大麦_淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌
糖化酶的研究进展
糖化酶的研究进展摘要：糖化酶是世界上生产量最大应用范围最广的酶类,介绍了糖化酶的结构组成、特性、生产、提取、活力检测以及提高酶活力的研究。
关键词: 糖化酶; 特性; 活力一、糖化酶的简介糖化酶是应用历史悠久的酶类，1 500年前，我国已用糖化曲酿酒。
本世纪2O年代，法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲，并用于酒精生产。
50年代投入工业化生产后，到现在除酒精行业，糖化酶已广泛应用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面，是世界上生产量最大应用范围最广的酶类。
糖化酶是葡萄糖淀粉酶的简称[Glucoamylase,(EC.3.2.1.3.)](缩写GA或G), 糖化酶是一种习惯上的名称,学名为α-1,4-葡萄糖水解酶(α-1,4-Glucanglucohydrolace).糖化酶是由曲霉优良菌种（Aspergilusniger）经深层发酵提炼而成。
（深层发酵是利用深层培养基的厌氧环境来培养厌氧细菌，但不能培养严格厌氧细菌,多用于兼性厌氧菌和微耗氧菌的培养）重要糖化酶生产菌有：雪白根霉，德氏根霉，河内根霉，爪哇根霉，台湾根霉，臭曲霉，黑曲霉等。
糖化酶是具有外切酶活性的胞外酶。
其主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解a一1，4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像B一淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成B—D一葡萄糖。
对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a一1，6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。
糖化酶也能微弱水解a一1，3连接的碳链，但水解a一1．4糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。
二、糖化酶的结构组成及分类糖化酶在微生物中的分布很广，在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得，从细菌中也分离到热稳定的糖化酶，人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶。
不同来源的淀粉糖化酶其结构和功能有一定的差异，对生淀粉的水解作用的活力也不同，真菌产生的葡萄糖淀粉酶对生淀粉具有较好的分解作用。
大麦芽酶在工业酿酒中的应用与研究进展
大麦芽酶在工业酿酒中的应用与研究进展大麦芽酶是一种重要的发酵酶，在工业酿酒中被广泛应用。
本文将探讨大麦芽酶在工业酿酒中的应用及研究进展。
首先，我们将介绍大麦芽酶的作用机理和分类，然后探讨其在工业酿酒中的应用和效果，并总结目前的研究进展和未来的发展方向。
大麦芽酶是一种天然的酶类，主要存在于大麦中，可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶两类。
α-淀粉酶能够将淀粉分解成麦芽糖和淀粉酚，并且在酿酒过程中会解除淀粉颗粒的结构，促进淀粉的溶解。
而β-淀粉酶则能够将淀粉链上的1，4-链接断裂，产生麦芽糖和麦芽糖醇。
这些酶的作用能够提高酿酒过程中的糖化效率和酿酒品质。
大麦芽酶在工业酿酒中有着广泛的应用。
首先，在啤酒生产中，大麦芽酶是不可或缺的。
在麦汁糖化过程中，大麦芽酶能够将大麦中的淀粉转化为可发酵的麦芽糖，为酵母发酵提供碳源。
同时，大麦芽酶还能够降低酿酒过程中的粘度，提高过滤效果，使得生成的啤酒更加清澈透明。
其次，在白酒生产中，大麦芽酶也扮演着重要的角色。
在高温下，大麦芽酶能够分解淀粉，提供更多的可发酵糖源，增加酵母的发酵效率。
同时，大麦芽酶还能够降解含有麦芽糖醇的多糖，减少产生的副产物，提高酿酒的品质和口感。
此外，大麦芽酶还被应用于其他工业酿酒过程中。
例如，在果酒生产中，它能够帮助糖化果汁中的果糖和葡萄糖，促进酵母的发酵和产生酒精。
在米酒生产中，大麦芽酶能够分解米中的淀粉，转化为可发酵的糖源，提高发酵效率和产酒量。
在葡萄酒生产中，大麦芽酶可以提高果皮萃取的效果，增加香气和口感的复杂性。
目前，大麦芽酶在工业酿酒中的应用仍在不断发展和完善中。
研究人员不仅致力于寻找更高效的大麦芽酶的提取方法和纯化技术，还在探索酶的改良和突变来提高酿酒效果。
此外，还有越来越多的研究关注大麦芽酶与其他酶类的协同作用，以获得更好的酿酒效果和产品品质。
未来，大麦芽酶在工业酿酒中的应用前景仍然广阔。
随着人们对酿酒品质的要求越来越高，对大麦芽酶的研究和应用也将进一步深入。
a-淀粉酶概述及应用
面包等焙烤食品储存一定时间后逐渐变干变硬，易碎，风味变差，这些都是 由于面包的陈化造成的，每年由于面包老化造成巨大的损失。传统的用于抑制老 化，提高焙烤食品质地和风味的添加剂主要有化学试剂，食糖，奶粉，糖酯，卵 磷脂和抗氧化剂等，近几年，酶 制剂越来越多的作为面团改良剂和抗老化剂用在 焙烤工业中，包括α-淀粉酶、分支酶、去分支酶、β-淀粉酶和普鲁兰酶等，其 中将α-淀粉酶和普鲁兰酶联合使用可以有效的延迟焙烤食品陈化，提高产品的货 价期。但是 ，在使用α-淀粉酶时，对其加入量要求比较严格，稍微过量就会导 致面包等焙烤食品粘度的增加。因此，最近人们逐渐使用中温α-淀粉酶，由于其 最适作用温度在 50℃～70℃左右，所以其在淀粉糊化时具有活性，而在焙烤过程 中则会逐渐失活，最终在焙烤完成时活性丧失。而且，在加工过程中α-淀粉酶会 水解淀粉生成聚合度在 4～9 的糊精，这些糊精也具有抗老化性。但是，现在中温 α-淀粉酶仅能从极少的一些微生物中提取[9-10]。
4.α-淀粉酶的工业应用
α-淀粉酶是淀粉及以淀粉为材料的工业生产中最重要的一种水解酶，其最早 的商业化应用在 1984 年，作为治疗消化紊乱的药物辅助剂。现在，α-淀粉酶已 广泛应用于食品、清洁剂、啤酒酿造、酒精工业等。
4.1 在焙烤工业中的应用
各种酶制剂在食品工业中的应用已有上百年的历史，最近几十年α-淀粉酶广 泛地应用于焙烤工业中焙烤工业中使用的酶制剂有很多，如蛋白酶、脂肪酶、普 鲁兰酶、木聚糖酶、纤维素酶、糖化酶等，但没有一种酶能取代α-淀粉酶在焙烤 食品中的应用。α-淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大，纹理疏松；提高 面团的发酵速度；改善面包心的组织结构，增加内部组织的柔软度；产生良好而 稳定的面包外表色泽；提高入炉的急胀性；抗老化，改善面包心的弹性和口感； 延长面包心储存过程中的保鲜期。
