状质粒DNA.将314及1116kb 的片段以适当比例混合,经T 4DNA 连接酶连接后转化大肠杆菌C600,筛选Amp r 转化子,经质粒检测和酶切分析,获得α2淀粉酶cDNA 正确插入pMA G 69上合适位点的重组质粒pMA G 15.由于pMA G 69上有3个Hind Ⅲ切点,构建重组质粒时采用Hind Ⅲ部分酶切的方法,可获得酶切位点不同的1116kb pMA G 69线状DNA ,314kb 的α2淀粉酶基因可以在不同的Hind Ⅲ位点插入,用EcoR Ⅰ酶切重组质粒pMA G 15可以判断α2淀粉酶的插入位点(图2).本实验的结果表明不管从那个位点插入都不会影响葡萄糖淀粉酶基因的表达.
212 大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌
用原生质体转化法将211中构建的重组质粒pMA G 15转入酿酒酵母GRF18,在缺亮氨酸的SORB 再生培养基上筛选转化子,获得能在不含亮氨酸的培养基生长的酿酒酵母GRF18
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(pMA G 15),然后把此转化株GRF18(pMA G 15)转移至缺亮氨酸的YNB 淀粉培养基上,并以酿酒酵母GRF18(pMA G 69),GRF18(pBAL7)及受体菌GRF18作对照,在30℃培养4d 后,倒碘液于平板上,可见在GRF18(pMA G 15),GRF18(pMA G 69)及GRF18(pBAL7)菌落周围均出现淀粉水解圈,其中以GRF18(pMA G 15)最大,受体菌GRF18则不生长(图3);这一结果表明,淀粉酶已在酵母中表达并分泌至胞外
.
图2 重组质粒pMA G 15的酶切分析
1为λcl857S7/Hind Ⅲ,2为pMA G69/EcoR Ⅰ,3为
pMA G15/EcoR Ⅰ,4为pMA G69/Hind Ⅲ,5为pMA G15/
Hind Ⅲ,6为pBAL7/Hind
Ⅲ图3 酿酒酵母转化子在淀粉培养基上形成的水解透明圈1为酿酒酵母GRF18(pMA G15),2为酿酒酵母GRF18(pMA G69),3为酿酒酵母GRF18(pBAL7),4为酿酒酵
母GRF18
为了进一步研究α2淀粉酶和糖化酶在酵母中的表达和分泌情况,按照文献[6]的方法,将上述酵母转化子接种于不含葡萄糖的YP GE 培养基中,30℃振摇60h ,离心测上清液中的总酶活,用蜗牛酶和超声波将菌体裂解后测胞内酶活力,结果如表2.
表2 酿酒酵母GRF18转化子的酶活力
酿酒酵母转化子
胞外酶活/U ?mL -1胞内酶活/U ?mL -1总活力/U ?mL -1分泌量/%GRF18
0000GRF18(pMA91)
0000GRF18(pBAL7)
56.500.5257.0299.10GRF18(pMA G69)
90.00.4590.4599.50GRF18(pMA G15)152.300.80153.1099.47
表2的结果显示含α2淀粉酶和糖化酶双基因的转化子GRF18(pMA G 15)的总酶活力比含α2淀粉酶或糖化酶单基因的转化子GRF18(pBAL7)及GRF18(pMA G 69)要高,而且99%以上的酶活力都分泌至培养基中.
为了证明大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶已在酿酒酵母中同时表达,把酵母转化子GRF18(pMA G 15)及GRF18(pBAL7),GRF18(pMA G 69)的培养上清液用80%饱和度的硫酸铵于4℃沉淀过夜,沉淀用20mmol/L 的磷酸缓冲液(p H6.0)溶解后透析除盐,真空干燥浓缩后,用
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适量20mmol/L 的磷酸缓冲液溶解,走SDS 2PA GE 电泳,结果如图4.从图中可见GRF18(pBAL7)在43ku 处有1条新带而GRF18(pMA G 69)在67ku 稍大的位置上有1条多余的带(黑曲霉糖化酶的分子量为71ku ).含双基因的转化子GRF18(pMA G 15)在43ku 和71ku 的相应位置上都出现新的带.我们曾将培养上清液用硫酸铵沉淀后上DEAE 2纤维素柱层析亦发现有α2淀粉酶和糖化酶活力,前者在流出液中,后者在500mmol/L 的洗脱液中(数据未列出).以上结果显示α2淀粉酶和糖化酶已在酿酒酵母中同时获得表达和分泌.
213 酿酒酵母转化子GRF18(pMAG 15)对淀粉的水解和利用
为了检查酿酒酵母GRF18(pMA G 15)的水解和利用淀粉的能力,挑取其单菌落接种于含组氨酸的SC 培养基中,培养60h 后收集菌体,转接至含15%可溶性淀粉的YPS 培养基中,30℃振荡培养,定时取样,测A 510,酶活力及淀粉残余量.图5的结果显示,构建的酵母工程菌GRF18(pMA G 15)在47h 内可水解99%的淀粉,而且水解进程与酵母的生长和酶的生成是平行的.我们曾试过10%的马铃薯淀粉,发现培养50h 亦可将其中99%的淀粉水解掉.这一结果表明GRF18(pMA G 15)的淀粉水解能力比我们构建的含地衣杆菌α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶双基因的酿酒酵母GRF18(YEpMA G 27)要高得多.GRF18(YEpMA G 27)在含10%的马铃薯淀粉的
YPS 培养基中需培养7d 才能水解97%的淀粉.
图4 表达产物电泳分析
1为标准分子量,2为GRF18(pBAL7),3为GRF18
(
pMA G69),4为GRF18(pMA G15)图5 酿酒酵母GRF18(pMA G 15)在YPS (含15%的可溶性淀粉)中生长、产酶及水解淀粉曲线图
1为A 570,2为酶活,3
为残余率
214 酿酒酵母GRF18(pMAG 15)发酵淀粉产生酒精
图6 酿酒酵母GRF18(pMA G 15)在YPS (含15%可溶性淀粉)中产生酒精曲线1为淀粉残余率,2为酒精含量
为了考察构建的酵母工程菌能否将淀粉水解产物
发酵产生酒精,将GRF18(pMA G 15)接种于含10%可
溶性淀粉的YPS 培养基中,定时取样,按材料与方法
中介绍的方法测定培养上清液中的酒精含量及淀粉残
余量.图6是酿酒酵母GRF18(pMA G 15)水解淀粉和
发酵产生酒精的进程.虽然酿酒酵母GRF18是实验
室菌株不是酒精的生产菌,但从图上可以看到,构建的
酵母工程菌在水解淀粉的同时还可发酵产生酒精,为构建能水解和利用淀粉生产酒精的酵母工程菌打下基础.54 中 国 科 学 (C 辑)第28卷
215 重组质粒pMAG 15在酵母工程菌中的稳定性
带2
μ质粒的酵母转化子在无选择压力的情况下,经多代培养都会不同程度地产生质粒丢失的现象.为了检测来源于2
μ的重组质粒pMA G 15在酵母转化子GRF18中的稳定性,挑取GRF18(pMA G 15)单菌落接种于YPD 液体培养基中,30℃连续培养5d 后,取样涂平板,分离单菌落,点种于缺亮氨酸的SC 选择培养基及YPD 完全培养基上,30℃培养2d.在YPD 培养基上生长而在SC 培养基上不能生长者即为丢失质粒的转化子.从表3的结果可知,重组质粒pMA G 15的丢失率为913%.