酿酒发酵工程知识点总结
酿酒发酵工程知识点总结一、酿酒发酵微生物的选择在酿酒工程中，发酵微生物是至关重要的一环。
发酵微生物的种类和数量不仅影响着酿酒产品的品质和口感，还直接关系到酿酒过程中的发酵速度和发酵产物的种类。
酿酒发酵工程中常见的发酵微生物主要包括酵母菌、乳酸菌、酢酸菌等。
1. 酵母菌酵母菌是酿酒过程中最常用的发酵微生物之一。
它能够利用酿酒原料中的碳水化合物进行发酵，产生酒精和二氧化碳，从而实现酒精发酵的过程。
在酿酒过程中，常用的酵母菌主要包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、泡沫酵母（Saccharomyces pastorianus）等。
2. 乳酸菌乳酸菌是一类革兰氏阳性的革兰氏阳性细菌，它们能够将葡萄糖等碳水化合物通过乳酸发酵转化成乳酸。
乳酸是一种具有抗菌作用的有机酸，能够在酒精发酵过程中起到保护作用，还能够为酒液增添口感和香气。
因此，在一些酒类的生产中，常常会使用乳酸菌进行辅助发酵。
3. 酢酸菌酢酸菌是一种产酸的细菌，能够将酒精氧化成乙醇和醋酸。
在酿酒过程中，酢酸菌通常会在酒液中进行醋酸发酵，从而产生醋，丰富酒类产品的口感和香气。
二、酿酒原料的加工酿酒工程的第一步是选择合适的酿酒原料，并且对原料进行合理的加工处理。
酿酒原料的种类繁多，包括谷物、水果、蔬菜等。
不同种类的酿酒原料在酿酒过程中所起的作用也有所不同。
1. 谷物谷物是酿酒中常用的原料之一，包括小麦、大麦、玉米、稻米等。
谷物中所含的淀粉是酵母菌进行发酵所需的主要碳源。
在酿酒过程中，谷物需要经过破碎、粉碎、糖化等工序，将其中的淀粉转化成可被发酵微生物利用的葡萄糖和麦芽糖。
2. 水果水果类原料包括苹果、梨、葡萄、樱桃等。
水果中的果糖和葡萄糖是酵母菌进行发酵所需的主要碳源。
在酿酒过程中，水果需要先进行榨汁，然后通过浸渍、糖化等工序，将果糖和葡萄糖转化成可被发酵微生物利用的碳水化合物。
3. 蔬菜蔬菜类原料包括白菜、辣椒、豆类等。
蔬菜中所含的淀粉、蛋白质、脂肪等成分是酵母菌进行发酵所需的主要营养物质。
黑曲霉糖化酶基因克隆及在酿酒酵母中的表达
（ 湖 南 农 业 大 学 生 物科 学技 术 学 院 ， 湖南 长沙 ４ １ ０ １ ２ ８ ）
摘要： 为 了 以酿 酒 酵母 ￥ ７ ８为 宿 主 菌 异 源 高 效 表 达 糖 化 酶 基 因 ， 进 一步 扩大糖 化酶 基因在 工业 生产上 的应用 。
（ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｂ ｉ ｏ ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ Ｂ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｈ ｕ ｎ ａ ｎ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｃ ｈ ａ ｎ ｇ ｓ ｈ ａ ４ １ ０ １ ２ ８ ）
● Ｃ Ｔ ●
Ｉ Ｉ Ｂ Ｒ Ｉ ＣＵ Ｌ Ｔ Ｕ Ｒ Ｉ Ｉ Ｅ 华 北 农 学 报 ・ ２ ０１ ７， ３ ２（ ６）： ｌ ２ １ 一 ｌ ２ ５
Ｂ Ｏ Ｒ Ｅ Ｉ ＫＩ － ｜ Ｉ Ｈ Ｉ ％
黑 曲霉 糖 化 酶 基 因克 隆及 在 酿 酒 酵 母 中 的表 达
￥ ７ ８中成 功 表 达 并 能 有 效 分 泌 到 细胞 外 。
关键词 ： 黑曲霉 ； 糖化 酶 ； 酿酒酵母 ； 异 源 表 达
中 图分 类 号 ： Ｑ ７ ８ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ０— ７ ０ ９ １ （ ２ ０ １ ７ ） Ｏ ６— ０ １ ２ ｌ一 ０ ５
运用 Ｒ Ｔ ． Ｐ Ｃ Ｒ法 从 黑 曲霉 中 克 隆 得 到 糖 化 酶 基 因 （ ｇ ｌ ａ Ａ） ｃ Ｄ Ｎ Ａ， 去 除 其 信 号 肽 编 码 区 后 的 序 列 重 组 到 酵 母 表 达 载 体 ｐ Ｖ Ｔ １ ０ ２ Ｕ ／ ｃ ｔ Ａ Ｄ Ｈ １强 启 动 子 下 游 ， 并 与 ｄ因 子 分 泌 肽 信 号 序 列 融 合 。用 Ｐ Ｅ Ｇ ／ Ｌ ｉ Ａ ｃ法 将 构 建 的重 组 表 达 载 体 转 入 酿பைடு நூலகம் 酒酵母 ￥ ７ ８菌株 ， 筛 选 出 的转 化 菌 点 种 到 可 溶 性 淀 粉 平 板 上 培 养 ， 用 碘 染 法 鉴 定 重 组 基 因 的 表 达 情 况 。鉴 定 出 了 典
酿酒工业常用的酶制剂
酿酒工业常用的酶制剂酿酒工业常用酶制剂有糖化酶、β—淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、酯化酶等。
酿酒中的α-淀粉酶（淀粉—1,4糊精酶）主要来源于细菌和霉菌，特别是枯草杆菌和曲霉。
我国工业生产的α-淀粉酶制剂就是用枯草杆菌BF7658。
对直链淀粉的分解率可达100%，对支链淀粉只能达93~94%。
α-淀粉酶怕酸不怕热，作用温度可达90~100℃。
β-淀粉酶（淀粉—1,4—麦芽糖苷酶）对支链淀粉只能分解54%，怕热不怕酸，作用温度70℃左右。
β-淀粉酶存在于植物、微生物中，特别是大麦中最多，小麦、甘薯和大豆中均有。
近年来，发现在不少微生物中，如芽孢杆菌、假单孢菌、链霉菌等均能产生β-淀粉酶，而且有的菌种产量较高。
葡萄糖淀粉酶（淀粉—1,4—葡萄糖苷酶）主要来源于霉菌，如黑曲霉、红曲霉、根霉、拟内孢霉等，酶的活力均较高，各类菌均有特点，在酿酒工业中常用和常见的菌一般都是黑曲霉和根霉。
目前国内生产的糖化酶制剂主要用黑曲霉生产，酶活力较高。
异淀粉酶（淀粉—1,6—葡萄糖苷酶）主要来源于微生物和植物，如杆菌、球菌、假单孢菌、酵母菌以及放线菌均能产生。
在生产中可以将异淀粉酶与其他淀粉酶类协同作用，能提高分解能力，增加产率。
转移葡萄糖苷酶主要来源于黑曲霉，根霉和红曲霉不产转移葡萄糖苷酶，但糖化酶产量没有黑曲霉高，所以选育不产转移葡萄糖苷酶的黑曲霉来生产糖化酶是很重要的。
纤维素酶在微生物、动物、植物中均有存在，特别在多种微生物中都有存在，如霉菌、放线菌、细菌中均能产生，但以木霉的产酶能力较强。
在酿酒过程中如能利用一定量的纤维素酶，它能使原料中含有一定纤维素的谷类、薯类、麸皮、农副产品、野生植物及填充料等充分利用，增加可发酵性糖，提高出酒率。
果胶酶不生成甲醇，它使果胶的半乳糖醛酸的链加水分解生成半乳糖醛酸。
在果汁澄清和蔬菜软化中都有应用，其作用给糖化创造了有利条件。
果胶酶广泛来源于微生物、植物，如霉菌、酵母菌、细菌均有产生，特别是霉菌的产量较多。
糖化酶及糖化酶基因在酿酒酵母中表达的研究进展
ｒ ｇ ｓｉ ｈ ｅｍａ ｔ ｇｔｗ ｒｏｄ ｒ ， ｋｎ ｏ ｄ ｕ ｅ ｏ ａ ｅ ｓ ｖｎ ｈ ｅａ ｅ ， ｒａ ｇｎ ｈ ｅｅ ｕ ｐ ｎ ｉ ｔｎ ｉｅｙ ａ ｄ ｐ ｖｄ ｎ ｈ ｅａ ｔ ｎ ａ ｅ ｎｔ ｌ ｉ ｏ ｅ ｒ ｅ ｙ ｍａ ｉ ｇｇ ｏ ｓ ｆ ｐ ｃ ， ａ ｉ ｇｔ ｒ ａ ａｒ ｉ ｇｔ ｑ ｉ ｍｅ ｔ ｎ ｅ ｓｖ ｌ ， ｎ ｌ ｓ ｎ ｎ ｒ ｉ ｉｇｔ ｕｏ ｏ ｍａｉ ｏ ｔ ， ａ ｄ ｔ ｃ ｎ ｃ Ｄ ｒ ｔ ｎ ｃ ｎ ｅ ｉｎ ｙ ｈ ｅ ｆ ｗ ｄ ｓｇ ｆ ｔｗｅ ｙ ｔ ｍ ｏｎ ｉ ｅ ｔ ｅ ｐ ｎ ｉｌ ｆ ｂ ｌｙ ｇ ｏ ｔ ， ｔ ｃ ｎ ｒ １ｎ ｅ ｈ ｉ ｏ ｅ ａ ｉ ｏ ｖ ｎ ｅ ｔ ．Ｔ ｏ ｅ ｉｎ ｏ ｏ ｒ ｓ ｓｅ ｃ ｉ ｃｄ ｓ ｗｉ ｔ ｒ ｃｐ ｅ ｏ ａ ｅ ｒ ｗ ｈ ｃ ￣ ｌ ａ ０ ｌ ｌ ｈ ｈ ｉ ｒ ｍｅａ ｏｉｍ ． ｅｍ／ａ ｏ ． ｅｅ ｕｐ ｎ ｃ ｅ ｋ ｓｔ ｅｔｃ ｎ ｌｇｃ ｔｇ ｓｂ ｉｉ ｅ ｒ ｃ ｕ ａｅｙ ａ ｄ ｅ ｓ ｒ ｓｔ ｅｐ ｃ ｄ ｒ ｔｂ ｌ ｓ ｍｄ ｇ ｒ ｎ ｔ ｎ Ｔ ｑ ｉ ｍｅ ｔ ｈ ｍｅ ｍａ ｅ ｈ ｏｏ ｉａ ｓ ｅ ｅｄ ｖｄ ｄ ｍｏ ｅａ ｃ ｒ ｔｌ， ｉ ｈ ｓ ｈ ｅ ｌ ａ ｎ ｎ ｕｅ ｒ ｅ ｕ ｅ ｈ ｏ
高效分泌到酿酒酵母胞 外的研究进展 ； 展望 了糖化酶今后 的研 究方 向以及应 用前景。
关键词： 糖化酶 ； 结构 ； 酒酵母 ； 因表达 酿 基
中图分类号 ： Ｓ ６ ．１ Ｓ６ ．５ １ Ｔ ２ １ ； ２ １１； ３ １Ｔ Ｑ８ 文献标识码： Ｂ
收稿 日期 ：０ ７ Ｏ — ２ ２０一３２ 作者简介 ： 刘喜风 （９ 【 ）河 南安 阳人 ， １８卜 ， 中国科 学院微 生物所博 士
酒曲的种类有哪些？
酒曲的种类有哪些？水为酒之血，曲为酒之骨。
关于酒曲的最早文字可能就是周朝著作>中的'若作酒醴，尔惟曲蘖'。
从科学原理加以分析，酒曲实际上是从发霉的谷物演变来的。
酒曲的生产技术在北魏时代的>中第一次得到全面总结，在宋代已达到极高的水平。
酒曲，在经过蒸煮的白米中，移入曲霉的分生孢子，然后保温，米粒上便会茂盛地生长出菌丝，此即酒曲。
曲霉产生的淀粉酶会糖化米里面的淀粉，因此，自古以来就有把它和麦芽同时作为原料糖，用来制造酒、甜酒和豆酱等。
用麦类代替米者称麦曲。
纵观世界各国用谷物原料酿酒的历史，可发现有两大类，一类是以谷物发芽的方式，利用谷物发芽时产生的酶将原料本身糖化成糖份，再用酵母菌将糖份转变成酒精;另一类是用发霉的谷物，制成酒曲，用酒曲中所含的酶制剂将谷物原料糖化发酵成酒。
从有文字记载以来，中国的酒绝大多数是用酒曲酿造的，而且中国的酒曲法酿酒对于周边国家，如日本、越南和泰国等都有较大的影响。
虽然中国人民与曲蘖打了几千年的交道，知道酿酒一定要加入酒曲，但一直不知道曲蘖的本质所在。
现代科学才解开其中的奥秘。
酿酒加曲，是因为酒曲上生长有大量的微生物，还有微生物所分泌的酶(淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等)，酶具有生物催化作用，可以加速将谷物中的淀粉，蛋白质等转变成糖、氨基酸。
糖分在酵母菌的酶的作用下，分解成乙醇，即酒精。
蘖也含有许多这样的酶，具有糖化作用。
可以将蘖本身中的淀粉转变成糖分，在酵母菌的作用下再转变成乙醇。
同时，酒曲本身含有淀粉和蛋白质等，也是酿酒原料。
酒曲酿酒是中国酿酒的精华所在。
酒曲中所生长的微生物主要是霉菌。
对霉菌的利用是中国人的一大发明创造。
日本有位著名的微生物学家坂口谨一郎教授，认为这甚至可与中国古代的四大发明相媲美，这显然是从生物工程技术在当今科学技术的重要地位推断出来的。
随着时代的发展，中国古代人民所创立的方法将日益显示其重要的作用。
一、大曲分中温曲、高温曲和超高温曲。
基因工程技术在啤酒领域中的应用
基因工程技术在啤酒领域中的应用摘要随着啤酒工业基础研究工作的深入发展，基因工程技术将在酿造领域得到广泛应用。
主要包括基因工程改造（针对酒花、大麦以及酵母）和有害菌的检测与鉴定。
本论文综合国内外的研究成果，介绍了基因工程技术在啤酒领域中的应用，探讨了基因工程技术在这一领域的发展前景。
关键词：基因工程啤酒酵母育种PCR技术有害菌检测一、基因工程概述基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是依据人们的科研或生产需要，以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质（DNA片段），在体外切割，连接形成重组DNA分子并与载体的遗传物质重新组合，然后导入活细胞，进行复制和表达，从而改变生物原有的遗传特性、获得生产出符合人类需要的产品或生物新品种。
随着啤酒工业基础研究工作的深入发展，基因工程技术将在酿造领域得到广泛应用。
主要包括基因工程改造（针对酒花、大麦以及酵母）和有害菌的检测与鉴定。
二、利用基因工程技术改进原料质量对于啤酒行业，啤酒酿造过程中涉及的大麦、酒花均可应用此技术得到可观的经济效益。
2.1 大麦育种基因工程技术利用基因工程技术进行大麦育种的研究方向主要有：加强糖化酶活性的表达，强化1，3- 葡聚糖酶和1，4- 葡聚糖酶的表达，提高大麦的抗病性，以及增加淀粉含量，提高产量和浸出物。
对于大麦最成功的例子是将DNA 通过粒子轰击导入未成熟的胚细胞中，部分质粒成功整合到染色体中，很大程度上，基因控制领域是彼此独立的，单一基因启动子区域可剪切连接到其他基因的编码区域，使杂交基因具有启动子的的表达特征，如作为对赤霉素的反应，α-淀粉酶的启动子传递着表达信息。
S. E. ULLRICH 等人研究工作表明，3 个量化特征基因与原料的- 葡聚糖含量有关，6个量化特征基因与麦芽- 葡聚糖含量有关，3 个量化特征基因与绿麦芽的β-葡聚糖酶活性有关，5 个量化特征基因与成品麦芽的β-葡聚糖酶活性有关。
黑曲霉糖化酶基因在酿酒酵母中的表达
糖 化 酶酶诱 导 培养 基 ： ０ １ 葡 萄糖 和 １ 淀 粉代 替活 化培 养基 中 １ ２ 葡 萄糖 ， 用 ．％ ．％ 其他 成分 不变． Ｌ Ｂ培养基 ： 白胨 １ ， 蛋 酵母 粉 ０ ５ ， Ｃ ， Ｈ ７ ０ ． Ｎａ １ １ ｐ ． ． Ｙ Ｄ培养 基 ： Ｐ １ 酵母 膏 ， 蛋 白胨 ， 葡萄 糖． ２ ２ 筛 选 培养基 ： 粉 １ ， ＮＨ ） Ｓ ０ ５ ， Ｏ４ ． ， Ｓ ０ ０ ， ａ １ ０ ０ ， 母粉 淀 ０ （ 。 Ｏ ． ％ ＫＨ Ｐ １ Ｍｇ Ｏ ． ５ Ｃ Ｃ ｚ ． １ 酵 ０ ０ ０ ， ％ 半 乳糖 作 为诱 导剂 ， 琼脂 ． ．２ ２ ２ 发 酵 培养基 ： 淀粉 １ ， ＮＨ ） Ｓ ０ ５ ， Ｏ ． ， Ｓ ０ ０ ， ａ １ ０ ０ ， ０ （ Ｏ ． ＫＨ Ｐ ０ １ Ｍｇ Ｏ ． ５ Ｃ Ｃ ｚ ． １ 酵母 粉