表3 重组质粒pMA G 15在酿酒酵母GRF18中的稳定性转化子名称
YPD 上总菌落数SC 上不长菌落数丢失率/%GRF 18(pBAL7)
51624547.5GRF18(pMA G69)
51614 2.7GRF18(pMA G15)516489.3
3 讨论
本文报道将大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶基因引入酿酒酵母在P GK 启动子和转录终止信号的调控之下获得高表达;在本身信号肽的引导下,表达产物的99%分泌至胞外,构建的酿酒酵母工程菌GRF18(pMA G 15)在含15%淀粉的YPD 培养基中培养47h 将99%的淀粉水解.
我们曾用地衣杆菌α2淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶基因构建表达载体转化酿酒酵母;获得的酵母工程菌GRF (YEpMA G 27)比仅含α2淀粉酶或葡萄糖淀粉酶单基因的工程菌的酶活力及淀粉水解率都高,但水解淀粉的速度慢[9].估计是由于这两种酶的性质特别是作用的温度(80℃,60℃)和p H (7,4.5)不同造成的.本文用大麦α2淀粉酶取代地衣杆菌α2淀粉酶取得良好的效果,淀粉水解时间从6d (10%淀粉)缩短至47h (15%淀粉).这与大麦α2淀粉酶的最适
温度(68℃
)和p H (5.2)与黑曲霉糖化酶的最适p H 和温度接近有关.在构建表达载体pMA G 15时,大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶基因的信号序列均未被除去.这2个酶都是靠本身的信号肽被引导至胞壁再分泌至胞外的.我们的工作已经证实,黑曲霉糖化酶信号肽切除位点的氨基酸残基与酵母信号肽切除位点的相同,因而能被酵母识别和加工[8].但大麦α2淀粉酶信号肽序列与酵母的不完全相同,却能高效表达和分泌,原因有待进一步研究.
参 考 文 献
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黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的原核表达及其蛋白产物的Western_blot分析
收稿日期:2008-12-25 基金项目:内蒙古自治区优秀学科带头人计划项目(20050802) 作者简介:安玉麟(1954-),男,内蒙古土默特右旗人,研究员,硕士生导师,主要从事作物栽培、育种研究工作。 黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的原核表达及 其蛋白产物的Western 2blot 分析 安玉麟1,孙瑞芬1,张鹤龄2,郭树春1,闫素丽3 (1.内蒙古农牧业科学院生物技术中心,内蒙古呼和浩特 010031;2.内蒙古大学生命 科学学院,内蒙古呼和浩特 010021;3.内蒙古农业大学农学院,内蒙古呼和浩特 010019) 摘要:为进一步研究黑曲酶中国株3.758葡萄糖氧化酶(G OD )在大肠杆菌中的表达水平和条件,将黑曲霉中国株 3.758的葡萄糖氧化酶(G OD )基因定向克隆于原核表达载体pET 211a 上,构建了融合表达的重组质粒pET/G O ,转化E.coli BL21(DE3)plysS ,用IPTG 诱导,超声波粉碎细菌细胞,S DS 2PAGE 电泳检测,G OD 基因获得了表达,表达的融合 蛋白相对分子质量为66.5kDa 。用市售葡萄糖氧化酶免疫家兔获得抗血清,酶联法(E LIS A )测定其效价为106,West 2 ern 2blot 分析证明表达的融合蛋白与兔抗G OD 血清有较强的特异性,为黑曲霉3.758葡萄糖氧化酶(G OD )抗体的制备 奠定了基础。 关键词:黑曲霉3.758;葡萄糖氧化酶基因;融合表达;抗血清;E LIS A ;Western 2blot 中图分类号:T Q920.1 文献标识码:A 文章编号:1000-7091(2009)04-0084-04 Prokaryotic Expression and Western 2blot Analysis of G lucose Oxidase G ene from Aspergillus niger AN Y u 2lin 1,S UN Rui 2fen 1,ZHANG He 2ling 2,G UO Shu 2chun 1,Y AN Su 2li 3 (1.Biotechnology Research Center ,Inner M ong olia Academy of Agriculture and Husbundary Sciences ,Huhhot 010031,China ;2.C ollege of Life Science ,Inner M ong olia University ,Huhhot 010021,China ;3.Agricultural C ollege of Inner M ong olia Agricultural University ,Huhhot 010019,China )Abstract :In order to further study expressed level and condition of G lucose oxidase (G OD )from Aspergillus niger 31758in E.coli ,the coding region of G OD from A.niger 3.758was inserted into the prokary otic expression vector pET 2 11a ,and the recombinant plasmid was trans formed into E.coli BL21(DE3)plysS.The result of S DS 2PAGE showed that the G OD gene was expressed by IPTG induction ,and the m olecular weight of the fusion protein was about 66.5kDa.An 2tiserum was produced in rabbit immunized with commercial G OD ,and E LIS A analysis proved that the titer of this antibody was 106.The Western 2blotting result confirmed that the antibody reacted specifically to the expressed fusion protein.The study established basis for preparation of G OD antibody from Aspergillus niger 3.758. K ey w ords :Aspergillus niger 3.758;G lucose oxidase gene ;Fusion expression ;Antiserum ;E LIS A ;Western 2blot 葡萄糖氧化酶(β2D 2glucose :oxygen 12oxidoreduc 2tase EC1.1.3.4,简称G OD ),催化β2D 葡萄糖氧化生 成δ2葡萄糖酸酯和O 2,O 2被还原生成H 2O 2(β2D 2glu 2cose +O 2→glucose 2δ2lactone +H 2O 2)[1]。