第 ２ ７卷第 ２期 ２１ ０ ２年 ６月 文章 编 号 ： ６ ２ — ７ （ ０ ２ ０ — ０ １ ０ １ ７ ２４ ７ ２ １ ） ２ ０ ０ — ４
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徽
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大． ７ Ｎｏ ２ １２ ． ．
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆＡｎ ｕ ｌｔｃ ｎｃＵｎｖ ｒｉ ｏ ｒ ａ ｈ ｉ ｏ Ｐｏｙｅ ｈ ｉ ｉｅｓｔ ｙ
基 酸 残 基 组 成 的 蛋 白质 ． 学性 质 分 析 显 示 该 酶 的 最 适 反 应 温 度 为 ５ 酶 Ｏ℃ ， Ｈ 为 ５ ０ 经 柱 分 离 纯 化其 发 酵 上 ｐ ．．
清 液 后 ，Ｄ － Ａ Ｓ ＳＰ ＧＥ电 泳 方 法 ， 得 它 的 分 子 量 大 约 为 ７ Ｄ， 条 带 清 晰 ． 测 ０ ｋ 且
关 键 词 ： 曲霉 ； 化 酶 ； 黑 糖 酿酒 酵 母 ； 达 表 文 献 标 识码 ： Ａ
啤酒生产糖化工艺及操作原理
啤酒生产糖化工艺及操作原理啤酒是一种由大麦、水、啤酒花和酵母发酵制成的饮料。
而在啤酒的生产过程中，糖化是一个至关重要的步骤，它负责将大麦中的淀粉分解为可发酵的糖类物质。
糖化是啤酒生产过程的第一步，大麦糖化的主要目的是将其中的淀粉转化为麦芽糖、葡萄糖等可溶性物质，为酵母的发酵提供能量和营养物质。
糖化工艺分为两个阶段：温水浸润大麦并促进淀粉糖化的称为“分离”阶段和通过氨化和脱溶酶的活化来达到转化的称为“发芽”阶段。
操作原理如下：1.温水浸润大麦：将大麦与适量的水混合，使大麦完全浸润于水中。
这样做是为了增加大麦的湿润度和可流动性，为后续糖化反应提供条件。
2.淀粉糖化：在加热的条件下，通过添加淀粉酶，将大麦中的淀粉转化为可溶性的糖类物质。
淀粉酶主要有α-淀粉酶和β-淀粉酶。
α-淀粉酶能够降解淀粉的内部α-1,4键，产生糊精和麦芽糖；而β-淀粉酶能够降解淀粉的末端α-1,4键，产生麦芽糖和麦芽糊精。
在此过程中，加热可以提高淀粉酶的催化效率，促进淀粉的糖化反应。
3.发芽：通过长时间浸泡大麦，并适时通风，使大麦发芽。
发芽过程中的麦芽含有大量的胚芽酶，这些酶能够进一步分解淀粉并产生葡萄糖。
发芽的目的是获得富含酶活性和可溶性糖类物质的麦芽。
糖化工艺的操作可以分为以下几个步骤：1.大麦的清洗和湿种：大麦先进行清洗，去除杂质和不必要的物质。
然后在适量的水下进行湿种，使大麦吸水膨胀并恢复生命活力。
2.大麦的糖化：将湿种的大麦通过加热并加入适量的淀粉酶，使淀粉逐渐分解成可溶性的糖类物质。
温度和时间是糖化反应的重要因素，不同的糖化条件可以获得不同种类的糖类物质。
3.糖液的分离和滤液：经过糖化反应后，糊状的混合物需要分离出糖液。
这可以通过过滤操作来实现，通过过滤将糟粕部分去除，留下糖浆。
4.煮沸和啤酒花的添加：糖液经过煮沸过程，除去多余的水分和杂质。
在煮沸过程中，啤酒花可以添加进去，以赋予啤酒苦味和香气。
5.冷却：煮沸后的液体需要进行快速冷却，以防止细菌污染和酵母发酵。
酿酒的物质变换与主要步骤
酿酒的物质变换与主要步骤摘要：白酒是以粮谷为主要原料，以大曲、小曲或麸曲及酒母等为糖化发酵剂，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏而制成的蒸馏酒。
本文主要阐述白酒的酿造过中的物质变化和酿造步骤。
关键词：糖化制曲糖化酶酒精发酵酵母菌典型的中国白酒生产以含淀粉生产和糖类的物质为主要原料，曲为糖化发酵剂，酿造过程中糖化和发酵同时进行，一般经过糖化发酵蒸馏后，长期储存才能成酒。
多以窖池为基础，依赖窖池糟醅和窖泥中巨大的微生物群落的功能和作用，完成生产过程。
在窖内发酵过程中，酿酒原料所含淀粉在糖化酶的催化下水解生成葡萄糖后，才能被用于微生物增值及各种代谢产物的合成。
因此，糖化酶在白酒酿造过程中扮演着重要角色。
窖池中的微生物长期处于高酸度、高酒精、和微氧的环境中，赋予微生物群落结构的复杂性和特殊性。
白酒酿造过程中，酒精发酵是生产的重要环节，酒精生产量的大小是鉴定出窖酒醅质量的主要指标，也是判断发酵是否正常的重要数据。
白酒窖池中发生的酒精生成作用，主要功能菌为酵母菌，其中以酿酒酵母出酒率最高，酵母菌属和假丝酵母次之，红曲霉等少数窖池中的霉菌也有微弱的产酒精功能。
1.白酒酿造过程中的反应物质的变化及原理物质变化①淀粉→糊精→葡萄糖→乙醇②淀粉、蛋白质、脂类等→白酒中的香型成分。
第一路线决定了白酒的出酒率，第二条决定了白酒的质量。
酿酒原料在在复杂的微生物的作用下，经过复杂的生物化学反应，产生乙醇和香味物质。
生物化学反应主要包括大分子的降解，如淀粉的降解和和蛋白质的降解；小分子物质的变化如葡萄糖的降解和丙酮酸脱羧产生CO2和乙醛，然后乙醛在乙醛又在脱氢酶的作用下从还原态的辅酶上获得两个氢原子而把乙醛还原为乙醇。
含淀粉质的谷物原料等,由于酵母本身不含糖化酶，淀粉是由许多葡萄糖分子组成，所以采用含淀粉质的谷物酿酒时,还需将淀粉糊化,使之变为糊精、低聚糖和可发酵性糖的糖化剂。
酿酒原料在蒸(煮)过程中，淀粉开始吸水膨胀，同时细胞间的物质和细胞内的物质由于吸水而膨胀开始溶解，纤维组织坚固性减弱。
酶在啤酒酿造工业中的应用
酶在啤酒酿造工业中的应用酶是生物体内产生的一类具有催化能力的物质，俗称生物催化剂。
它能加快生化反应并使反应以一定顺序转换。
啤酒酿造过程就是将淀粉、蛋白质等高分子物质，转变成含有一定酒精、二氧化碳以及低分子多肽、糊精、各种氨基酸及糖的溶液的过程。
这一过程包含很多生物化学反应。
这些生化反应几乎全部由麦芽和酵母中的各种酶类参与完成。
啤酒酿造过程实际上是产酶、用酶、灭酶的过程。
因此，酶在啤酒酿造工业中占有相当重要的地位。
1、啤酒酿造过程中涉及到的酶啤酒酿造过程实质是酶反应过程。
而酶主要来源于麦芽、酵母。
另外，一些商品酶制剂也应用于啤酒酿造过程中，为提高啤酒质量，降低酿造成本起了积极的作用。
1.1糖苷酶类1.1.1淀粉酶类淀粉酶类是糖化时淀粉分解的重要催化剂，淀粉的酶催化分解作用几乎专由两个主要酶进行的，即α－淀粉酶和β—淀粉酶，其它酶只起从属作用。