G OD 的活性最早是1928年由Muller 在黑曲霉的抽提物中发现 的,后来在黑曲霉[2,3]和青霉[4]中都纯化到了G OD 。现已从几种微生物中得到了G OD ,但从黑曲霉中得到的G OD 活性最强。目前G OD 已在临床检测、食 品工业、生物传感器、有机酸生产及抗真菌病转基因研究等方面得到广泛应用[5],而且编码G OD 的基因 已从不同的真菌菌株中分离、克隆。Frederick 等[1]和Whittington 等[6]将来自黑曲霉的G OD 基因成功地重组到酵母中,获得了具有生物活性的酿酒酵母G OD 。Witt 等[7]等在大肠杆菌中表达了青霉G OD 。国内周亚凤等[8]也在酵母中高效表达了黑曲霉G OD 。母敬郁等[9] 利用高表达分泌纤维素酶的真菌 华北农学报?2009,24(4):84287
黑曲霉菌株发酵生产糖化酶发酵罐设计
目录 第一章绪论 (1) 第二章罐体几何尺寸的确定 (2) 2.1夹套反应釜的总体结构 (2) 2.2 几何尺寸的确定 (2) 第三章罐体主要部件尺寸的设计计算 (5) 3.1 罐体 (5) 3.2 罐体壁厚 (5) 3.5人孔和视镜 (6) 3.6接口管 (6) 3.6.1 管道接口（采用法兰接口） (6) 3.6.2 仪表接口 (7) 第四章冷却装置设计 (8) 4.1 冷却方式 (8) 4.2 装液量 (8) 4.3 冷却水耗量 (9) 4.4 冷却面积 (9) 第五章搅拌器轴功率的计算 (10) 5.1不通气条件下的轴功率P0 (10) 5.2通气搅拌功率Pg的计算 (11) 5.3电机及变速装置选用 (11) 第六章结论 (13) 参考文献 (13)
第一章绪论 我设计的是一台30M3机械搅拌通风发酵罐,发酵生产糖化酶。 糖化酶，也称葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），主要用途是作为淀粉糖化剂。它与a-淀粉酶结合可将淀粉酶转化为葡萄糖，可供葡萄糖工业，酿酒工业和氨基酸工业等应用，是工业生产中最重要的酶类之一，也是我国产量最大的酶制剂产品。黑曲霉A.S.3.4309是国内糖化酶活性最高的菌株之一。 糖化酶生产菌重要的有：雪白根霉，德氏根霉，河内根霉，爪哇根霉，台湾根霉，臭曲霉，黑曲霉，河枣曲霉，宇佐美曲霉，红曲霉，扣囊拟内孢霉，泡盛曲霉，头孢霉，甘薯曲霉，罗耳伏革菌。 综合温度、PH等因素选择黑曲霉A.S.3.4309菌株，该菌种最适发酵温度为32-34℃，pH为4.5，培养基为玉米粉2.5%,玉米浆2%，豆饼粉2%组成。 主要生产工艺过程为如下：菌种用蔡式蔗糖斜面于32℃培养6天后，移植在以玉米粉2.5%,玉米浆2%.组成的一级种子培养基中，与32℃摇瓶培养24-36h，再接入（接种量1%）种子罐（培养基成分与摇瓶发酵相同），并与32℃通气培养搅拌24-36h，然后再接入（接种量5%-7%）发酵罐。发酵培养基由玉米粉2.5%,玉米浆2%，豆饼粉2%组成（先用a-淀粉酶液化），发酵温度为32℃，在合适的通气搅拌条件下发酵96小时酶活性可达6000u·ml-1 。 发酵液滤去菌体，如有影响糖化效率的葡萄糖甘转移酶存在，则通过调节滤液PH 等方法使其除去，再通过浓缩将酶调整到一定单位，并加入防腐剂（如苯甲酸）。如制备粉状糖化酶，则可通过盐析或加酒精使酶沉淀，沉淀经过压滤，滤泥再通过压条烘干，粉碎，即可制成商品酶粉。 发酵罐主要由罐体和冷却蛇管，以及搅拌装置，传动装置,轴封装置，人孔和其它的一些附件组成。这次设计就是要对20M3通风发酵罐的几何尺寸进行计算；考虑压力，温度，腐蚀因素，选择罐体材料，确定罐体外形、罐体和封头的壁厚；根据发酵微生物产生的发酵热、发酵罐的装液量、冷却方式等进行冷却装置的设计、计算；根据上面的一系列计算选择适合的搅拌装置，传动装置，和人孔等一些附件的确定,完成整个装备图，完成这次设计。 这次设计包括一套图样，主要是装配图，还有一份说明书。而绘制装配图是生物工程设备的机械设计核心内容，绘制装配图要有合理的选择基本視图，和各种表达方式，
黑曲霉植酸酶液体发酵工艺研究
第14卷第3期武汉科技学院学报Vo1.14No.3 2001年9月JOURNAL OF WUHAN INS TITUTE OF SCIE NCE AND TECHNOLOGY Sep.2001 黑曲霉植酸酶液体发酵工艺研究 王亚林严建芳 (武汉工业学院生物与化学工程系武汉430022) 摘要研究了黑曲霉液体培养生产植酸酶的发酵工艺,研究了培养基碳源、诱导物、表面活性剂等因素对产酶的影响,对发酵时间、p H变化规律等进行了研究和分析。 关键词植酸酶黑曲霉发酵X 中图分类号Q815;Q814.9 植酸酶作为一种饲料和食品添加剂,在国内外已开始得到广泛应用,特别是由于其在改善环境方面的作用,更是受到人们的极大关注。植酸酶主要存在于植物及微生物中,由于在微生物中含量较高而具有较大的开发价值。目前,美国、荷兰和丹麦等国已先后运用发酵法生产植酸酶,我国也已在进行这方面的研究开发。可以预计,植酸酶制剂将有良好的市场前景。 1材料与方法 1.1菌种 黑曲霉(Aspergillus niger)W S201,武汉工业学院微生物室保存。 1.2培养基 1.2.1种子培养基:豆芽汁蔗糖培养基。 1.2.2摇瓶发酵培养基(%):葡萄糖3.0,淀粉7.0,NH4NO30.5,蛋白胨0.2,CaCl20.2,MgSO4# 7H2O0.05,KCl0.05,MnSO4.4;H2O0.03,pH值5.5。 1.3培养方法 配制培养基时适当加热、摇动或搅拌,使淀粉溶解成液态或胶状,121e灭菌20min。在30?1e下摇床培养3~5d(转速220~250r/min)。 1.4植酸酶的测定 植酸酶活力的定义:37e,pH5.5条件下每分钟从植酸钠中释放出1L mol无机磷所需的酶为1u。 酶活测定方法:取0.1ml含酶液加至一洁净试管中;加入0.9ml反应液,反应液为含0.5%植酸钠的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5),在37e恒温反应30min;加入1ml10%三氯醋酸终止反应;加入2ml显色液,摇匀后静置15~30min显色,显色液由1%钼酸铵50ml与3.66 X收稿日期:2001-06-26 作者简介:王亚林,男,副教授,在读博士生;研究方向:发酵工程、生化工程
黑曲霉发酵生产α-淀粉酶微生物实验报告
黑曲霉发酵生产α-淀粉酶 前言： α-淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为α构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶。耐酸性α-淀粉酶是在酸性条件下水解淀粉的酶类，其最适pH在4.0左右。自从日本研究者Y asujiMinoda等人用黑曲霉生产耐酸性α-淀粉酶以来，各国都对耐酸性α-淀粉酶进行了研究。 通过黑曲霉发酵生产α-淀粉酶的实验过程，熟悉发酵罐的构造和使用方法。初步了解发酵生产的原理和常规发酵参数的检测方法。整个实验按照“菌种的培养空消实消接种发酵放罐”的发酵过程进行。在整个发酵的过程中，每隔6h取一次发酵液样品检测其pH值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。最后将所测数据进行整理、分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培养条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。 正文： 一、实验目的 1．了解发酵罐的几大系统组成，即空气系统、蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。 2．掌握发酵罐空消的具体方法及步骤 3．掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤 4．掌握发酵罐各系统的控制操作方法 二、实验原理 1.蒸汽系统： 蒸汽发生器：主要用于灭菌，分为自动加水和手动加水两种方式。 2.温度系统： (1) 夹套升温：蒸汽通入夹套。 (2) 夹套降温：冷水通入夹套，下进水，上出水。 (3) 发酵过程自动控温系统 3.空气系统： 空气除菌设备：空压机贮气罐油水分离器空气流量计空气过滤器发酵罐 4.补料系统：补加培养基、消泡剂、酸碱等。 5.在线控制系统
淀粉酶
一、淀粉 ?1、淀粉的性状及组成 ?淀粉为白色无定形结晶粉末 ?形状有圆形、椭圆形和多角形三种 ?一般含水分高、蛋白质少的植物的淀粉颗粒比较大些，多成圆形或椭圆形，如马铃薯、木薯等。 淀粉的性状及组成 ?碳44.4％，氢6.2％，氧49.4％ ?分为直链淀粉和支链淀粉 ?普通谷类和薯类淀粉含直链淀粉17％～27％，其余为支链淀粉； ?而粘高粱和糯米等则不合直链淀粉，全部为支链淀粉。 ?直链淀粉聚合度约100～6000之间 ?遇碘反应是纯蓝色 淀粉的性状及组成 ?支链淀粉是由多个较短的α-1,4糖苷键直链结合而成。每2个短直链之间的连接为α-1,6糖苷键。 ?聚合度约1000～3000,000之间，一般在6000以上。 ?遇碘呈紫红色反应。 2、淀粉的特性 ?糊化：淀粉在热水中能吸收水分而膨胀，最后淀粉粒破裂，淀粉分子溶解于水中形成带有粘性的淀粉糊。 ?第一阶段：淀粉缓慢地可逆地吸收水分 ?第二阶段：当温度升到大约65℃时，淀粉颗粒经过不可逆地突然很快地吸收大量水分后膨胀，粘度增加很大。 ?第三阶段：当温度继续升高，淀粉颗粒变成无形空囊，可溶性淀粉浸出，成为半透明的均质胶体。 3、酶解法 酶解法是利用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的方法。 酶解法可分为两步： 第一步，利用α-淀粉酶将淀粉液化； 第二步，利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解转化为葡萄糖。生产上这两步分别称为液化和糖化。由于在该过程中淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的。因此酶解法又称为双酶法或多酶法。 ?优点：1、酶解法是在酶的作用下进行的，反应条件较温和，不需要耐高温高压或酸腐蚀的设备； ?2、酶作为催化剂的特点是专一性强，副反应少，故水解糖液纯度高，淀粉转化率高； ?3、可在较高的淀粉乳浓度下水解。 ?4、酸解法一般使用10-12Bx（含18%--20%淀粉）的淀粉乳，而酶解法可用20—23Bx （含34%--40%淀粉）的淀粉乳，并且可以采用粗原料。 ?5、用酶解法制得的糖液较纯净、颜色浅、无苦味、质量高，有利于糖液的充分利用。 ?6、双酶法工艺同样适用于大米或粗淀粉原料，可避免淀粉在加工过程中的大量流失，减少粮食消耗。 缺点：酶解法反应时间较长，设备要求较多，且酶是蛋白质，易引起糖液过滤困难。当然，随着酶制剂生产及应用技术的提高，酶解法制糖将逐渐取代酸解法制糖。 葡萄糖的分解反应 葡萄糖（失水）5`-羟甲基糠醛+甲酸
两种曲霉糖化性质的比较
两种曲酶糖化性质的比较研究在国内传统的制酒行业中，由于黑曲霉含有丰富的酶系如液化酶、糖化酶、纤维素酶和蛋白酶等，自70年代大多都由米曲霉改为黑曲霉作糖化用菌种。但在日本迄今仍在采用米曲霉做糖化菌，说明其中必有原因。鉴于此，本实验以黑曲霉和米曲霉为研究对象，研究比较它们的液化酶和糖化酶（葡萄糖淀粉酶）生产性质。 黑曲霉是一种常见的真菌, 属于半知菌类曲霉属。黑曲霉对营养要求较低, 只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好。黑曲霉可以产生许多种酶, 现已成为工业应用常见的菌种之一。根据bigelis1989年的统计, 25种主要商品酶制剂中就有15种来源于黑曲霉仁, 。它们分别是α-淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、半纤维素酶、橙皮昔酶、脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、单宁酶。美国准许使用的食品工业用酶生产菌种只有黑曲霉、酵母、枯草杆菌等约20种, 其中以黑曲霉所产酶类最多。我国酶制剂工业生产用菌种中, 黑曲霉占了17种中3种, 即黑曲霉变异株和,它们分别用于糖化酶、果胶酶和酸性蛋白酶的生产[1]。黑曲霉酶类在工业上具有重要的作用, 例如, 柠檬酸等有机酸的发酵生产、食品及饮料加工以及用于轻化工业、纺织工业、饲料加工和废物的处理等等。总之, 黑曲霉生产的酶制剂具有用量大、应用范围广、安全性好的特点, 已愈来愈受到人们的重视。 米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。 1 材料与方法 1．1材料 菌种：黑曲霉UV-48；米曲霉-4 1．2培养基 种子培养基（土豆汁培养基；察式培养基）；发酵培养基（麸皮培养基；液