1.1.1.1 α－淀粉酶该酶水解淀粉，初始后不久就会使淀粉分子裂变成小分子糊精，从而使醪液粘度迅速下降，故又称“液化酶”。
淀粉酶作用于淀粉时，从分子内部水解α—l，4—糖苷键而生成糊精和还原糖。
又称内切淀粉酶。
α—淀粉酶作用于直链淀粉时，从分子内迅速水解α—1，4—糖苷键，将淀粉降解为低分子糊精及少量麦芽糖、葡萄糖。
然后缓慢地将低分子糊精水解为麦芽糖、葡萄糖。
而对于支链淀粉则不能水解分支点α—l，6—糖苷键。
但能越过分支点水解内部α—1，4—糖苷键。
水解产物除葡萄糖、麦芽糖外，还生成极限糊精及其它低聚糖，如异麦芽糖，异麦芽三糖等。
α—淀粉酶对淀粉作用，随着粘度下降，碘反应也由蓝变紫，再转为红、黄直至无色。
1.1.1.2 β—淀粉酶又称麦芽糖苷酶，是一种催化淀粉水解成麦芽糖的淀粉酶。
主要来源于大麦、小麦、大豆、甘薯块根等高等植物。
啤酒酿造中所需β—淀粉酶主要靠麦芽提供。
β—淀粉酶作用于淀粉时从其非还原性末端开始，依次每隔两个葡萄糖残基水解α—1，4—糖苷键，主要生成麦芽糖。
糖化酵母糖化酶基因在酿酒酵母中的克隆与表达
糖化酵母糖化酶基因在酿酒酵母中的克隆与表达郭彦言;王红蕾;左小明【摘要】[目的]使酿酒酵母高效表达糖化酵母糖化酶基因.[方法]利用PCR技术从糖化酵母中扩增出大小为2700 bp左右的带有启动子的糖化酶基因STA1.通过限制性内切酶BspDI与Acc65I双酶切,将目的基因STA1连接到穿梭质粒pRS416中构建重组质粒pRS416-sta1,转化酿酒酵母通过筛选.[结果]糖化酶活性最高为120 U/ml,酶的最适温度为60℃,最适pH为5.0,在酶催化反应2h后,酶剩余活力能达到约90％.[结论]通过基因工程手段得到高效表达糖化酶基因的酿酒酵母工程菌株.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)022【总页数】4页(P8-10,30)【关键词】酿酒酵母;糖化酶;糖化酵母;基因表达【作者】郭彦言;王红蕾;左小明【作者单位】长春工业大学化学与生命科学学院,吉林长春130012;长春工业大学化学与生命科学学院,吉林长春130012;长春工业大学化学与生命科学学院,吉林长春130012【正文语种】中文【中图分类】S188+.4;Q786Cloning and Expressing Glucoamylase Gene ofSaccharomycesdiastaticus inSaccharomycescerevisiaeGUO Yan-yan, WANG Hong-lei, ZUO Xiao-ming* (College of Chemistry and Life Science, Changchun University of Techn ology, Changchun, Jilin 130012)Key wordsSaccharomycescerevisiae; Glucoamylase;Saccharomycesdiastaticus; Gene expression酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是发酵工业的重要微生物，主要用于酒精、啤酒和面包工业[1-2]。
糖化酶在酒精发酵中的生产应用
糖化酶在酒精发酵中的生产应用作者：闫伟松来源：《科学导报·学术》2019年第19期摘; 要：通过对比两种生产用糖化酶，隆科特糖化酶优于诺维信糖化酶，以木薯为原料发酵成熟醪的残总糖比降低0.27%;以水稻为原料发酵成熟醪的残总糖降低0.15%。
通过以上对统计的数据表明，以木薯为原料发酵成熟醪中残淀粉含量比降低0.205%;以水稻为原料发酵成熟醪残淀粉含量降低0.2%。
成功筛选更加便宜的隆科特糖化酶，年可降低生产成本50万元左右。
关键词：水稻木薯糖化酶;原料多元化;燃料乙醇中图分类号：TS261.2;;;;;;;; 文献识别码：A燃料乙醇是一种可再生的生物能源，相对于化石能源燃料不会释放二氧化碳到环境中。
目前由于国际油价的断崖式下跌，产业面临着生产成本偏高的问题。
如何提高燃料乙醇的生产效率，降低生产成本，提高乙醇得率成为了新的发展方向。
糖化酶又称葡萄糖淀粉酶，学名为α-1，4-葡萄糖水解酶。
它能把淀粉从非还原性末端水解α-1，4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解α-1，6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。
同时也能水解糊精和糖原的非还原末端，释放β-D-葡萄糖。
因发酵工业中大量用作淀粉糖化剂，习惯上简称糖化酶，它能水解淀粉、糊精、糖原等碳水化合物非还原末端的a-l，4葡荀糖苷键，产生葡萄糖。
糖化酶在乙醇生产中的是其重要应用之一。
大量高淀粉含量的底物，如木薯、水稻等被应用于乙醇生产。
优化发酵工艺，缩短发酵生产周期，降低糖化酶的使用成本，对发酵酒精的工业生产具有十分重要的意义。
1糖化酶概述糖化酶学名a-1，4葡萄糖水解酶，是淀粉分解酶的一个分支。
主要作用是水解糊精及多糖中的a-1，4与a-1，6键，转化为葡萄糖。
我国糖化酶生产主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌中获得，其中黑曲霉分泌的糖化酶热稳定性和耐热性相对较高。
糖化酶的一个酶活力单位是指1ml液体酶于40℃、pH=4.6的条件下，1小时分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，单位以u/ml。
酿酒 酵母 酶
酿酒酵母酶
酿酒是一个复杂的过程，其中酵母和酶都起着重要的作用。
酵母是一种微生物，它在酿酒过程中通过发酵将糖类转化为酒精和二氧化碳。
不同种类的酵母适合酿造不同类型的酒，例如啤酒酵母、葡萄酒酵母等。
在发酵过程中，酵母会消耗糖分并产生酒精和其他副产物，这些副产物会赋予酒独特的风味和香气。
酶是一种生物催化剂，它们可以加速化学反应的进行。
在酿酒过程中，有多种酶参与其中。
例如，淀粉酶可以将淀粉分解为可发酵的糖类，这有助于酵母更好地利用原料进行发酵。
此外，还有一些酶可以参与到酒精代谢、香气形成等过程中。
酿酒师通常会根据需要选择合适的酵母和控制发酵条件，以达到理想的酒品质量。
同时，他们也会关注酶的作用，例如通过控制温度和时间来影响酶的活性，以达到所需的发酵效果。
酵母和酶在酿酒过程中相互协作，共同影响着酒的风味、口感和质量。
对它们的了解和控制是酿酒工艺中的关键环节之一。
白酒中酵母 酶制剂 标注
白酒中酵母酶制剂标注随着生活水平的提高，白酒已成为人们饮食文化的一部分。
而在白酒的生产过程中，酵母和酶制剂起着至关重要的作用。
本文将介绍白酒中酵母和酶制剂的基本知识，并对其标注中文进行详细解释。
一、白酒中的酵母白酒的生产基本上是靠酵母发酵来实现的。
酵母是一种可以产生酒精和二氧化碳的微生物，它们会在发酵的过程中将糖分转化成酒精和二氧化碳。
白酒中常见的酵母主要有以下几种：1.酿酒酵母：也称酒精酵母，是最常用的酵母，一般是以淀粉、糖分、蛋白质为营养源，在适宜的温度、pH值和营养条件下能够迅速生长繁殖。
酿酒酵母在白酒的生产中有着重要的作用，能够促进发酵，产生酒精和香味物质。
2.表面酵母：也称为酒曲菌，传统上是白酒发酵的主要酵母，能够为白酒赋予独特的风味和香气。
3.底泥酵母：亦称深层酵母，主要存在于坑池或壕沟中，在发酵的早期起着重要作用，能够提高酒精度和酸度。
二、白酒中的酶制剂除了酵母，酶制剂也是白酒发酵过程中不可或缺的一部分。
酶制剂是一种可以加速化学反应的物质，能够帮助酵母更快地将淀粉转化成糖分，从而加速发酵过程，提高酒精度和酒的品质。
在白酒的生产过程中，常见的酶制剂有以下几种：1.淀粉酶：也称为糖化酶，是将淀粉水解成糖分的关键酶制剂，能够促进糖化反应，使得酿造中的淀粉能够充分转化成糖分，为酵母提供良好的营养环境。
2.蛋白酶：在发酵过程中，酵母需要蛋白质来提供营养，并产生氨基酸，蛋白酶能够加速蛋白质的水解，使得蛋白质能够更快地转化成胺基酸。
3.醇酶：它能够加速葡萄糖和麸皮中的木质素分子的分解，从而释放出更多的营养物质，促进酵母的发酵速度。
在白酒发酵过程中，酵母和酶制剂的标注中文至关重要。
下面是一些常用的标注中文及其解释：1.酿酒酵母：也称酒精酵母或酵母菌，是用于白酒、啤酒等酒类发酵的一种微生物。
其标注中文为“酿酒用酵母”。
4.淀粉酶：也称糖化酶，是用于白酒等发酵过程中的一种酶制剂。
其标注中文为“淀粉酶”。
α淀粉酶和糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌
α淀粉酶和糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌
罗进肾;何鸣
【期刊名称】《生物工程学报》
【年(卷),期】1994(010)004
【摘要】将地衣芽孢杆菌α－淀粉酶基因及黑曲梅糖化酶ｃＤＮＡ重组进大肠杆
菌－酵母穿梭质粒，转化酿酒酵母，构建能分解淀粉的酵母工程菌，酶活力测定和酶学性质分析的结果显示：在酵母ＭＦ－α１因子及磷酸甘油酸激酶基因的启动子和终止信号的调控下，α－淀粉酶和糖化酶基因在酵母中获得高达并向胞外分泌这两种酶，构建的酵母工程菌在含１０％淀粉的培养基中６天内能水解９７％的淀粉，重组质粒能在酵母中较稳定地存在。
【总页数】7页(P299-305)
【作者】罗进肾;何鸣
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】Q81
【相关文献】
1.糖化酵母糖化酶基因在酿酒酵母中的克隆与表达 [J], 郭彦言;王红蕾;左小明
2.黑曲霉糖化酶基因克隆及在酿酒酵母中的表达 [J], 刘加爱;陈蕾;林元山;张小鹃;
邹洪彬;张学文
3.黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌 [J], 唐国敏;龚辉
4.黑曲霉糖化酶基因在酿酒酵母中的表达 [J], 钱鹏;汤斌
5.α-淀粉酶和糖化酶的表达及酿酒酵母工程菌的构建 [J], 吴晓萍;李文清;罗进贤;后茂立;林资诚
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白酒酿造有关的酶系
目前已知与白酒酿造有关的酶系，可分为两大类：一类为分解酶类，即分解原科的淀粉酶类，纤维素酶，蛋白质分解酶等；另一类为酒精发酵及其它微量成份发酵的酶系列，如磷酸化酶、脱氢酶、脱羧酶，氨基转换酶、酯酶等。
各类物质的生成都遵循着一定的代谢途径，是一个比较复杂的生物化学过程。
(一) 淀粉酶系淀粉酶主要存在于麦芽、细菌和霉菌中。
淀粉酶是水解淀粉葡萄糖苷键一类酶的总称。
1．α-淀粉酶：α-淀粉酶．习惯上又称液化型淀粉酶，它能将淀粉的α-1,4葡萄糖苷键分解，但不能作用于α-1,6葡萄糖苷键。
分解直链淀粉时，其作用产物大部分为麦芽糖（87％)及少量的葡萄糖(13％)，而作用于支链淀粉时，由于不能分解α-1，6葡萄糖苷键，其最终产物为麦芽糖(73％)、葡萄糖(19％)和异麦芽糖(8％)。
它对支链淀粉分解很不彻底，其残留物中带有α-1，6分枝的小分子糊精，称为α-界限糊精，这种糊精不能被酵母发酵成酒精，成为固体酒糟或酒精废醪中的残余淀粉。
α-淀粉酶的分解速度最初很快，可使庞大的淀粉分子迅速断裂为较小的分子，能降低蒸煮醪的粘度。
α-淀粉酶可从专门的细菌酶制剂和麸曲中制得。
α淀粉酶分解的淀粉与碘的呈色反应，很快由蓝—→紫—→红—→浅红—→无色(碘色)。
随着淀粉分子变小，粘度下降，与碘的呈色反应，依生成的糊精分子大小而异，小到一定程度后，其呈色反应出现消失点，其主要产物为少量葡萄糖，大多为麦芽糖和异麦芽糖。
多数酵母不利用异麦芽糖，在测定酒糟和废醪时，成为残余淀粉存在。
枯草杆菌的α-淀粉酶，水解淀粉的作用方式，可分为糖化型和液化型两种，耐高温可达80—90℃；曲霉、根霉的α-淀粉酶，可耐高温55—70℃；拟内孢霉、卵孢霉(Qospora)的α-淀粉酶，可耐高温50—70℃。
通常黑曲霉的α-淀粉酶，较其它霉菌更加具有耐酸性。
细菌的α-淀粉酶较耐高温，在液态白酒和酒精发酵中，多应用于浓醪发酵，在蒸煮后加入α-淀粉酶，能降低蒸煮醪的粘度。
酿酒酵母作用
酿酒酵母作用
酵母菌在无氧条件下,行厌氧代谢,把糖转化为二氧化碳和乙醇（酒精）.
详细点说.因酵母菌没有淀粉酶和糖化酶,所以酵母菌只能利用糖,不能利用淀粉等.
啤酒酿造中,大麦先发芽,产生淀粉酶和糖化酶,然后磨成粉,制成料浆,在一定温度下,在淀粉酶和糖化酶的作用下,把大麦胚乳中的淀粉转化为葡萄糖（其中含有少量麦芽糖）,叫麦芽汁.加入培养好的酵母菌,进行发酵,在无氧条件下,酵母菌就会把葡萄糖转化为二氧化碳和乙醇（酒精）.其中的苦味物质是在发酵前加入的啤酒花中带入的.
白酒和黄酒酿造中,粮食不能直接用于酿酒,与啤酒酿造一样,要先把淀粉转化为葡萄糖.过程是这样的.先用含有淀粉和蛋白质的原料（粮食、豆类）制成曲块,让霉菌（主要是曲霉、毛霉、根霉等）和酵母生长,在曲块中产生淀粉酶和糖化酶.把酿酒用的粮食蒸煮,掺入曲粉,入窖密闭发酵,其中的淀粉酶和糖化酶把粮食中的淀粉转化为葡萄糖,酵母菌再把葡萄糖转化为二氧化碳和乙醇（酒精）.同时还会产生其它一些醇、醛、酸、酯等香味物质.如果是黄酒,发酵好后过滤就行了.如果是白酒,就要把发酵好的物料装在一个密闭容器里,加热蒸馏,把酒精和香味物质蒸馏出来,放置一段时间后,再勾兑,成为白酒.
如果是葡萄酒,先把葡萄汁压榨出来,其中葡萄糖含量很高,不用酶.直接加入酵母菌,密闭发酵就行了.