淀粉酶,糖化酶
糖化酶 糖化酶Gluco-Amylase 又称葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），是以黑曲霉变异菌株经发酵制得的高效生物催化剂。糖化酶能在常温条件下将淀粉分子的a-1.4和a-1.6糖苷键切开，而使淀粉转化为葡萄糖。凡是以淀粉为原料又需糖化的生产过程，均可使用糖化酶以其提高淀粉糖化收率。不含转苷酶将具有极高的转化率。其系列产品有固体和液体两种类型，适用于淀粉糖、酒精、酿造、味精、葡萄糖、有机酸和抗菌素等工业. 一、产品特性：1、作用方式：糖化酶又称葡萄糖淀粉酶，它能从淀粉分子的非还原性末端水解a—1，4葡萄糖苷糖，生产葡萄糖，也能缓慢水解a—1，6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖. 2、热稳定性：在60℃下较为稳定，最适作用温度58—60℃. 3、最适作用：PH4.0—4.5 4、产品质量符合QB1805.2—93标准. 二、产品规格. 项目指标固体糖化酶液体糖化酶外观黄褐色粉末褐色液体酶活力5万、10万、15万10万、15万水份（%）≤8 细度（目）80%通过40目酶存活率半年不低于标定酶活三个月不低于标定酶活 三、酶活力定义：1克酶粉或1ml酶液于40℃PH4.6条件下，1小时分解可溶性淀粉产生1mg 葡萄糖的酶量为1个酶活单位。 四、应用参考 酒精工业：原料经中温蒸煮冷却到58—60℃，加糖化酶，参考用量为80—200单位/克原料，保温30—60分钟，冷却至30℃左右发酵。 淀粉糖工业：原料经液化后，调PH到4.2—4.5，冷却到58—60℃，加糖化酶，参考用量为100—300单位/克原料，保温糖化24—48小时。 啤酒行业：生产“干啤酒”时，在糖化或发酵前加入糖化酶，可以提高发酵度。 酿造工业：在白酒、黄酒、曲酒等酒类生产中，以酶代曲，可以提高出酒率，也普遍用于食醋工业。其他工业：在味精、抗菌素等其他工业应用时，淀粉液化后冷却到60℃，调PH4.2—4.5，加糖化酶。参考用量100—300单位/克原料。 淀粉酶 生物学 中文名称：淀粉酶
淀粉酶及其应用
淀粉酶及其应用 0 引言 淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用。 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。最初，淀粉酶一词用来指可以水解直链淀粉、支链淀粉、肝糖及其降解产品中α-1，4-糖苷键的酶(本菲尔德(Bernfeld)，1955年；费希尔(Fisher)和斯坦(Stein)，1960年；迈拜克(Myrback)和纽慕勒(Neumuller)，1950年)。它们水解相邻葡萄糖单体之间的键，产生带有具体用酶特征的产品。 近年来，人们发现了很多与淀粉及相关多糖结构降解有关的新型酶，并对其进行了研究(鲍伊(Boyer)和英格尔(Ingle)，1972年；博诺考尔(Buonocore)等人，1976年；格里芬(Griffin)和福格蒂(Fogarty)，1973年；福格蒂(Fogarty)和格里芬(Griffin)，1975年)。 (1)有一些微生物源可以劈开这些结构中的α-1，4或α-1，4和／或α-1，6键，人们将现在已经或将来可能对这些微生物源工业化生产有重大影响的酶分为六种(福格蒂(Fogarty)和凯利(Kelly)，1979年)。 (2)水解α-1，4键和绕过α-1，6键的酶，比如α-淀粉酶(内作用淀粉酶)。 (3)水解α-1，4键，但不能绕过α-1，6键的酶，比如β-淀粉酶(把麦芽糖当作一个重要的终端产品来生产的外作用淀粉酶)。 (4)水解α-1，4和α-1，6键的酶，比如淀粉葡糖苷酶(葡萄糖淀粉酶)和外作用淀粉酶。 (5)仅水解α-1，6键的酶，比如支链淀粉酶和其它一些脱支酶。 (6)优先水解其它酶对直链淀粉和支链淀粉所起的作用产生的短链低聚糖中α-1，4键的酶，比如α-葡萄糖苷酶。 (7)将淀粉水解为一连串非还原环状口葡糖基聚合物，称为环糊精或塞查丁格(Sachardinger)糊精的酶，比如浸麻芽孢杆菌(Bacillus macerans)淀粉酶(环糊精生成酶)。 1 淀粉 在描述淀粉分解酶的作用方式和性质前，有必要来讨论一下这种天然基一一淀粉的特性。淀粉是所有高等植物中主要储备碳水化合物的。在有些植物中，淀粉占整个未干植物的70％。淀粉是不溶于水的细小颗粒。这些颗粒的大小和形状常常由植物母体决定，具有植物品种的特征。当把淀粉颗粒置于水中加热时，颗粒中的连接氢键变弱，颗粒开始膨胀、凝胶化。最终，它们根据多糖的浓度或形成糊状物或形成弥散现象。淀粉来自于植物，比如玉米、小麦、高梁、稻米的种子，或木薯、马铃薯、竹芋的茎根，或来自于西谷椰子的木髓。玉 米是淀粉的主要商业原料，通过湿磨生产工艺便可获得商品淀粉(博考特(Berkhout)，1976年)。直链淀粉和支链淀粉的特性见表1。 表1直链淀粉和支链淀粉的比较 性质 直链淀粉 支链淀粉 基本结构 基本直线 分岔 在水溶液中稳定性 回生 稳定 聚合度 C.103 C.104～105 平均链长 C.103 C.20～25 β淀粉酶水解 87％ 54％
大麦_淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌
大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在 酿酒酵母中的表达和分泌 3罗进贤 李政海 李文清 (中山大学生物化学系及生物工程中心,广州510275) 摘要 将大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶cDNA 重组进同一大肠杆菌2酵母穿梭质粒构建含双基因的表达分泌载体pMA G 15.用原生质体转化法将pMA G 15引入酿酒酵母(S.cerevisiae GRF18),在酵母P GK 基因的启动子和转录终止信号及本身的信号序列的调控下,实现大麦α2淀粉酶和糖化酶的高效表达,99%以上的酶活力分泌至培养基中.构建的酿酒酵母菌株GRF18(pMA G 15)在含15%可溶性淀粉的培养基中,培养47h 能水解99%的淀粉,并能发酵产生酒精. 关键词 大麦α2淀粉酶 黑曲霉糖化酶 酿酒酵母 表达和分泌 酿酒酵母是酿酒工业、酒精和单细胞蛋白的生产菌,但由于其不具有淀粉水解酶的活力不能发酵淀粉.发酵前淀粉需先经过蒸煮、液化、糖化等工序变成葡萄糖后才能被利用.从80年代中期开始将各种来源的α2淀粉酶和糖化酶基因分别克隆进酿酒酵母,构建能分解淀粉的酵母菌株[1～5].只是由于构建菌株的酶活力不高,降解淀粉的速率较慢还不能用于生产.