其他酒也都大同小异.。
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大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌3罗进贤 李政海 李文清(中山大学生物化学系及生物工程中心,广州510275)摘要 将大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶cDNA 重组进同一大肠杆菌2酵母穿梭质粒构建含双基因的表达分泌载体pMA G 15.用原生质体转化法将pMA G 15引入酿酒酵母(S.cerevisiae GRF18),在酵母P GK 基因的启动子和转录终止信号及本身的信号序列的调控下,实现大麦α2淀粉酶和糖化酶的高效表达,99%以上的酶活力分泌至培养基中.构建的酿酒酵母菌株GRF18(pMA G 15)在含15%可溶性淀粉的培养基中,培养47h 能水解99%的淀粉,并能发酵产生酒精.关键词 大麦α2淀粉酶 黑曲霉糖化酶 酿酒酵母 表达和分泌酿酒酵母是酿酒工业、酒精和单细胞蛋白的生产菌,但由于其不具有淀粉水解酶的活力不能发酵淀粉.发酵前淀粉需先经过蒸煮、液化、糖化等工序变成葡萄糖后才能被利用.从80年代中期开始将各种来源的α2淀粉酶和糖化酶基因分别克隆进酿酒酵母,构建能分解淀粉的酵母菌株[1～5].只是由于构建菌株的酶活力不高,降解淀粉的速率较慢还不能用于生产.我们曾将地衣芽孢杆菌α2淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶G AI 的cDNA 分别或同时转入酿酒酵母获得表达和分泌[6～9],其中含α2淀粉酶和糖化酶双基因的酿酒酵母GRF18(YEpMA G 27),酶的表达和分泌水平都很高,但淀粉水解的速率仍较低.本文报道用酶学性质与黑曲霉糖化酶比较接近的大麦α2淀粉酶取代细菌α2淀粉酶,构建含大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶双基因的酿酒酵母工程菌,实现α2淀粉酶和糖化酶的高表达和分泌,获得能快速分解淀粉的酵母工程菌.1 材料和方法111 材料11111 菌株与质粒 本研究所用菌株与质粒如表1,其中pBAL 27是含大麦α2淀粉酶基因的大肠杆菌2酵母穿梭质粒,pMA G 69为含黑曲霉糖化酶G AI cDNA 的大肠杆菌2酵母穿梭质粒.11112 培养基 大肠杆菌培养和转化用LB 培养基,酵母的培养和转化使用的YPD , 1996209208收稿,1996211205收修改稿 3广东省自然科学基金资助项目中国科学 (C 辑) 第28卷 第1期SCIENCE IN CHINA (Series C ) 1998年2月YP GE ,YPSB ,YNB ,SC ,SORB ,YPS 等培养基,其配方见文献[10].表1 菌株与质粒菌株/质粒基因型来源E.coli C600F -,thi 21.leuB6,lac Y1,tonA21,Sup E44Jacob 2Monod 研究所S.cerevisiae GRF18leu2,his3,sta -,ihn-Dr.Hollenburg pBAL 27Amp r ,amy +,L EU ,2μori ,pBR322ori 广东省微生物研究所pMA G69Amp r ,GAI ,L EU 2μori ,pBR322ori 本室构建[8]pMA G15Amp r ,amy +,GAI ,L EU 2μori ,pBR322ori 本研究工作11113 主要生化试剂 限制酶EcoR Ⅰ,Hind Ⅲ,T 4DNA 连续酶购自GIBCO 2BRL 公司,低熔点琼脂糖、BSA 、A TP 等为Sigma 公司产品.葡萄糖试剂盒为广州环通生物技术公司产品.112 方法11211 质粒的检测和制备 大肠杆菌质粒的检测和制备按Sambrook 的方法[11],酵母质粒的检测按Sherman 的方法[12].11212 质粒的酶解、酶解片段的回收、D NA 分子的连接和大肠杆菌转化 参照文献[11]的方法.11213 酵母原生质体转化 按Burgers 的方法[10].11214 淀粉酶阳性菌落的检测和总酶活力测定 见文献[6].一个酶活力单位定义:p H610,60℃的条件下保温1h 产生1mg 葡萄糖的酶量.11215 培养液中剩余淀粉含量的测定及重组质粒稳定性检测 参照K im 的方法[13].11216 发酵液中酒精含量的测定 采用简易的酒精定量测定法.先配浓度体积分数为1%,3%,5%,7%及9%的酒精标准液.加3mL K 2Cr 2O 4溶液(4%K 2Cr 2O 4溶于20mol/L H 2SO 4)于6mL 刻度试管内,将刻度试管置于加有012mL 饱和K 2CO 3的50mL 比色试管中,加015mL 酒精标准液于比色管中,立即盖好盖子,摇匀,于50℃保温5h.取出后在刻度管内加入3mL 蒸馏水,摇匀,测A 560并以双蒸水代替酒精作对照.以酒精标准液浓度为横坐标,A 560为纵坐标绘制标准曲线.测定发酵液中酒精含量时,用015mL 发酵液取代酒精标准液,测定A 560值后,查标准曲线乘以稀释倍数即得发酵液中酒精含量.11217 SDS 2聚丙烯酰胺凝胶电泳 参照文献[11]的方法.2 实验结果211 含α2淀粉酶和糖化酶双基因的酵母表达载体的构建为使大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶基因在酿酒酵母中同时表达,需将这2个基因重组在同一表达载体.大麦α2淀粉酶cDNA 位于质粒pBAL7上酵母P GK 启动子和转录终止信号之间.黑曲霉糖化酶cDNA 位于质粒pMA G 69上.我们设想将pBAL7上含P GK 启动子2大麦α2淀粉酶cDNA 2P GK 转录终止信号的314kb 片段切出转移至质粒pMA G 69上构建含双基因的表达载体.如图1所示,用Hind Ⅲ酶切质粒pBAL7,低熔点琼脂糖凝胶电泳分离314kb 的含α2淀粉酶cDNA 及P GK 调控序列的片段;同时用Hind Ⅲ部分酶切质粒pMA G 69,电泳分离第1期罗进贤等:大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌51 图1 重组质粒pMA G 15的构建P ,T 分别为PGK 基因的启动子及转录终止信号,BA 为大麦α2淀粉酶基因,GA 为黑曲霉糖化酶基因1116kb 的线状质粒DNA.将314及1116kb 的片段以适当比例混合,经T 4DNA 连接酶连接后转化大肠杆菌C600,筛选Amp r 转化子,经质粒检测和酶切分析,获得α2淀粉酶cDNA 正确插入pMA G 69上合适位点的重组质粒pMA G 15.由于pMA G 69上有3个Hind Ⅲ切点,构建重组质粒时采用Hind Ⅲ部分酶切的方法,可获得酶切位点不同的1116kb pMA G 69线状DNA ,314kb 的α2淀粉酶基因可以在不同的Hind Ⅲ位点插入,用EcoR Ⅰ酶切重组质粒pMA G 15可以判断α2淀粉酶的插入位点(图2).本实验的结果表明不管从那个位点插入都不会影响葡萄糖淀粉酶基因的表达.212 大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌用原生质体转化法将211中构建的重组质粒pMA G 15转入酿酒酵母GRF18,在缺亮氨酸的SORB 再生培养基上筛选转化子,获得能在不含亮氨酸的培养基生长的酿酒酵母GRF1852 中 国 科 学 (C 辑)第28卷(pMA G 15),然后把此转化株GRF18(pMA G 15)转移至缺亮氨酸的YNB 淀粉培养基上,并以酿酒酵母GRF18(pMA G 69),GRF18(pBAL7)及受体菌GRF18作对照,在30℃培养4d 后,倒碘液于平板上,可见在GRF18(pMA G 15),GRF18(pMA G 69)及GRF18(pBAL7)菌落周围均出现淀粉水解圈,其中以GRF18(pMA G 15)最大,受体菌GRF18则不生长(图3);这一结果表明,淀粉酶已在酵母中表达并分泌至胞外.图2 重组质粒pMA G 15的酶切分析1为λcl857S7/Hind Ⅲ,2为pMA G69/EcoR Ⅰ,3为pMA G15/EcoR Ⅰ,4为pMA G69/Hind Ⅲ,5为pMA G15/Hind Ⅲ,6为pBAL7/HindⅢ图3 酿酒酵母转化子在淀粉培养基上形成的水解透明圈1为酿酒酵母GRF18(pMA G15),2为酿酒酵母GRF18(pMA G69),3为酿酒酵母GRF18(pBAL7),4为酿酒酵母GRF18为了进一步研究α2淀粉酶和糖化酶在酵母中的表达和分泌情况,按照文献[6]的方法,将上述酵母转化子接种于不含葡萄糖的YP GE 培养基中,30℃振摇60h ,离心测上清液中的总酶活,用蜗牛酶和超声波将菌体裂解后测胞内酶活力,结果如表2.表2 酿酒酵母GRF18转化子的酶活力酿酒酵母转化子胞外酶活/U ・mL -1胞内酶活/U ・mL -1总活力/U ・mL -1分泌量/%GRF180000GRF18(pMA91)0000GRF18(pBAL7)56.500.5257.0299.10GRF18(pMA G69)90.00.4590.4599.50GRF18(pMA G15)152.300.80153.1099.47表2的结果显示含α2淀粉酶和糖化酶双基因的转化子GRF18(pMA G 15)的总酶活力比含α2淀粉酶或糖化酶单基因的转化子GRF18(pBAL7)及GRF18(pMA G 69)要高,而且99%以上的酶活力都分泌至培养基中.