我们曾将地衣芽孢杆菌α2淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶G AI 的cDNA 分别或同时转入酿酒酵母获得表达和分泌[6～9],其中含α2淀粉酶和糖化酶双基因的酿酒酵母GRF18(YEpMA G 27),酶的表达和分泌水平都很高,但淀粉水解的速率仍较低.本文报道用酶学性质与黑曲霉糖化酶比较接近的大麦α2淀粉酶取代细菌α2淀粉酶,构建含大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶双基因的酿酒酵母工程菌,实现α2淀粉酶和糖化酶的高表达和分泌,获得能快速分解淀粉的酵母工程菌. 1 材料和方法 111 材料 11111 菌株与质粒 本研究所用菌株与质粒如表1,其中pBAL 27是含大麦α2淀粉酶基因的大肠杆菌2酵母穿梭质粒,pMA G 69为含黑曲霉糖化酶G AI cDNA 的大肠杆菌2酵母穿梭质粒. 11112 培养基 大肠杆菌培养和转化用LB 培养基,酵母的培养和转化使用的YPD , 1996209208收稿,1996211205收修改稿 3广东省自然科学基金资助项目 中国科学 (C 辑) 第28卷 第1期SCIENCE IN CHINA (Series C ) 1998年2月
糖化酶
我国糖化酶的研究概况 糖化酶是世界上生产量最大应用范围最广的酶类，介绍了糖化酶的结构组成、特性、生产、提取、活力检测以及提高酶活力的研究。主要的内容包括：一、糖化酶的简介 糖化酶是应用历史悠久的酶类，1 500年前，我国已用糖化曲酿酒。本世纪2O年代，法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲，并用于酒精生产。50年代投入工业化生产后，到现在除酒精行业，糖化酶已广泛应用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面，是世界上生产量最大应用范围最广的酶类。 糖化酶是葡萄糖淀粉酶的简称(缩写GA或G)。它是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶。其主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解a一1，4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像B一淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成B—D一葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a一1，6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a一1，3连接的碳链，但水解a一1．4糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。 二、糖化酶的结构组成及分类 糖化酶在微生物中的分布很广，在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得，从细菌中也分离到热稳定的糖化酶，人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶。不同来源的淀粉糖化酶其结构和功能有一定的差异，对生淀粉的水解作用的活力也不同，真菌产生的葡萄糖淀粉酶对生淀粉具有较好的分解作用。 糖化酶是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在60 000 到1 000 000间，通常碳水化合物占4％ 18％。但糖化酵母产生的糖化酶碳水化合物高达80％，这些碳水化合物主要是半乳糖、葡萄糖、葡萄糖胺和甘露糖。 三、糖化酶的特性 1、糖化酶的热稳定性 在糖化酶的热稳定性机理及筛选热稳定性糖化酶菌株上。工业上应用的糖化酶都是利用它的热稳定性。一般真菌产生的糖化酶热稳定性比酵母高，细菌产生
酶制剂——植酸酶
酶制剂——植酸酶 早在1915年，Anderson提出天然植酸磷利用率不同于化学分离纯化产品的一个可能原因是饲料成分中存在水解植酸磷为无机磷的酶——植酸酶，并对植酸酶的来源、理化特性及作用机理进行了研究，从而引起了许多学者的广泛关注。近年来，随着发酵工程和生物技术的迅速发展以及人们环境保护意识的提高，采用DNA重组技术使微生物产生植酸酶活性大幅度提高，大大降低了植酸酶生产成本，从而使之得到广泛应用。植酸酶现已成为饲料酶制剂研究的一个热点，尤其在一些畜禽饲养密度大、环境污染严重的国家如美国、加拿大、芬兰、荷兰、法国、瑞士等。许多科学家对这一课题的研究很感兴趣，欧洲、北美和其它地区对此的兴趣也与日俱增。1994年欧共体、美国、芬兰、丹麦、德国等国的生产企业均前后推出各种植酸酶制剂,并利用DNA重组技术获得生产植酸酶的工程菌,为广泛应用植酸酶提供了可能。 一、植酸酶结构及性质 植酸酶，又称为肌醇六磷酸水解酶，是一种可使植酸磷复合物中的磷变成可利用磷的酸性磷酸酯酶。植酸酶广泛存在于动植物组织中，也存在于微生物（细菌、真菌和酵母）。目前分离出的植酸酶主要有两种：3-植酸酶（EC 3.1.3.8）和6-植酸酶（EC 3.1.3.26），前者最先水解的是肌醇3号碳原子位置的磷酸根，主要存在于动物和微生物；后者最先水解的是6号碳原子的磷酸根，主要存在于植物组织。因此，动物胃肠道可能有三种来源的植酸酶，但主要来源于饲料本身以及来源于微生物合成。 大量高浓度的植酸酶主要存在于无花果曲霉和黑曲霉与小麦麸的培养物中。因此饲料植酸酶的生产目前主要使用微生物曲霉菌株。霉菌植酸酶分子量一般在60 ~ 100KDal之间，曲霉植酸酶分子量较大。如土曲霉为214Kdal，无花果曲霉为85 ~ 100KDal，黑曲霉为200KDal。细菌植酸酶分子量一般较小，如大肠杆菌为42Kdal，枯草杆菌为38KDal。霉菌植酸酶通常有一个最适pH，在4.2 ~ 5.5范围内。细菌植酸酶最适pH稍高一些。据报道,某些霉菌植酸酶，特别是曲霉植酸酶具有多个最适pH值。酶的最适温度因酶来源不同而有差异。霉菌植酸酶适宜温度通常在45 ~ 57℃范围内，黑曲霉为53℃，无花果曲霉为55℃。
葡萄糖淀粉酶
题目：葡萄糖淀粉酶结构与功能的研究食品学院学院食品科学与工程专业 班级食科0905班 学号6130112133 学生姓名田顺风 二〇一三年十二月
葡萄糖淀粉酶结构与功能的研究 田顺风 （江南大学食品学院江苏省无锡） 摘要：本文对葡萄糖淀粉酶在微生物中的分布进行了综述，对葡萄糖淀粉酶的基本结构及作用机理、理化性质及在实际应用中的问题和拟解决途径有了初步了解，并对葡萄糖淀粉酶的应用及研究现状进行了展望。 关键词：葡萄糖淀粉酶；基本机构；理化性质 Research on the structure and function of glucoamylase Tian Shunfeng (Jiangnan University he School of Food Jiangsu Province WuXi) Abstract:In this paper, glucoamylase distributed in microorganisms are reviewed,and we have a preliminary understanding of the basic structure and mechanism of reaction of glucoamylase, physicochemical properties and problems in practical applications and ways to be solved.Also the application and research status of glucoamylase are discussed. Key words: glucoamylase; basic structure; physicochemical properties 引言 酶作为催化剂，本身在反应过程中不被消耗，也不影响反应的化学平衡。酶有正催化作用，也有负催化作用，不只是加快反应速率，也有减低反应速率。与其他非生物催化剂不同的是，酶具有高度的专一性，只催化特定的反应或产生特定的构型。目前已知的可以被酶催化的反应有约4000种，已有数百计的酶被纯化到结晶的形式。 根据蛋白质分子的组成和盘曲折叠方式，酶可分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。一级结构指蛋白质分子中肽链的氨基酸残基的排列顺序，由于半胱氨酸侧链巯基经氧化后形成—s—s—键，因此在蛋白质分子的链内或链间都有可能形成二硫桥键；二级结构指蛋白质分子肽链本身的三维空间的规律性，主要由肽链骨架之间的羰基和亚氨基间形成的氢键来维系；三级结构为蛋白质分子又可按照一定方式再盘曲折叠，主要由盐键、氢键、疏水键等所维系。这样折叠后，蛋白质的肽链虽很长，但由于二、三级结构的存在，多数蛋白质在空间构型上却是紧密的球状分子；四级结构指由多条各自具有一级、二级、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式，亚基之间主要由各表面暴露的侧链形成的键（如疏水键）所维系。 葡萄糖淀粉酶（glucoamylase）的系统名称为α-1,4-葡聚糖葡萄糖苷水解酶或γ-淀粉酶，简称糖化酶[1]，是一种单链的酸性糖苷水解酶，具有外切酶活性。它从淀粉或类似物分子的非还原末端顺序切开α-1,4-糖苷键，生成β-葡萄糖。此外，它也能水解α-1,6-糖苷键和α-1,3-糖苷键。目前，糖化酶的研究主要集中在耐热高产菌株的筛选；糖化酶的热稳定性机理；利用DNA重组技术构建优良工程菌株等方面。 酶的本质是蛋白质，因此也可用分离纯化蛋白质的方法分离纯化蛋白酶，传统分离纯化蛋白质的方法是利用沉淀原理进行的，已广泛应用于实验室及工业规模蛋白质等生物产物的回收、浓缩和纯化。目前，用于蛋白酶的分离纯化的沉淀方法主要有有机溶剂沉淀法、盐析沉淀法、等电点沉淀法、热变性沉淀法等。葡
β-淀粉酶
β-淀粉酶 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的统称,按水解淀粉方式不同,淀粉酶可分为α- 淀粉酶、β-淀粉酶、脱枝酶及葡萄糖淀粉酶4 大类.按照结构的差异,又可将其分为α、β型两大类.β-淀粉酶是一种外切酶,其作用于淀粉时,从α- 1,4糖苷键的非还原性末端顺次切下一个麦芽糖单位,产物为麦芽糖和大分子的β-界限糊精.因为该酶作用于底物时,发生沃尔登转化（Waldeninversion）,使产物由α型变为β型麦芽糖,释放的β-麦芽糖在C1位上有一个自由H基,为β型,故名β-淀粉酶.近年来,β-淀粉酶的研究引起了酶制剂行业的广泛关注.本文对β-淀粉酶的来源、性质、分离纯化及应用等方面的研究进展进行了综述,最后对β-淀粉酶在酶制剂行业的研究及应用进行了展望。 一、来源 β—淀粉酶广泛存在于大麦、小麦甘薯、大豆等高等植物中，目前商品β—淀粉酶绝大部份均是从植物中提取的，芽孢杆菌β—淀粉酶生产量极低。很多微生物通过发酵能产生β-淀粉酶,如蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、假单胞菌等.但通过微生物发酵生产的β-淀粉酶耐热性差,且成本较高,要达到工业化生产还需一定距离.植物中β-淀粉酶酶活力高、耐热性好、作用 pH 范围较广,适合于高麦芽糖浆的生产要求.植物体中的β-淀粉酶主要存在于质体内,而在其他亚细胞区域内β-淀粉酶的分布都较少.甘薯
在自然栽培的条件下,只有块根中存在β-淀粉酶,其余的部位几乎检测不出β-淀粉酶的存在,但是只有存在于质体外的β-淀粉酶才具备活性.Zieglar认为β-淀粉酶在液泡中也有所分布,并且在多糖代谢中起到作用.单子叶植物中β-淀粉酶存在于胚乳细胞中,在其他器官中很少有分布,当种子萌发时,β-淀粉酶与其他相关酶一起协同完成淀粉的降解.而在高等植物中,存有两种不同酶活力的β-淀粉酶,它们分别存在于植物的不同组织器官中：一种是以高活力存在的β-淀粉酶,主要存在于禾本科植物的胚乳中,当这类植物的种子开始发芽时,β-淀粉酶的酶活力会显著升高；而另一种则是以相对酶活性较低的形式,普遍存在于植物的各个组织器官中的β-淀粉酶.这两种形式的β-淀粉酶虽然在抗原性上较相似,但在其他方面存在着较大的区别,而且它们的生成方式也不尽相同,推测得出,前一种β-淀粉酶可能是由后一种β-淀粉酶的基因转变而来的。β-淀粉酶在高等植物体内是以游离态和结合态两种形式存在的,用水提的方法可以将植物中游离态的β-淀粉酶提取出来,而以结合态形式存在的β-淀粉酶的提取还需要添加还原剂或蛋白水解酶,这种结合态的β-淀粉酶由于与种子中的其他蛋白结合会成为复杂的不溶物质.这两种形态的β-淀粉酶在大麦种子中占所有蛋白含量的1%左右。 二、β—淀粉酶性质 β—淀粉酶能将直链淀粉分解成麦芽糖的淀粉酶。可耐酸。将麦芽汁调节pH值为3.6，在0℃下可使α-淀粉酶失去活力，而余下β-淀粉酶。β-淀粉酶的唯一产物是麦芽糖，不是葡萄糖。β-淀粉酶水
黑曲霉生产糖化酶及酶活测定_单海艳