为了证明大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶已在酿酒酵母中同时表达,把酵母转化子GRF18(pMA G 15)及GRF18(pBAL7),GRF18(pMA G 69)的培养上清液用80%饱和度的硫酸铵于4℃沉淀过夜,沉淀用20mmol/L 的磷酸缓冲液(p H6.0)溶解后透析除盐,真空干燥浓缩后,用第1期罗进贤等:大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌53 适量20mmol/L 的磷酸缓冲液溶解,走SDS 2PA GE 电泳,结果如图4.从图中可见GRF18(pBAL7)在43ku 处有1条新带而GRF18(pMA G 69)在67ku 稍大的位置上有1条多余的带(黑曲霉糖化酶的分子量为71ku ).含双基因的转化子GRF18(pMA G 15)在43ku 和71ku 的相应位置上都出现新的带.我们曾将培养上清液用硫酸铵沉淀后上DEAE 2纤维素柱层析亦发现有α2淀粉酶和糖化酶活力,前者在流出液中,后者在500mmol/L 的洗脱液中(数据未列出).以上结果显示α2淀粉酶和糖化酶已在酿酒酵母中同时获得表达和分泌.213 酿酒酵母转化子GRF18(pMAG 15)对淀粉的水解和利用为了检查酿酒酵母GRF18(pMA G 15)的水解和利用淀粉的能力,挑取其单菌落接种于含组氨酸的SC 培养基中,培养60h 后收集菌体,转接至含15%可溶性淀粉的YPS 培养基中,30℃振荡培养,定时取样,测A 510,酶活力及淀粉残余量.图5的结果显示,构建的酵母工程菌GRF18(pMA G 15)在47h 内可水解99%的淀粉,而且水解进程与酵母的生长和酶的生成是平行的.我们曾试过10%的马铃薯淀粉,发现培养50h 亦可将其中99%的淀粉水解掉.这一结果表明GRF18(pMA G 15)的淀粉水解能力比我们构建的含地衣杆菌α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶双基因的酿酒酵母GRF18(YEpMA G 27)要高得多.GRF18(YEpMA G 27)在含10%的马铃薯淀粉的YPS 培养基中需培养7d 才能水解97%的淀粉.图4 表达产物电泳分析1为标准分子量,2为GRF18(pBAL7),3为GRF18(pMA G69),4为GRF18(pMA G15)图5 酿酒酵母GRF18(pMA G 15)在YPS (含15%的可溶性淀粉)中生长、产酶及水解淀粉曲线图1为A 570,2为酶活,3为残余率214 酿酒酵母GRF18(pMAG 15)发酵淀粉产生酒精图6 酿酒酵母GRF18(pMA G 15)在YPS (含15%可溶性淀粉)中产生酒精曲线1为淀粉残余率,2为酒精含量为了考察构建的酵母工程菌能否将淀粉水解产物发酵产生酒精,将GRF18(pMA G 15)接种于含10%可溶性淀粉的YPS 培养基中,定时取样,按材料与方法中介绍的方法测定培养上清液中的酒精含量及淀粉残余量.图6是酿酒酵母GRF18(pMA G 15)水解淀粉和发酵产生酒精的进程.虽然酿酒酵母GRF18是实验室菌株不是酒精的生产菌,但从图上可以看到,构建的酵母工程菌在水解淀粉的同时还可发酵产生酒精,为构建能水解和利用淀粉生产酒精的酵母工程菌打下基础.54 中 国 科 学 (C 辑)第28卷215 重组质粒pMAG 15在酵母工程菌中的稳定性带2μ质粒的酵母转化子在无选择压力的情况下,经多代培养都会不同程度地产生质粒丢失的现象.为了检测来源于2μ的重组质粒pMA G 15在酵母转化子GRF18中的稳定性,挑取GRF18(pMA G 15)单菌落接种于YPD 液体培养基中,30℃连续培养5d 后,取样涂平板,分离单菌落,点种于缺亮氨酸的SC 选择培养基及YPD 完全培养基上,30℃培养2d.在YPD 培养基上生长而在SC 培养基上不能生长者即为丢失质粒的转化子.从表3的结果可知,重组质粒pMA G 15的丢失率为913%.表3 重组质粒pMA G 15在酿酒酵母GRF18中的稳定性转化子名称YPD 上总菌落数SC 上不长菌落数丢失率/%GRF 18(pBAL7)51624547.5GRF18(pMA G69)51614 2.7GRF18(pMA G15)516489.33 讨论本文报道将大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶基因引入酿酒酵母在P GK 启动子和转录终止信号的调控之下获得高表达;在本身信号肽的引导下,表达产物的99%分泌至胞外,构建的酿酒酵母工程菌GRF18(pMA G 15)在含15%淀粉的YPD 培养基中培养47h 将99%的淀粉水解.我们曾用地衣杆菌α2淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶基因构建表达载体转化酿酒酵母;获得的酵母工程菌GRF (YEpMA G 27)比仅含α2淀粉酶或葡萄糖淀粉酶单基因的工程菌的酶活力及淀粉水解率都高,但水解淀粉的速度慢[9].估计是由于这两种酶的性质特别是作用的温度(80℃,60℃)和p H (7,4.5)不同造成的.本文用大麦α2淀粉酶取代地衣杆菌α2淀粉酶取得良好的效果,淀粉水解时间从6d (10%淀粉)缩短至47h (15%淀粉).这与大麦α2淀粉酶的最适温度(68℃)和p H (5.2)与黑曲霉糖化酶的最适p H 和温度接近有关.在构建表达载体pMA G 15时,大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶基因的信号序列均未被除去.这2个酶都是靠本身的信号肽被引导至胞壁再分泌至胞外的.我们的工作已经证实,黑曲霉糖化酶信号肽切除位点的氨基酸残基与酵母信号肽切除位点的相同,因而能被酵母识别和加工[8].但大麦α2淀粉酶信号肽序列与酵母的不完全相同,却能高效表达和分泌,原因有待进一步研究.参 考 文 献1 Rothstain S J ,Lahners K N ,Lazarus C M ,et al.Synthesis and secretion of wheat α2amylase in S acharom vces cerevisiae .G ene ,1987,55:3532 Pretorius I S ,Laing E ,Pretorius G H J ,et al.Expression of a bacillus α2amylase gene in yeast.Current G enetics ,1988,14:13 Cole G E ,McCabe P L ,Inlow D ,et al.Stable expression of aspergillus awamori glucoamylase in distiller ’s yeast.Bio/Tech 2nology ,1988,6:417第1期罗进贤等:大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌55 56 中 国 科 学 (C 辑)第28卷4 Segoard M,Svenson B.Expression of cDNAs encoding barleyα2amylase1and2in yeast and characterization of the secreted proteins.G ene,1990,94:1735 Shibuya I,Tamura G,Shima H,et al.Construction of anα2amylase/glueoamylase fusion gene and its expression in S accha2 romyces cerevisiae.Biosc Biotech Biochem,1992,56:8846 李文清,黎 杨,罗进贤.黑曲霉葡萄糖淀粉酶cDNA在酿酒酵母中的表达.中山大学学报,1992,31:17 罗进贤,黎 杨,李文清,等.地衣杆菌α2淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达.中国科学,B辑,1993,23(10):10358 李文清,何 鸣,罗进贤.黑曲霉葡萄糖淀粉酶在酿酒酵母中的表达和分泌.中国科学,B辑,1994,24(9):9429 罗进贤,何 鸣,李文清.α2淀粉酶和糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌.生物工程学报,1994,10:29910 Burgers P M J,Percival K J.Transformation of yeast spheroplasts without cell fusion.Analytical Biochem,1987,163:391 11 Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.Molecular Cloning.New Y ork:Cold Spring Habor Laboratory Press,1989.16～56 12 Sherman F,Fink G,Hicks J B.Methods in Yeast G enetics.New Y ork:Cold Spring Habor Laboratory Press,1986.115 13 K im K,Park C S,Mattoon J R.High2efficiency,one step starch utilization by transformed Saccharomyces cells which secrete both yeast glucoamylase and mouseα2amylase.Appl Environ Microbiol,1988,54:966。