第19卷 第7期 牡丹江大学学报 Vol.19 No.7 2010年7月 Journal of Mudanjiang University Jul. 2010 92 文章编号：1008-8717（2010）07-0092-03 黑曲霉生产糖化酶及酶活测定 单 海 艳 （牡丹江大学，黑龙江 牡丹江 157000） 摘 要：本文对黑曲霉突变株Uv11－48生产糖化酶液体深层发酵进行了全程生产工艺的研究，证实了黑曲霉突变株是一种产孢力强、抗污染能力强、易培养的糖化酶生产菌，经液体深层通风发酵可得出：只要充分利用突变株的有利条件，掌握好菌种特性，合理配制营养，控制好发酵条件，便可获得高酶活力的高产糖化酶。本实验还运用了几种酶活力测定方法，以资进行优劣探讨。 关键词：黑曲霉；液体通风发酵；糖化酶；酶活力 中图分类号：Q-331 文献标识码：B 一、前言 （一）黑曲霉菌种特性 1．黑曲霉的分类地位 黑曲霉在分类学上处于：真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、曲霉属、黑曲霉群，拉丁学名：Aspergillus niger 。 2．黑曲霉形态、生理、生态特性 孢子头呈暗黑色，菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成，菌丝黑褐色，顶囊球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。一般进行无性生殖，其可育细胞称足细胞。 3．黑曲霉突变株的形态、生理、生态、特征 在查氏培养基上菌落曲型为炭黑色，有辐射沟纹，从菌落边缘向中心，分化为伸长部位，活性部位，成熟部位，老化部位几个区域即孢子萌发最早出现于中心部位是伸展部位，并逐渐形成密生部位，分生孢子部位，最后在中心出现的是成熟部位，菌落背面无色或稍黄。 （二）糖化酶的分类、地位、性质及用途 1．糖化酶在国际酶学委员会，在系统命名法中的地位 糖化酶是淀粉酶，在系统命名法中属水解酶类。 2．糖化酶的性质 糖化酶（glucamylase ）又名糖化型淀粉酶（glueoamylase ）或淀粉葡萄糖苷酶。其系统名称为淀粉α1.4-葡萄聚糖水解酶。糖化酶是一种胞外外切酶，但其专一性低，主要是从淀粉链的非还原性末端切开α-1.4-键。一般淀粉水解程度达80％。 （1）糖化酶中糖和蛋白组成 糖化酶是一种糖蛋白，通常碳水化合物占4%-18％，这些碳水化合物主要是半乳糖、葡萄糖、葡萄糖胺和甘露糖，糖化酶残基的排列在其热和酸碱稳定性上有特殊意义。 （2）糖化酶组分多型性 真菌产生的糖化酶组分多型性是常见的，市售的糖化酶中可分离出葡萄糖酶?和葡萄糖酶И两种组分。而市售黑曲霉生产的糖化酶曾分离出六种活性组分，每种均可从可溶性淀粉中释放出单一的β-D-葡萄糖。这六种组分的分子量，沉淀系数，化学组分，等电点，酶的动力学及其它性质各异。培养基成分和的生产条件对糖化酶组分多型性也有影响，天然糖化酶在微生物培养或酶的制备过程中可能受葡萄糖苷酶和蛋白酶的作用而成多型性的酶类。 （3）糖化酶的热稳性 工业用的糖化酶都是利用它的热稳性，α-环状糊精可提高糖化酶的热稳性，最适温度范围一般为50℃～60℃。 （4）从酶PH 稳定性上看： 糖化酶具较宽的PH 值适应范围，但最适PH 为4-5。 （5）Ca 离子与酶结合后可使结构变得松散些，更有利于催化反应。 （6）糖化酶与底物亲和性 收稿日期：2009-11-26 作者简介：单海艳（1977—），女，牡丹江大学化工系讲师，研究方向：生物教学。 DOI:10.15907/https://www.360docs.net/doc/2e16684823.html,ki.23-1450.2010.07.036
植酸酶
X X 大学题目：植酸酶 姓名 XX 学号XXXXXXXXX 学院生命科学学院 年级专业 2012级微生物 课程名称发酵工程调控 任课教师 XX
植酸酶 生命科学学院20XX级研究生 摘要：文章介绍了植酸酶分类和来源，以及现阶段植酸酶在饲料、食品、酒精、环境保护方面的应用，其中在饲料中的广泛应用给植酸酶的发展带来了良好的前景。植酸酶的生产主要有两种方法：固体发酵和液体发酵，虽然固体培养设备比较简单、成本低、对环境危害小、易于推广，但放大比较困难、培养参数控制较复杂、容易污染杂菌，而且生产的植酸酶分离纯化较难因此目前工业生产主要用液体发酵的方法进行生产。 关键词:植酸酶固体发酵液体发酵培养参数 1前言 1.1植酸酶的简介 植酸的化学名称是肌醇六磷酸酯，是肌醇和磷酸根结合而成的化合物，其化学结构是由六个碳原子构成的正六边形，每个碳原子上连有一个带负电的磷酸根，具很强的螯合能力，与EDTA接近。植酸的分子式为C6H18O24P6，含磷量为281.6mg/g。其结构见下图： 植酸酶( phytase)属于磷酸水解酶，是催化植酸和植酸盐水解成肌醇和磷酸( 或盐) 的一类酶的总称, 系统名称为肌醇六磷酸酶, 属于磷酸单脂水解酶, 是一类特殊的酸性磷酸酶,水解产物是肌醇、无机磷及其他可能与植酸结合的物质，如钙、锌、镁、锰等微量元素以及蛋白质、淀粉。
1.2植酸酶的分类 植酸酶的分类及来源植酸酶主要指 6-植酸酶和 3-植酸酶。 6-植酸酶( EC 3. 1. 3. 26) 首先催化磷酸从肌醇的第六位碳脱落, 3-植酸酶( EC 3. 1. 3. 8) 首先使肌醇第三位碳的磷酸解离, 最终产物都是单磷酸肌醇和正磷酸。植酸酶有三种来源:动物、植物和微生物, 因来源不同而具有显著不同的分子特征和催化 特性。 a 在动物消化道内作用的植酸酶可能来源于：a 小肠内分泌； b 肠道微生物产生； c 饲料中的内源性植酸酶； d 外源微生物产生的植酸酶等。其中，外源植酸酶在植酸水解过程中起主要作用。在自然界中，植酸酶广泛存在于动植物组织和微生物中。 b植物植酸酶均属于肌醇六磷酸-6-磷酸酶，存在于大多数禾谷物中，其活性有很大的 差异。而小麦、大麦和经处理的玉米蒸馏物的活性很高。谷物植酸酶在干燥状态下没 有活性，在消化道被激活后才有活性。 C 微生物植酸酶属于肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶，自然界中许多微生物都产植酸酶，目 前认为产量最高的是真菌，其主要来源于曲霉菌和黑曲霉菌。 1.3 植酸酶的理化性质 植酸酶是一种单体蛋白, 其分子量因来源不同差异很大, 一般在 35-700 kD 之间, 包括一个大分子和一个小肽片断。研究发现无花果曲霉植酸酶有594 个氨基酸残基, 其中包括 37% 的非极性氨基酸、42% 的极性中性氨基酸、11. 5% 的酸性氨基酸和9. 5% 的碱性氨基酸, 其二级结构由 17. 3% 的 A螺旋、29%B折叠、32.6% 的转角和 24. 7% 的无规卷曲所形成。植酸酶除含有蛋白质外, 还含有约 27. 3%的寡糖, 是一种糖蛋白。 纯化的酶晶体结构包含434 个氨基酸, 115 个水分子和一个硫化物结合位点的二价硫 离子。 1.4 植酸酶的市场前景 植酸酶的研究从 20世纪 60年代就已开始,但由于对其认识不足, 相对于其他工业用酶发展缓慢, 到 80年代时, 饲料中还几乎不添加任何植酸酶。随着人们对动物营养学、饲料学研究的深入和集约化养殖的形成, 植酸酶的良好前景得以体现, 同时分子生